全 文 ：分子植物育种，2012年，第10卷，第6期，第655-661页
MolecularPlantBreeding,2012,Vol.10,No.6,655-661
研究报告
ResearchReport
过量表达拟南芥 NPR1基因提高小麦纹枯病的抗性
周淼平 * 杨学明 姚金保 张鹏 余桂红 马鸿翔
江苏省农业科学院生物技术所,江苏省农业生物学重点实验室,南京,210014
*通讯作者,mpzhou@hotmail.com
摘 要 拟南芥 NPR1基因是植物重要的抗病调控因子，转基因过表达该基因可以赋予植物广谱抗性。为明
确该基因在小麦抗纹枯病基因工程中的应用潜力，本研究构建了由玉米ubiquitin启动子驱动的拟南芥 NPR1
表达载体，采用基因枪介导法导入到小麦品种扬麦12号中，获得20株转基因植株。对14个外源基因纯合
株系的半定量RT-PCR和测序分析结果显示，外源拟南芥 NPR1基因已经导入转基因小麦并有不同水平的
表达，部分转基因株系拟南芥 NPR1基因发生重排；纹枯病抗性鉴定结果表明，转基因株系中拟南芥 NPR1
基因的正确表达可以减轻纹枯病菌引起的病症发展，提高转基因小麦的纹枯病抗性。
关键词 小麦,AtNPR1,遗传转化,纹枯病
Over-expression ofAtNPR1 Enhances Resistance to Wheat Sharp Eyespot
inTransgenicWheat
ZhouMiaoping* YangXueming YaoJinbao ZhangPeng YuGuihong MaHongxiang
InstituteofBiotechnology,ProvincialKeyLaboratoryofAgrobiology,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing,210014
*Correspondingauthor,mpzhou@hotmail.com
DOI:10.3969/mpb.010.000655
Abstract The ArabidopsisNPR1 gene is the important antiviral regulatory factor in plant, transgenic over-
expressionofthegenecanbeimpartedtotheplantbroadresistance.Inordertoevaluatethepotentialapplication
ofAtNPR1 gene in the genetic engineering for the resistance to wheat sharp eyespot, the expression vector of
AtNPR1 driven by maize ubiquitin promoter was constructed and introduced into wheat Yangmai12 via particle
bombardment in this study. Twenty transgenic plants were obtained by L-PPT screening and PCR analysis. The
resultofsemi-quantitativeRT-PCRandDNAsequencingof14transgenichomozygouslinesshowedthatthealien
AtNPR1 genes were integrated into wheat genome and expressed at different levels. Rearrangement ofAtNPR1
genewasobservedinsometransgeniclines.TheassessmentofresistancetoRhizoctonia cerealisindicatedthatthe
correctexpressionofAtNPR1intransgeniclinescouldreducetheseverityofwheatsharpeyespot．
Keywords Wheat,AtNPR1,Genetictransformation,Sharpeyespot
基金项目：本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08002-001)、江苏省产学研联合创新基金(BY2012208)、江苏
