全 文 ：0 引 言
在真核细胞的生长和发育中，蛋白质的可逆磷
酸化修饰起着很重要的调节作用。植物类囊体膜蛋
白发生磷酸化作用，参与了光合作用的调节[1]。最
近研究发现拟南芥类囊体结合的5种蛋白激酶参与
了 PSⅡ复合体的核心组分（D1，D2，CP43和
PsbH蛋白）和外周捕光蛋白（LHCⅡ）的磷酸化：
类囊体膜结合的激酶家族 （TAK1，TAK2和
TAK3） [2,3]和 2种丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶
（STN7，STN8）[4,5]。其中 STN7蛋白激酶参与了
LHCⅡ的磷酸化和状态转换过程[4]，而STN8蛋白
激酶参与了 D1、D2、CP43和 PsbH蛋白的磷酸
化[5]。目前对这两个蛋白激酶的催化作用机制和空
间结构尚不清楚，为了解STN7和STN8蛋白激酶
的作用机制以及底物蛋白的不同，我们借助生物信
息学方法构建了拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的
种系发生树，并对 STN7和 STN8进行了三维建
模，分析了两者序列和结构上的异同，并在结构预
测的基础上，设计出多肽抗体，免疫家兔，制备得
到特异性抗血清。构建的三维结构可用于阐明
STN7和STN8激酶作用底物蛋白的不同和探讨其
结构与功能的关系，并为突变体的设计奠定了基
础。得到的特异性抗血清可作为检测 STN7和
STN8蛋白的探针。
1 材料与方法
1.1 材料培养和序列来源
拟 南 芥 Arabidopsis thaliana（ ecotype
Columbia）温室培养（22℃，10h/14h，昼 /夜，
光照强度为100μmol/m2s）。STN7和STN8激酶的
氨基酸序列来自于美国国家生物信息中心（htp:
/www.ncbi.nlm.nih.gov/）， 其 收 录 号 分 别 为
NP_195812和 NP_564946。拟南芥其他蛋白激酶
序列来自于欧洲生物信息学中心数据库（htp:
/www.ebi.ac.uk）。以下序列分析中，参数选择若
非特殊说明，均采用缺省值。
1.2 疏水性、跨膜区和模体分析
我们用 Expasy网站的蛋白分析工具包
ProtScale程序（氨基酸分值选用参数 Hphob./
Kyte&Doolitle进行计算）来分析STN7和STN8
激酶的疏水区域，用于二级结构预测和功能域的划
分；用丹麦技术大学的TMHMM2.0程序分析跨膜
生物物理学报 第二十四卷 第二期 二八年四月
ACTABIOPHYSICASINICA Vol.24No.2 Apr.2008
收稿日期:2007-12-10
基金项目:国家自然科学基金项目（30270124,39970068），教育
部博士点基金项目（20020610094），教育部新世纪人才支持计划
（NCET-04-0861）和四川大学985的资助
通讯作者:杜林方，电话：(028)85412766，传真：(028)85415300，
E-mail：dulinfang@yahoo.com
拟南芥STN7和STN8蛋白激酶的结构预测和功能分析
胡 源 1, 杜林方 1,2, 蒋佳宏 1
（1.四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610064；
2.四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所，成都 610041）
摘要: STN7和 STN8蛋白激酶分别参与了 LHCⅡ蛋白和 PSⅡ核心蛋白的磷酸化。作者用折叠识别的方法
建立了拟南芥蛋白激酶 STN7和 STN8核心结构域的三维结构,同时结合其他生物信息学方法对 STN7和 STN8
蛋白的结构和作用机制进行了探讨,选择特异位点合成多肽,并制备抗体。结果表明 STN7和 STN8蛋白激酶活
性区域的电荷和形状互补性决定了两者作用底物蛋白的差异,蛋白印迹结果显示分别制备得到了 STN7特异抗体
和STN8特异抗体,证实结构预测的正确。
关键词:光系统Ⅱ;蛋白磷酸化;STN7;STN8;核心结构域
中图分类号:Q945
2008年生 物 物 理 学 报
区，用于跨膜区域定位；用Prosite程序进行模体
分析，用于功能结构域划分[6]。
1.3 二级结构预测、多重序列比对、系统发生树
构建
用哥伦比亚大学 Predictprotein程序 （htp:
/cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/） 对 STN7
