全 文 ：植物学通报 2004, 21 (4): 449~454
Chinese Bulletin of Botany
①国家自然科学基金重大项目（39890390）资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: gcwang@ms.qdio.ac.cn
收稿日期：2003-08-11 接受日期：2003-11-03 责任编辑：白羽红
龙须菜叶绿素-蛋白复合物的分离及鉴定①
王广策② 庄仲华 曾呈奎
（中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室 青岛 266071）
摘要 以海洋经济海藻——龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）为材料，机械破碎与超声波相结合破碎
这种含胶量非常多的细胞，蔗糖密度梯度超速离心纯化其类囊体膜，去垢剂Triton X-100增溶纯化的类
囊体膜，再用蔗糖密度梯度超速离心方法分离其叶绿素-蛋白质复合物。P700差示光谱鉴定分离的光系统
Ⅰ（PSⅠ）颗粒，并且检测到了具有DCIP光还原活性的光系统Ⅱ（PSⅡ）颗粒。结果表明，尽管海藻
类囊体膜增溶困难，但只要条件合适，可以得到具有活性的光系统颗粒。
关键词 龙须菜， 叶绿素-蛋白复合物，光系统Ⅰ颗粒，光系统Ⅱ颗粒
Isolation and Characterization of Chlorophyll-protein
Complexes from Gracilaria lemaneiformis
WANG Guang-Ce② ZHUANG Zhong-Hua ZENG Cheng-Kui
(Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071)
Abstract Gracilaria lemaneiformis, an cono cal seaweed containing a lot of polysaccharide in
the cell, was homogenized by means of the combination of the mechanical grinding and ultrasonic
disruption, and then the thylakoid membrane was purified by the sucrose gradient centrifugation.
The intrinsic chlorophyll-protein complexes with different pigment composition were isolated by the
centrifugation after the purified thylakoid membrane had been fragmented with the non-ionic detergent,
Triton X-100. Differential spectrophotometry of these isolated chlorophyll-protein complexes showed
that the photosystemⅠwas obtained, and the photosystemⅡ was detected o have the activity of
photo-reduction for DCIP. All these results indicated that the photosystem particles with activities
can be obtained although the marine algal membranes are extremely resistant to attack by detergents.
Key wordsGracilaria lemaneiformis, Chlorophyll-protein complexes, PhotosystemⅠparticle,
PhotosystemⅡ particle
存在于叶绿体类囊体膜中的蛋白质复合物是植物进行光能吸收、传递和转换的关键部位，
因而一直是光合作用研究的热点（匡廷云等，1999）。长期以来，对嵌合在类囊体膜中的
蛋白质复合物, 尤其是叶绿素-蛋白质复合物的研究主要集中在陆地高等植物和海洋绿藻类，对
褐藻特别是墨角藻（Fucus sp.）也进行了一些研究。对于光合生物进化的另一支——红蓝植