省科技支撑计划项目(BE2011306)、国家科技支撑项目(2011BAD35B03)和江苏省农业科技自主创新资金(CX11- 025)共同资助
植物在长期进化过程中，形成了复杂的抵御病
原菌侵染的抗病机制。抗病机制具有多种表现形式，
包括基础抗病性、病原菌诱导的抗性以及抗病基
因(Rgene)主导的抗性等。不同形式的抗病信号传导
途径既有区别，也有重叠和交叉。其中的交叉点是
植物整体抗病的重要调节因子。NPR1(nonexpressor
ofpathogenesisrelated genes1)就是抗病重要调节基
因之一，它既是SAR(systemicacquiredresistance)和
ISR (induced systemic resistance)诱导抗性信号传导
的交叉点，也是基础抗性以及部分抗病基因所决定
抗性的重要调节基因。
NPR1基因最早从拟南芥中克隆(Caoetal.,1997)，
该基因位于1号染色体，含有4个外显子和3个内含
子，编码的蛋白包含593个氨基酸，分子量约66kD。
NPR1在植株体内组成性表达。通常情况下，NPR1单
体在细胞质中通过分子间二硫键形成寡聚体而存在。
在SAR反应中，水杨酸的累积增加了细胞内的还原
势，从而破坏了 NPR1寡聚体中的二硫键，寡聚体解
离为单体，单体在C末端的核定位序列引导下，在细
胞核内积累，与TGA等转录因子发生互作，激活下游
防卫基因表达而产生抗性(张红志和蔡新忠,2005)。
目前，烟草(Liu et al., 2002)、水稻(Chern et al.,
2005)、棉花(王旭静等,2006)、中间偃麦草(唐益苗等,
2007)、苹果(Malnoyetal.,2007)、梨(Cheetal.,2008)、
香蕉(Endahetal.,2008)、大豆(Sandhuetal.,2009)、甘
薯(陈观水等,2009)、葡萄(Henanffetal.,2009)、可可
树(Shietal.,2010)等植物中的 NPR1 基因已经被克
隆，表明 NPR1介导的抗性途径可能是多种植物共同
保守的途径。研究发现，作物中过量表达 NPR1基因
可以提高其对病害的抗性。例如过量表达 NPR1的拟
南芥对细菌 Pseudomonas syringae、真菌 Peronospora
parasitica和 Erysiphe cichoracearum的抗性增加(Cao
etal.,1998;Friedrichetal.,2001)；转基因番茄中过量
表达拟南芥 AtNPR1表现出对病原菌的广谱抗性(Lin
etal.,2004)；转基因苹果过量表达苹果 MpNPR1对病
原菌 Erwinia amylovora、Venturia inaequalis和 Gymno-
sporangium juniperi-virginianae的抗性增加；单子叶
植物中过量表达 AtNPR1，同样也会提高植物抵御
病原菌的能力，在水稻中过量表达 AtNPR1和水稻
OsNPR1 基因都增加了对白叶枯病菌 Xanthomonas
oryzae 的抗性(Chern et al., 2001; 2005; Yuan et al.,
2007)；在小麦中过量表达 AtNPR1增加了对小麦赤
霉病菌 Fusarium graminearum的抵御能力(Makandar
etal.,2006)；表明单子叶植物与双子叶植物可能拥有
相同的 NPR1抗病调控途径。
小麦纹枯病(Wheatsharpeyespot)是中国长江流
域中下游麦区和黄淮麦区的主要病害，禾谷丝核菌
(Rhizoctonia cerealis Vander hoeven)和立枯丝核菌
(Rhizoctonia solani Kuhn)是其主要病原菌，每年造成
严重的产量损失，选育和使用抗纹枯病小麦新品种
是防治该病害最经济和有效的途径。迄今为止，尚未
发现对该病害免疫的小麦品种(系)，高抗的材料也较
匮乏。研究发现，小麦纹枯病抗性是数量性状，主基
因效应不大，并且存在基因互作，给常规育种带来诸
多困难(蔡士宾等,2006)。转基因技术由于周期短、针
对性强等优点，已经成为小麦抗纹枯病育种的新手
段(Chenetal.,2008)。
本研究构建了拟南芥 AtNPR1基因的单子叶作
物组成型高表达载体，并通过基因枪介导将其导入小
麦扬麦12号，进一步分析了 AtNPR1基因在转基因
小麦后代中的表达以及对小麦纹枯病的抗性，以评估