和STN8激酶进行二级结构分析，用于三级结构预
测和结构域划分。利用 ClustalW 算法[7]，在欧洲
生物信息学中心服务器上对STN7和STN8激酶和
拟南芥其他蛋白激酶进行多重序列比对（htp:
/www.ebi.ac.uk/clustalw/），结合 MEGA程序构建
系统发生树。
1.4 三维结构建模
由于 STN7和 STN8蛋白的一级序列在 PDB
数据库中未找到同源性大于30%的蛋白序列，因
此我们采用折叠识别的方法。在多重序列比对基础
上，结合跨膜区、二级结构和模体预测结果，然后
提交到英国伦敦大学帝国理工学院的蛋白质折叠识
别服务器 （www.sbg.bio.ic.ac.uk/servers/3dpssm）
上进行三维结构预测[8]，结果用蛋白质三维图象软
件Rasmol2.7查看[9]。
1.5 抗体制备和检测
在结构预测的基础上，参照杜林方等人方法[10]
进行，选择STN7或STN8分子中特异的、且位于
类囊体膜外侧的、连接两个α-螺旋之间的一段亲
水肽段（另文发表），固相合成后与BSA偶连，免
疫家兔，得到的特异性抗血清用于蛋白印迹检测。
参照张立新等人方法[11]提取拟南芥类囊体膜。
采用13.75%含6mol/L尿素的分离胶（pH8.8）和
5%浓缩胶（pH6.8）电泳分离类囊体膜样品，每
泳道样品含5μg叶绿素。蛋白分开后用考马斯亮
兰 R-250染色，或电转移至 PVDF膜，用制备的
STN7和 STN8抗体免疫检测反应。显色试剂用
ECL发光系统（Amersham）。
2 结 果
2.1 疏水性和跨膜区分析
STN7和STN8激酶的亲疏水性结果如图1所
示。由图可见，两者疏水性氨基酸占主导，其中
STN8激酶在88～122和375～400区域均呈较强的
疏水性，尤其是88～108区域中分布着17个疏水
性氨基酸，容易形成一个跨膜区。STN8激酶中段
亲疏水性较为平均，容易形成较为复杂的结构，而
C端分布着较多的疏水性氨基酸，可能形成α-螺
旋。同样 STN7蛋白在 86～120、340～353、
363～373有较强的疏水性，其中在 95～112区域
中也分布着17个疏水性氨基酸。
跨膜分析结果显示（见图2），STN7和STN8
激酶均为跨膜蛋白，跨膜区域分别为95～112和
88～108区域，其中N端位于类囊体腔中，中间段
和C端位于基质间。
2.2 模体 (motif)和二级结构预测分析
通过 PROSITE数据库寻找 STN7和 STN8激
酶可能的模体：STN7激酶序列中共有 37个
motif，而STN8激酶序列中共有33个（见表1）。
表1结果显示，STN7和STN8激酶序列中都
具有一个位于中部的蛋白激酶功能域，其中含有一
个 ATP结 合 域 。 STN7的 活 性 区 域 是
IHRDVKPQNIF（275～287），STN8的活性区域
是IVHRDVKPANLVV（304～316），STN7的 279
Fig.1 HydrophilicityanalysisofSTN7(A)andSTN8(B)
proteinbyprogrammeProtScaleandHphob./Kyte&
Doolitlewasselectedforaminoacidscale
3
2
1
0
-1
-2
-3
0 100 200 300 400 500 600
Position
Sc
or
e
(A)
0 100 200 300 400 500
Position
3
2
1
0
-1
-2
-3
Sc
or
e
(B)
-4
100
第2期 拟南芥STN7和STN8蛋白激酶的结构预测和功能分析
位和STN8的308位的Asp是激活丝氨酸-苏氨酸
羟基的催化残基。另外，这两个蛋白激酶都具有蛋
白激酶C磷酸化位点、N-乙酰化位点等，不过在
STN8中缺少cAMP依赖的蛋白激酶位点。
Fig.2 ThepossibletransmembraneregionofSTN7(A)andSTN8(B)proteinwereanalyzedusingthe
programsTMHMM2.0. :Transmembrane; :Inside; :Outside
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
100 200 300 400 500
Numberofaminoacid
Pr
ob
ab
il
it
y
(A)
100 200 300 400 500
Numberofaminoacid