研 究 简 报
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物（红藻和蓝藻）（曾呈奎和周百成，1983），由于其主要的捕光色素系统是附着在类囊
体膜上的藻胆蛋白或藻胆体，所以一直是以藻胆蛋白或藻胆体的结构与功能为光合作用研究的
重点（王广策和曾呈奎，1998），而嵌合在类囊体膜中的叶绿素-蛋白质复合物的研究却鲜
有报道。其实，红藻中不但存在叶绿素-蛋白复合物，而且其在红藻的光合作用中也起着非
常重要的作用。红藻光系统Ⅰ的捕光色素系统主要由叶绿素a-蛋白质复合物构成，光系统Ⅱ
的捕光色素系统则由藻胆体和叶绿素a-蛋白质复合物共同构成（王广策等，2000a; 2000b）。
在红藻光系统Ⅱ中，外周捕光色素系统——藻胆体捕获光能后，通过内周捕光色素系统——
叶绿素a-蛋白质复合物传递给PSⅡ反应中心（Glazer, 1985）。因此，研究红藻中叶绿素a-
蛋白质复合物的结构与功能对阐明红藻的光合作用机制意义重大。同时，红藻的进化地位特
殊（Martin and Herrmann, 1998），认识光合生物的进化过程必须深入研究红藻的生理生化过
程，所以研究红藻的叶绿素a-蛋白质复合物也将有助于我们认识光合生物的进化规律。
江蓠属（Gracilaria）属于红藻门（Rhodophyta）、真红藻纲（Florideophyceae）、
杉藻目（Gigartinales）、江蓠科（Gracilariaceae），主要分布在热带和温带海域，是一种
重要的经济海藻。在我国，江蓠是继海带、紫菜和裙带菜之后的第4种人工栽培海藻，年
产量大约为几万吨（鲜品）（张学成，1999）。江蓠的主要用途是生产琼胶（agar）和琼
胶素（agarose），同时江蓠也是一种良好的食品以及养殖动物（如鲍鱼）的饲料。因此，
江蓠的经济价值很高。然而，至今对江蓠的基础研究开展得很少，尤其是江蓠独特的代谢活
动如光合产胶过程的研究。
本文以龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)为材料，分离纯化江蓠类囊体膜中的叶绿素-蛋白
质复合物，测定PSⅠ和PSⅡ复合物的活性，为深入研究江蓠的光合产胶过程奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)采自青岛汇泉湾太平角，-20℃保存，使用时于室温下融化。
1.2 方法
1.2.1 类囊体膜的分离纯化 取50 g鲜重的龙须菜，消毒海水洗净后剪成1 cm左右的小段，
加入150 mL 0.05 mol.L-1 Tris-HCl缓冲液（内含0.0005 mol.L-1 K2HPO4，0.001 mol.L-1 MgCl2，
0.005 mol.L-1 EDTA，0.002 mol.L-1 NaNO3，0.001 mol.L-1 MnCl2，0.1 mol.L-1蔗糖，
pH7.8），在组织捣碎机中匀浆3 min，匀浆液在冰浴中再用超声波处理5 min，超声波的输
出功率为400W。然后，匀浆液4层纱布过滤后超速离心（140 000 g，4℃，60 min），超
速离心所得的沉淀用上述缓冲液悬浮后铺在含蔗糖密度梯度离心管的上层，进行第2次超速离
心（140 000 g， 4℃，210 min）。离心管的蔗糖密度梯度为不连续蔗糖，自下而上的组成
为60%、50%、40%和30%（W/V）。
取出第2次超速离心后位于50%~60％ 蔗糖浓度处的层带，用不含蔗糖的上述缓冲液稀释
并进行超速离心（140 000 g，4℃，30 min）以去除蔗糖。沉淀用缓冲液悬浮，即得到较
纯的类囊体膜制剂。
1.2.2 色素蛋白复合物的分离 将上述纯化的类囊体膜制剂用Triton X-100在室温避光的条件
下增溶30 min，Triton X-100与叶绿素的质量比为200:1；随后进行蔗糖密度梯度离心
4512004 王广策等：龙须菜叶绿素-蛋白复合物的分离及鉴定
（140 000 g，4℃，15 h），蔗糖密度梯度依下至上依次是60％、50％、40％、30％、
20％、15％和10％。取出蔗糖密度梯度中可见的层带进行光系统活性的鉴定和光谱测定。
1.2.3 chla含量的测定 测定方法参照文献（Jeffrey and Humphrey，1975），吸收光谱用
Beckman DU-650紫外及可见分光光度计测定，吸收池光径为1 cm。
1.2.4 光系统活性鉴定 P680和P700差示光谱的测定：反应液组成为50 mmol.L-1 Hepes-NaOH