转基因小麦中 AtNPR1基因能否正常表达以及该基
因在基因工程培育抗纹枯病小麦中的应用潜力。
1结果与分析
1.1 AtNPR1基因的克隆和载体构建
根据 AtNPR1 基因 DNA序列设计引物，采用
PCR方法从拟南芥基因组扩增出2 125 bp的 DNA
片段，连接到pGEM-T载体，经测序和Blast验证，扩
增片段确实含有 AtNPR1基因，该基因全长2079bp，
包含4个外显子和3个内含子，内含子的大小分别
为79bp(位于562-640)、108bp(位于1377-1484)和
110bp(位于1689-1798)。采用 SmaⅠ和 SacⅠ双酶
切获得 AtNPR1基因，替代pACH25载体(Christensen
andQuail,1996)中的 gus基因，即获得Ubiquitin启动
子驱动的 AtNPR1基因表达载体pAC-NPR1(图1)。
1.2小麦的遗传转化与分子检测
共转化6300枚小麦幼胚，通过愈伤诱导、分化
以及L-PPT筛选，获得抗L-PPT再生植株126株，对
其T1后代喷施Basta除草剂，发现27株的后代出现
抗感分离，初步定为阳性植株。对这27株进行PCR
检测发现，20株含有 AtNPR1 基因(图 2)，其余 7株
未能扩增出相应片段，可能转基因植株只插入了 bar
基因片段或 AtNPR1基因的片段。
1.3转基因阳性植株的表达分析
采用Basta除草剂喷涂和PCR检测相结合的方
法筛选 AtNPR1基因纯合的转基因株系，并对这些转
基因株系的农艺性状同时进行鉴定筛选。从转基因
后代株系中选取与受体亲本扬麦12号农艺性相近
图1质粒pAC-NPR1构造
Figure1ConstructofplasmidpAC-NPR1
过量表达拟南芥 NPR1基因提高小麦纹枯病的抗性
Over-expressionofNPR1EnhancesResistancetoWheatSharpEyespotinTransgenicWheat656
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
的14个转基因株系分析 AtNPR1基因的表达以及对
小麦纹枯病的抗性。
采用18S rRNA作为内参基因，对转基因对照扬
麦 12和 14个转基因株系 AtNPR1 基因的半定量
RT-PCR分析结果发现，R3、R4、R7、R8、R9、R10和
R13等 7个株系扩增出 635 bp的亮带；R2、R14和
R15等 3个株系扩增出 853 bp和 1165 bp两条带；
R6和R11等2个株系只有微量表达，R5和R12等
2个株系没有扩增条带(图3)。将扩增的各个DNA条
带回收、测序和Blast分析结果显示，635bpDNA条
带为内含子正常剪切和表达的 AtNPR1 基因片段；
图4转基因植株S1-1中的 AtNPR1基因片段重排
注:箭头表示片段方向;方框表示未知序列;上排数字表示重排基因片段的位置;下排数字为原基因中片段位置
Figure4TherearrangementofAtNPR1 fragmentsintransgenicplantS1-1
Note:The arrows indicate the direction offragments; The boxes indicate unknown DNA sequences; The number ofup line indicates
thelocationoffragmentsintherearrangedgene;Thenumberoflowerlineindicatesthelocationoffragmentsintheoriginalgene
图3转基因株系 AtNPR1基因的半定量RT-PCR分析
注:M:100bpDNAladdermarker;R1:扬麦12号;R2-R15转基因株系;R2,R14和R15:来自S1-1;R3和R4来自S44-1;R6和
R11来自S89-1;其余来之不同转基因植株
Figure3Semi-quantitativeRT-PCRanalysisofAtNPR1g neintr sgen clines
Note: M: 100 bp DNA ladder marker; R1: Yangmai12; R2-R15: Transgenic lines; R2, R14 and R15 from S1-1; R3 and R4 from