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Pr
ob
ab
il
it
y
(B)
Table1 MotifsinSTN7andSTN8analysisemployingPrositeprogramme
Motif
PROTEINKINASEDOM 134～452 133～477
PROTEINKINASEATP 140～148 139～147
PROTEINKINASEST 275～287 304～316
MYRISTYL 8～13,58～63,62～67,84～89,91～96 102～107,106～111,145～150
107～112,188～193,223～228,269～274 191～196,222～227,480～485
AMIDATION 18～21,136～139,547～550 124～127
PKCPHOSPHOSITE 33～35,37～39,43～45,128～130,154～156,202～204 42～44,81～83,98～100,136～138
203～205,293～295,375～377,442～444,494～496 277～279,295～297,317～319
403～405,444～446,456～458,460～462
ASNGLYCOSYLATION 41～44,492～495 35～38,156～159
CK2PHOSPHOSITE 66～69,158～161,190～193, 53～56,77～80,158～161,216～219
474～477,494～197,537～540 261～264,344～347,433～436,438～441
CAMPPHOSPHOSITE 155～158,167～170
TYRPHOSPHOSITE 156～164 193～201,343～350
Site(aa)
STN7 STN8
二级结构预测结果见图3，从图中可以看到它
们反映总的结构特征基本是一致的：蛋白 N端
90-104位点预测为α-螺旋，为跨膜区。核心结构
域比较保守，二级结构较为丰富，可能含有重要的
功能。核心结构域的N端含有5个β-折叠和1个
α-螺旋，中间是蛋白激酶的活性区域，保守的催
化中心Asp就位于该区域内。在N端和活性区域
间存在着几个小的β-折叠和无规则卷曲，起连接
作用，相当于一个铰链。C端主要由较多的α-螺
旋组成。
101
2008年生 物 物 理 学 报
2.3 种系发生树构建
Hardie[12]将拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶分
成12种较大的亚家族，我们选择了这12种亚家族
中的代表序列和STN7、STN8构建了种系发生树。
从种系发生树（图 4）可以看出，STN7和 STN8
在进化距离上与 WAK1激酶（属于 Receptor-like
kinases家族）较近，与 RLKs家族属于同一亚家
族，表明其可能与RLKs家族的结构与功能相似。
RLKs家族是受体类似激酶家族，单次跨膜，N端
具有疏水性信号肽位于胞外，C端催化结构域位于
胞内，受胞外因子的调节而激活。我们对STN7和
STN8的跨膜、模体预测和二级结构预测的结果也
表明了这一点。
2.4 核心结构域建模
在 STN7和 STN8蛋白激酶的折叠识别构建
中，我们用比对分值较高的折叠子作为预测模板：
STN7:dljnk，STN8:dlhcl（dljnk，dlhcl为 SCOP数
据库中蛋白折叠子ID），并结合二级结构和模体预
测结果，构建了STN7蛋白和STN8蛋白核心结构
域的三维结构 (见图5)。
从图中可以看出：STN7和STN8激酶核心结
构域采用的折叠方式大体相同。以 STN7激酶为
例：该结构域包括由一个铰链区连接的两个叶状结
构区。N端的叶状区含有5个β片层和一个α螺
旋（C螺旋），在活性状态下，C螺旋能形成一个
盐桥，与保守的Lys（167）残基连接，使得ATP
102
第2期 拟南芥STN7和STN8蛋白激酶的结构预测和功能分析
磷酸盐获得理想的定位。氢键在激酶结构和催化功
能中起着很重要的作用，Lys（167）侧链可以与
ATP磷酸基团的氧形成氢键，参与ATP的结合定
位。STN7的定点突变实验中，将Lys（167）突变
成 Arg或 Gln，激酶功能丧失[4]，这与我们预测
Lys（167）在ATP结合中起着重要的作用是一致
的。另外，N端最引人注目的是一个 β片层
（loop-β片层）形成的P环，为ATP结合区域，我