（pH 7.0）, 2.5 mmol.L-1 MgCl2, 10 mmol.L-1 KCl, 0.5 mmolL-1 高铁氰化钾，0.5 mmol.L-1 抗坏血
酸，样品叶绿素浓度为10 mg.mL-1。
DCIP光还原活性的测定：参考Kuwabara（1982）的方法，反应液组成为300 mmol.L-1
蔗糖, 10 mmol.L-1 NaCl ， 25 mmol.L-1 Hepes-NaOH (pH6.0), 0.06 mmol.L-1 DCIP, 1 mmol.L-1
DPC，样品叶绿素浓度为10 mg.mL-1。
2 结果与讨论
2.1 类囊体膜的制备
图1是龙须菜细胞的匀浆液经过蔗糖密度梯度离心的结果。由图1可以看出，30%~40％
蔗糖层、40%~50％层以及50%~60%层处均有明显的条带。30%~40％层处的条带为红颜色，
是较为完整的藻胆体；40%~50％层处的条带为浅绿色，可能是细胞破碎过程中产生的类囊体
膜片段；50%~60%层处的带是离心管中的主带，呈暗绿色，是龙须菜较完整的类囊体膜。
龙须菜细胞中含有大量的碳水化合物，其中大部分碳水化合物为琼胶，一般约占细胞总
重的30%~40%（纪明侯，1997），这些琼胶的存在使细胞破碎极为困难。江蓠属的海藻细
胞的破碎用机械捣碎的办法，由于其强度太小很难充分破碎细胞；用大功率的超声波破碎，
可能强度过大又会破坏类囊体膜的完整性。经反复实验，本研究探索出了组织捣碎和低功率
超声波相结合的方法，既能够保证较高的细胞破碎率，又能保持类囊体膜尽可能的完整。
2.2 龙须菜类囊体膜的增溶及其色素蛋白复合物的分离
2.2.1 增溶剂对类囊体膜的增溶 使用增溶剂Triton X-100增溶龙须菜的类囊体膜，Triton X-
100与叶绿素的质量比为200:1。经过比较分析，发现这种增溶条件对龙须菜类囊体膜的增溶
效果最好，经过蔗糖密度梯度超速离心后，获得7条明显的色素带（图2）。
类囊体膜的增溶是分离色素蛋白复合物的关键，不同性质的增溶剂以及不同的浓度对研究
结果影响很大。高等植物类囊体膜的增溶条件并不一定适合海藻，因为海藻类囊体膜对增溶
剂有很强的抗性（Anderson and Barrett，1979）。分离海藻类囊体膜的色素蛋白质复合物时，
需要使用高浓度的增溶剂，但是得到的这些蛋白质复合物往往没有活性，或者活性很弱
（Anderson and Barrett，1979）；使用一些温和的增溶剂，如毛地黄皂苷（digitonin），则
不能使海藻类囊体膜增溶。本文报道了用中性的增溶剂Triton X-100增溶海洋红藻——龙须菜
的类囊体膜，不仅得到了明显的7条带，而且在这些条带测得了光合作用的活性。
2.2.2 色素蛋白质复合物的分离与鉴定 经过Triton X-100增溶的龙须菜类囊体膜，通过蔗
糖密度梯度超速离心分离，共获得了7条色素带（图2）。通过光谱鉴定发现，各条带均在
418 nm和670 nm处有较高的吸收峰，在435 nm处有吸收肩峰，在496 nm和540 nm处各有
一个非常低小的吸收峰。435 nm和670 nm处为叶绿素a的特征吸收峰，418 nm处为脱镁叶绿
素的特征吸收峰，496 nm和540 nm处为藻红蛋白的特征吸收峰。这些结果表明，分离得到
的各条色素带主要是叶绿素-蛋白质复合物。
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目前，海藻叶绿素-蛋白质复合物的研究相对集中在海洋杂色藻类，如褐藻和硅藻等
（Anderson and Barrett，1979；Caron et al.,1988）。用蔗糖密度梯度离心分离时，仅能得
到5条色素带，比本文报道的色素带要少。其原因可能有两点：（1）物种差异，褐藻和
红藻虽然都是海洋红藻，但分属两个不同的门，差异很大；（2）本文报道的增溶以及分离
条件可能比较合适。
光谱鉴定发现，本文报道的7条色素带的吸收光谱基本一致，与文献关于褐藻或硅藻等
杂色藻类（Anderson and Barrett，1979；C on et al.,1988）的结果不同。我们认为原因是
龙须菜非水溶性色素（主要是叶绿素a）比较单一。龙须菜主要的捕光色素为叶绿素a和高
度水溶的藻胆蛋白。藻胆蛋白组成藻胆体，附着在类囊体膜上，在用超声波破碎细胞以及随
后用Triton X-100增溶类囊体膜时，藻胆体从类囊体膜上解离，成为藻胆蛋白，溶解于缓冲
液中，所以在用蔗糖密度梯度离心分离时得到各条色素带很少有藻胆蛋白的存在，主要是叶