S44-1;R6andR11fromS89- ;Theothertransgeniclinesderivedfromdifferenttransgenicplant
图2部分T0代转基因植株 AtNPR1基因的PCR检测
注:M:DL2000marker;1:pAC-NPR1;2:扬麦12号;3~17:转基因植株
Figure2 PCRanalysisofAtNPR1geneinpartofT0transgenicplant
Note:M:DL2000marker;1:pAC-NPR1;2:Yangmai12;3~17:Transgenicplants
853bp条带为108bp和110 bp的 2个内含子未剪
切的表达片段；1165bp条带为如图4所示插入基因
发生复杂片段重排的表达片段。
正常表达(切除内含子)的7个株系中，R9的表
达最强，其次为R3、R4和R13，R7、R8和R10的表
达相对较弱。
1.4转基因株系的纹枯病抗性鉴定
纹枯病抗性鉴定结果表明，R5和 R12等 2个
AtNPR1 基因未表达的转基因株系以及 R6和 R11
微量表达的转基因株系的纹枯病抗性与未转基因受
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过量表达拟南芥 NPR1基因提高小麦纹枯病的抗性
Over-expressionofNPR1EnhancesResistancetoWheatSharpEyespotinTransgenicWheat
体对照扬麦12号差异不显著；R2、R14和 R15等 3
个 AtNPR1基因内含子未切除的转基因株系的纹枯
病抗性较对照也未有显著提高；正常表达的R3、R4、
R7、R8、R9、R10和R13等7个株系的纹枯病抗性较
扬麦12号提高明显，平均病级和平均病情指数均显
著低于未转基因受体对照，纹枯病病级和病情指数
比对照平均分别降低24.2%和25.0%，以R8的降低
幅度最大，抗性提高最明显(图5)，但 AtNPR1基因正
常表达转基因株系的病级和病情指数的降低程度与
该基因的表达强度没有明显的相关性(表1)。
2讨论
AtNPR1基因是重要的抗病调节基因，不仅在拟
南芥，在其他植物中过量表达都可以提高植物对多种
病害包括真菌病害侵袭的抵抗能力。本研究将玉米
高表达ubiquitin启动子驱动的 AtNPR1基因导入普
通小麦，并获得纹枯病抗性显著提高的转基因小麦
株系，进一步验证了 AtNPR1基因在植物抗病反应中
的重要作用。研究也发现，在 AtNPR1基因正常表达
的株系中，其纹枯病抗性与植株中 AtNPR1基因表达
强度相关不明显，这与以转 Rs-AFP2等抗病下游基
因以及抗真菌蛋白基因为目的基因的转基因作用方
式不同，Rs-AFP2等这类基因的表达产物直接作用于
病原真菌，因而浓度越高，作用越强(路妍等, 2009)，
而 AtNPR1基因为调节基因，下游抗病基因的表达只
需一定量的 AtNPR1基因表达即可激活，AtNPR1基
因过量超表达，对提高下游防卫基因的表达帮助不
大，Friedrich等(2001)在拟南芥中过表达 AtNPR1基
因也发现类似的研究结果。
目的基因沉默现象是转基因研究中常见的现象，
主要为同源依赖性沉默(Homology-dependent gene
silencing)和位置依赖性基因沉默(Postion-dependent
genesilencing)，前者由同源或互补核甘酸序列间相
互作用产生，多为转基因出现多拷贝或与内源基因
相互作用而诱发的基因沉默；后者则反映转基因宿
主的后成状态或染色体特异区段对外源DNA入侵
忍耐性的强弱(Stametal.,1997)。本研究也发现2个
转基因株系虽然可以检测到 AtNPR1基因的存在，但
未检测到该基因的表达，由于尚未有Southern杂交
的结果，目前还很难判定基因沉默是由多拷贝插入
引起还是由于插入了小麦异染色质等部位引起。
真核生物的基因大多含有内含子，基因表达时
首先形成前体RNA，再经内含子的剪切形成成熟的
mRNA，以进行下一步的翻译和调控。内含子剪切识
别位点的强弱、内含子的长度、相邻外显子的序列以
及前体RNA的二级结构等都会影响内含子的正确
剪切，特别是识别位点的突变极易造成内含子的剪切
错误(陈县明,2010)。本研究由转基因植株S1-1形成
的纯合后代株系中 AtNPR1基因所含内含子均不能
切除，测序结果发现，RT-PCR扩增的 853 bp片段
中，两个内含子的识别位点都没有发生突变，表明内
含子未剪切不是由识别位点突变引起，RT-PCR除扩