们在比对中发现拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结
构中，与ATP结合的区域是高度保守的，富含甘
氨酸残基，该区域是ATP的磷酸根锚定所必需的
结构。在STN7和STN8激酶中，该区域所含氨基
酸完全一样 （140Leu-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Gly-
Val-Val148），其中 Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Gly区域
富含甘氨酸，容易形成一个loop，而且Gly和Ser
可以与ATP磷酸基团形成氢键，参与ATP的结合
定位。中间部分（275Ile-Ile-His-Arg-Asp-Val-Lys-
Pro-Gln-Asp-Ile-Ile-Phe287）是激酶的活性区域，
其中Asp（279）是催化残基。C端较大的叶状区
主要是由α螺旋组成，它包括一个含有4个α螺
旋的束状结构，另一个α螺旋和两个短的β片层。
在STN8激酶的活性部位周围还存在着一个Q环，
P环和Q环共同限制了底物蛋白进入活性区域的形
状和大小，而STN7激酶则缺少这个 Q环，因而
可以容纳较大的肽段。
Fig.5 Three-dimensionalstructureofcoredomainofSTN7(A)andSTN8(B)protein
Fig.4 Neighbor-joiningtreeofArabidopsisthalianaprotein
kinases.Sequencesoftheproteinkinaseswereretrieved
from EMBIdatabaseandtheirsubfamilywereshownin
parentheses. The sequences were aligned using the
ClustalW program,andtheresultingalignmentparameters
wereusedtocontructthephylogenetictreeusingMEGA
program. Bootstrap values were calculated for 500
replicatesandwereshownonbranches.BracnchLengths
reflecttheevolutionarydistancesindicatedbythescales
PK64(PVPK)
NPH1(NPH1)
PK19(S6)
AFC2(LAMMER)
PROKINB(SnRK2)
CKA2(CK2)
MPK1(MAPKs)
GSK3-iota(GSK3/shaggy)
PPK1(PPK1)
SIK1(MAPKKs)
MRK1(CTR1/Raf-like)
WAK1(RLKs)
STN7
STN8
AKIN11(SnRK1)
CPK4(CDPKs)
TOUSLED(TOUSLED)
ANP1(MAPKKKs)
MHK(CDKs)
CK11(CK1)
100
100
21
2350
19
27
81
18
42
32
100
99
66
34
38
40
0.2
GLU122
ASP279
MET468
ATP-binding
loop
Chelix
Ploop
Catalyticcenter
(A) ARG130
Chelix
Ploop
Qloop
CatalyticcenterASP308
PHE493
Antibodydesignarea
(B)
Antibodydesignarea
103
2008年生 物 物 理 学 报
Fig.6 (A)SDS-PAGEofthylakoidmembraneproteinsof
Arabidopsis thaliana with Coomassie Blue (Coom);
(B) Westernblotwithpolyantibodyserum ofSTN7or
STN8
116
66.2
45
35
25
18.4
14.4
kD
Coom
(A) (B)
!STN7 STN8
Marker 1
2.5 抗体制备和检测
STN7和STN8激酶都是膜蛋白，难以纯化制
备抗体，我们在结构预测的基础上，选择了位于类
囊体膜外侧，连接两个螺旋之间的亲水肽段（图
5），合成后免疫家兔，得到的抗体用于 Western
Bloting检测。所得结果如图 6所示，分别在
64kD（STN7）和55kD（STN8）有明显的免疫亲