绿素a的吸收。
2.3 分离的各条带的光系统鉴定以及活性测定
2.3.1 光系统Ⅰ（PSⅠ）的鉴定 用P700差示光谱的方法测定获得的各个条带差，发现
F3 和 F6层带在700 nm处有峰，表明是PSⅠ的颗粒，其中F3条带的峰非常明显（图3，图4）。
2.3.2 光系统Ⅱ（PSⅡ）DCIP光还原活性的测定 图5是光系统Ⅱ（PSⅡ）DCIP光
还原活性测定的结果。从图5中可以看出，以蒸馏水为对照， F2、F3、F6和F7 4个条带
均显示了DCIP光还原活性。其中，蒸馏水的DCIP光还原活性为-0.0374，可以忽略不计；
F2层带DCIP光还原活性最强，达到3.7049微电子当量.mg-1 Chl h-1，因此认为F2条带含有
大量光系统Ⅱ颗粒。
图5还显示F3、 F6和F7也有一定的光系统Ⅱ活性，这可能是Triton X-100增溶龙须菜类
图1 蔗糖密度梯度离心分离的龙须
菜的类囊体膜（左边表示蔗糖浓度）
Fig.1 The thylakoid membrane purified
by the sucrose step gradient centrifuga-
tion from Gracilaria lemaneiformis
（The numbers in the left indicate the
sucrose densities）
图2 蔗糖密度梯度离心从龙须菜类囊体膜分离的叶
绿素-蛋白质复合物（左边表示蔗糖浓度(W/V)，右
边表示带号）
Fig.2 Th chlorophyll-protein complexes isolated by the
sucrose gradient centrifugation from the purified thylakoid
membrane (The numbers in the left indicate the sucrose
densities(W/V), and the numbers in the right mean the band
number)
4532004 王广策等：龙须菜叶绿素-蛋白复合物的分离及鉴定
囊体膜时各个色素蛋白质复合物并未完全分开。例如从P700差示光谱表明F3带是主要的PSⅠ
颗粒，然而F3又表现出较弱的光系统Ⅱ活性，说明了F3带主要是PSⅠ组分，同时又含有
一些PSⅡ组分。
用蔗糖密度梯度离心分离褐藻或者其他杂色藻类囊体膜的色素-蛋白质复合物时，往往比
重最大（离心管最下面）的带为光系统Ⅰ颗粒，依次为光系统Ⅱ等（Andersonand Barrett，
1979；Caron et al.,1988）。但是笔者发现比重最大的带（F7）既没有显示光系统Ⅰ特征，
也没有表现出光系统Ⅱ活性，反而是位于超速离心管较上层的F2带（较强的光系统Ⅱ活性）
和F3带（光系统Ⅰ特征）显示了光系统的特性，特别是F2带只具有了光系统Ⅱ活性，没有
光系统Ⅰ的特征。由于用蔗糖密度梯度离心法分离红藻叶绿素-蛋白质复合物并没有见任何文献
图 3 F3带（在15%蔗糖浓度处）的差示光谱，显示该带主要为光系统Ⅰ
Fig.3 Difference absorption spectrum of the F3 band located in the 15% of sucrose, indicating that the band
contains the PSⅠparticle
图 4 F6带（在50%蔗糖浓度处）的差示光谱，
显示该带主要为光系统Ⅰ
Fig.4 Difference absorption spectrum of the F3 band
located in the 50% of sucrose, indicating that the band
contains the PSⅠparticle
图5 用蔗糖密度梯度离心分离的龙须菜叶绿
素-蛋白质复合物的DCIP还原性
Fig.5 The activities for reducing DCIP of the
chlorophyll-pro ein complexes isolated by the su-
crose step gradient centrifugation
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报道，所以这种特性是红藻门的特征，还是江蓠属抑或是龙须菜的特征，现在还很难确定。
参 考 文 献
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