图5转基因小麦R8株系的纹枯病抗性
注:A:扬麦12号品种;B:R8转基因株系
Figure5 ResistanceoftransgeniclineR8toSharpeyespot
Note:A:Yangmai12;B:R8transgenicline
注:数据后不同字母表示相同受体品种的不同株系间平均病级
或病情指数有显著差异(P<0.05)
Note:Differentlettersafteraveragediseasegradeordiseaseindex
indicate significant differences among transgenic lines derived
fromthesamerecipientparent(P<0.05)
株系
Lines
R12
R2
R5
扬麦12号
Yangmai12
R11
R6
R15
R14
R10
R4
R7
R3
R13
R9
R8
平均病级
Averagediseasegrade
2.4a
2.4ab
2.4ab
2.3ab
2.3ab
2.3ab
2.1b
2.1b
1.9c
1.8c
1.8c
1.7c
1.7c
1.7c
1.6c
平均病情指数
Averagediseaseindex
48.7a
48.0ab
47.3ab
46.0ab
46.0ab
45.3ab
42.7bc
42.7bc
37.4cd
35.4d
35.3d
34.0d
34.0d
33.4d
32.0d
表1转 AtNPR1基因株系的纹枯病抗性
Table1 TheresistanceofAtNPR1 tr sgeniclinestowheatsharp
eyespot
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
增出853bp片段，还有表达量稍低1165bp片段出
现，测序结果显示该片段是基因重排的结果，在重排
的基因中，位于 AtNPR1基因的562~640bp和1377~
1484bp间的内含子均未出现在表达序列中，原位于
1689~1798bp的内含子只有1777~1789bp出现在
重排基因中，失去了内含子识别的5ss(splicesite)序
列，推测可能是该重排基因的表达干扰了 AtNPR1基
因的正常剪切，未能形成有功能的表达产物，转基因
株系的表型—纹枯病抗性未有显著提高。
3材料与方法
3.1植物材料
拟南芥为哥伦比亚生态型，为本实验室保存。江
苏里下河地区农科所小麦室提供扬麦12号转基因受
体品种，开花后12~14d的小麦幼胚用于转化研究。
3.2 AtNPR1基因的克隆及载体构建
采用CTAB法提取拟南芥叶片DNA。根据 At-
NPR1基因DNA序列(GenBankaccessionno.EF470-
723)设计 PCR扩增引物对 AtNPR1-F：5-acccggg-
CTGTTGATGGACACCACCATTGATGG-3(下画线
为引入的 SmaⅠ酶切位点)和AtNPR1-：5-agagctcG-
CAAAAATTACACTAAGAGGCAAG-3 (下画线为
引入的 SacⅠ酶切位点)，以提取的叶片DNA为模
板，采用TaKaRaLATaq酶扩增 AtNPR1基因，回收
2125bp的扩增片段，连接到pGEM-T载体(Promega)，
产生pGEM-T-NPR1质粒，生工生物工程(上海)有限
公司测序，测序结果进行Blast验证。
采用限制性内切酶 SmaⅠ和 SacⅠ双酶切质粒
pGEM-T-NPR1，获得 AtNPR1基因，将该基因替换质
粒pACH25(ChristensenandQuail,1996)中的 SmaⅠ和
SacⅠ位点间的 gus基因即获得表达载体pAC-NPR1，
其中玉米Ubiquitin组成型高表达启动子控制 AtNPR1
基因的表达，bar基因为筛选标记基因，该基因抗除
草剂L-PPT(L-phosphinothricin)(图1)。
3.3小麦转基因植株的获得
小麦转化过程中，质粒提取和包裹金粉以及基
因枪轰击的参数按周淼平等(2008)文献略作修改。
基因枪轰击前后用0.4 mol/L山梨醇高渗处理幼胚
16 h，轰击后，在未加选择压的愈伤诱导培养基(MS
基本培养基添加2 mg/L2,4-D)暗培4 d后，转入添
加3mg/LL-PPT愈伤诱导培养基诱导培养21 d，抗
性愈伤然后转入分化培养基(MS基本培养基添加
1mg/LKT和1mg/LNAA以及3mg/LL-PPT)分化
42d，再生抗L-PPT幼苗转入生根培养基(1/2MS添加