和反应，表明制备的抗体能专一地识别拟南芥
STN7和STN8激酶。
3 讨 论
植物蛋白激酶在植物抗性作用、激素调节及光
信号转导过程中发挥着重要的调节作用。植物中蛋
白激酶是一个很大的家族，根据其底物蛋白被磷酸
化的氨基酸种类，可将其分成 3类：1）丝氨酸 /
苏氨酸蛋白激酶，2）酪氨酸蛋白激酶，3）组氨酸
蛋白激酶。自1989年报道第一条植物蛋白激酶序
列后，至今仅在拟南芥中就发现有638条丝氨酸/
苏氨酸蛋白激酶序列，数目急剧增长。最近研究发
现的拟南芥类囊体两种蛋白激酶STN7和STN8均
属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对底物蛋白的磷酸
化主要发生在苏氨酸残基上。在构建种系发生树
时，我们选择了拟南芥丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶
12种较大的亚家族中有代表性的激酶，这样不仅
可以分析在同一个种中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的
序列相似性，而且可以避免数据库中收录的一些重
复和相似序列。
研究表明，STN7（与 ChlamydomonasSTT7
蛋白激酶具有同源性）和 STN8，分别参与了
LHCⅡ蛋白和PSⅡ核心蛋白的磷酸化。由于PSⅠ
和PSⅡ吸收的光能往往不均衡，状态转换（state
transitions）可以在短期内调节光能在PSⅠ和PSⅡ
之间的不平衡。LHCⅡ蛋白通过磷酸化与去磷酸化
来完成状态转换过程，实现激发能在PSⅠ和PSⅡ
之间的分配，这一过程不仅需要质醌还原、LHCⅡ
蛋白激酶与Cytb6f复合体的结合，还需要叶绿体
中含硫化合物的氧化还原作用。Rintamki[13]发现在
强光条件下，硫氧还蛋白通过还原LHCⅡ蛋白激
酶的二硫键使其失活而参与了该过程。在本文分析
中，我们发现 STN7蛋白为单次跨膜蛋白，其 N
端位于类囊体腔中，而激酶结构域位于基质中，这
与LHCⅡ磷酸化作用发生在基质一端是一致的[1]。
此外值得注意的是：STN7激酶第 44位的 Cys残
基和第65的Cys残基容易形成一对二硫键。尽管
文献报道TAK激酶也参与了状态转移过程[2,3]，但
是我们对TAK激酶的分析结果表明，TAK激酶不
能形成二硫键，因此我们认为STN7激酶分子中的
这对二硫键可能是硫氧还蛋白作用的靶位点。
我们将STN7和STN8激酶与拟南芥现有的丝
氨酸/苏氨酸蛋白激酶进行序列比对，发现这两个
激酶核心序列高度保守，构建的核心结构域具有典
型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域（图5）：β片
层组成的N端和α螺旋组成较大的C端通过一个
铰链区连接起来。这种催化核心结构域有3方面功
能：1）ATP的结合和定向；2）底物蛋白的结合
和定向；3）催化ATP的γ-磷酸基团转移到受体
苏氨酸的羟基上。值得注意的是在底物结合区域这
两个激酶存在着差别。底物结合位点位于这两个激
酶C端的叶状结构中，形成的这样一个底物结合
袋与肽链底物之间存在着形状和电荷互补性作用。
从图中我们可以看到，由于STN8激酶活性中心周
围存在的P环和Q环，它们限制了底物蛋白的大
小，因此 STN8激酶只能催化 D1、D2、CP43和
PsbH等PSⅡ核心蛋白分子中N端的Ser/Thr残基
磷酸化，而STN7激酶活性中心缺少Q环，只有P
环，底物结合袋口较大，可以容纳较大的肽段进入
活性中心，因此STN7不仅可以使底物蛋白 N端
的一个Ser/Thr磷酸化，而且还可能参与LHCⅡ其
104
第2期 拟南芥STN7和STN8蛋白激酶的结构预测和功能分析
他位点的Ser/Thr残基的磷酸化，因为LHCⅡ分子
中存在多个的磷酸化位点[14]。此外，序列比对结果
显示，STN8激酶活性中心周围分布着4个碱性氨
基酸残基，而在STN7激酶对应位点上为酸性氨基
酸残基（图3中用数字表示），两者存在明显的差
异。根据Julia等[5]搜索的拟南芥7个编码LHCⅡ
蛋白的基因，表达蛋白的 N端存在 RKTVAKPK
或RRTVK序列，磷酸化位点中的Thr残基被Lys
和Arg等碱性氨基酸残基所包围。因此，电荷互
补性也决定了STN7和STN8激酶催化底物蛋白的
不同。
在结构预测的基础上，我们设计出多肽抗体，
并通过蛋白印迹得到鉴定。一方面说明结构预测的
准确性，另一方面得到的抗体可用于研究外界环境
变化对拟南芥STN7和STN8激酶在表达水平上的
影响，进一步探讨STN7和STN8激酶在膜蛋白磷
酸化中的调控机制。
本文通过生物信息学的方法对STN7和STN8
蛋白激酶序列进行了分析，并通过折叠识别的方法
建立两者核心结构域的三维结构，从结构上说明了
STN7和STN8激酶的异同，解释了两者作用蛋白
底物的不同，以利于设计突变体。
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105
2008年生 物 物 理 学 报
TheworkissupportedbyTheNationalNaturalSciencesFoundationofChina(30270124,39970068)，TheDoctoralFoundationofMinistry
ofEducationofChina(20020610094)，Program forNewCenturyExcelentTalentsinUniversity(NCET-04-0861)andSichuanUniversity
ResearchGrant985
Received:Dec10,2007
Correspondingauthor:DULin-fang,Tel：+86(28)85415008，Fax：+86(28)85415300，E-mail：dulinfang@yahoo.com
STRUCTUREPREDICTIONANDFUNCTIONANALYSISOF
STN7ANDSTN8PROTEINKINASEFROM Arabidopsisthaliana
HUYuan1，DULin-fang1,2，JIANGJia-hong1
（1.KeyLaboratoryofBio-resourcesandEco-environment(MinistryofEducation),
ColegeofLifeScience,SichuanUniversity,Chengdu610064,China;
2.InstituteforNanobiomedicalTechnologyandMembraneBiology,SichuanUniversity,Chengdu610061,China）
Abstract:ItisknownthattwoproteinkinaseSTN7andSTN8arerequiredforphotosystem Ⅱ
phosphorylationinArabidopsisthaliana.However,themainsubstratesofSTN7andSTN8arediferent:
LHCⅡ phosphorylationismainlydependentonSTN7,whereasphosphorylationofPSⅡ coreproteins
dependsonSTN8.HeretheauthorspredictedthethreedimensionalstructureofcoredomainofSTN7
andSTN8byusingfoldrecognitionmethod.Combiningwithotherbioinformaticsmethods,theauthors
comparedtheirstructureandactionmechanism.Electricchargeandstructurediferencearoundthe
catalyticsitemaydeterminesubstratespecificityofthesetwokinases.Twoanti-peptideantibodywere
designedandpreparedbasedonthecombineddatafrom proteinanalyses.Westernblotanalysiswith
thylakoid membranesofArabidopsisthalianashowed thepolyclonalantibodiesagainsteach ofthe
peptideswereabletoactwiththeparentprotein,respectively.Therefor,thisantibodycanbeusedasa
probetodetectSTN7orSTN8.
KeyWord:PSⅡ;Phosphorylation;STN7;STN8;Coredomain
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