3mg/LL-PPT)，待幼苗长至6~8cm长时转移至盆钵，
取叶片样品提取DNA用于分子检测，套袋自交结实收
获T0代种子。
T0代种子播于72孔塑料穴盆中，萌发产生T1代
植株，于2~3叶时喷施含100mg/LL-PPT有效成分的
Basta除草剂溶液继续筛选，根据T1代植株抗Basta的
分离结果推断T0代植株是否为转基因阳性植株。
3.4转基因小麦 AtNPR1基因的分子检测
采用CTAB法抽提抗Basta植株的叶片DNA，
进行 AtNPR1基因PCR检测，上游引物(NPR1-F1)：
5-GAAGGTAGAACCGCACTC-3；下游引物(NPR1-
R1)：5-GTCGAATCTGTCAGGGAC-3，预期扩增片
段为853bp，含108bp和110bp的2个内含子。PCR
的总体积为20μL，含1×Buffer、1.5mmol/LMgCl2、
0.2mmol/LdNTPs、0.5μmol/L引物、50ng模板DNA、
1 UTaq 酶(TaKaRa)。PCR条件为 95℃先预变性
3 min；然后94℃ 30s，55℃45s，72℃45s，扩增35个
循环；然后72℃延伸7min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检
测分析扩增片段。
3.5转基因小麦 AtNPR1基因的表达分析
用SVTotalRNAIsolationSystem试剂盒(Prome-
ga)提取 T5代转基因植株叶片总 RNA，按照 Prime-
Script RT-PCR试剂盒(TaKaRa)说明书合成 cDNA
并进行半定量RT-PCR分析，AtNPR1基因扩增引物
与分子检测相同，正常表达(切除内含子)的预期扩增
片段为635bp。采用18SrRNA基因作为内参基因
(18S-QF:5-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3;18S-
QR:5-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3)。PCR的
总体积为25μL，含1×BufferⅡ、0.4mmol/LdNTPs、
0.6μmol/L引物、2μLcDNA模板、1.25UExTaqHS
酶(TaKaRa)。PCR程序为95℃先预变性3min；然后
94℃30s，55℃30s，72℃45s，扩增30个循环；然后
72℃延伸7min。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测分析扩增
片段。部分扩增产物的测序和验证同3.2。
3.6转基因小麦的纹枯病抗性鉴定
采用病麦粒接种法鉴定转基因小麦的纹枯病抗
性。拔节期时将带有禾谷丝核菌 R. cerealisR0301菌
丝的病麦粒均匀播于转基因小麦植株基部，弥雾保
湿7d。小麦乳熟期时调查纹枯病发病情况，每个转基因
株系随机调查15个发病茎秆，重复2次，病级调查
659
按1~5级标准，1级：叶鞘有典型病斑，病菌不侵入茎
杆；2级：病菌侵入茎秆，但病斑宽度不超过茎秆周长
的1/2；3级：病斑宽度在1/2~3/4茎秆周长之间；4级：
病斑宽度占茎秆周长的3/4以上；5级：枯孕穗或枯
白穗。分别计算各转基因株系平均病级和平均病情指
数。平均病情指数={(1×χ1+2×χ2+3×χ3+4×χ4+5×χ5)/
[(χ1+χ2+χ3+χ4+χ5)×5]}×100，式中：χ1,χ2,…，χ5分
别代表1,2,……5级的茎秆数。采用SAS9.0软件
进行方差分析。
作者贡献
周淼平、杨学明、张鹏和余桂红是本研究的实验
设计和实验研究的执行人；周淼平是项目的构思者
及负责人，完成数据分析和论文初稿的写作；姚金保
和马鸿翔指导实验设计和论文修改。全体作者都阅
读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项
(2011ZX08002-001)、江苏省产学研联合创新基金
(BY2012208)、江苏省科技支撑计划项目(BE20113-
06)、国家科技支撑项目(2011BAD35B03)和江苏省农
业科技自主创新资金(CX11- 025)共同资助。感谢江
苏省里下河农科所小麦室提供扬麦12号小麦种子、
江苏省农科院植保所陈怀谷研究员提供禾谷丝核
菌R0301。
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