全 文 ：果 树 学 报 2007,24(5):634～639
JournalofFruitScience
收稿日期:2007-05-15 接受日期:2007-07-06
基金项目:河南省自然科学基金(0611030300)
作者简介:卢龙斗,男,教授,博士,主要从事植物遗传学研究。Tel:0373-3326341,E-mail:LLd5910@yahoo.com
RAPD技术在石榴品种分类上的应用
卢龙斗 1,刘素霞 1,邓传良 1,卢志远 3,汪小飞 2,高武军 1
(1河南师范大学生命科学学院,河南新乡 453007;2黄山学院森林资源与环境系,安徽黄山 245041;
3东南大学生物科学与医学工程学院,南京 210096)
摘 要:以55个石榴栽培品种为试验材料,利用15条多态性好的随机引物进行RAPD分析,共扩增出 125条带,其
中多态性条带92条,多态性百分率 73.6%,说明品种间有变异。应用 TFPGA软件计算 55个石榴品种间的 Nei’s遗
传距离,并用UPGMA法构建聚类图,将55个石榴品种分为4个类群,从DNA水平上揭示了石榴品种之间的亲缘关
系。结果表明,采用UPGMA法聚类的结果与形态上的分类存在着一定的差异,即与根据花色和果味进行的分类没有
相关性而与瓣型进行的分类有一定的相关性。
关键词:石榴;品种;分类;RAPD
中图分类号:S665.4 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2007)05-634-06
StudiesonclassificationofpomegranatecultivarsbyRAPDanalysis
LULong-dou1,LIUSu-xia1,DENGChuan-liang1,LUZhi-yuan3,WANGXiao-fei2,GAOWu-jun1
(1ColegeofLifeScience,HenanNormalUniversity,Xinxiang,Henan453007China;2DepartmentofResourcesandEnvironment,Huang-
shanColege,Huangshan,Anhui245041China;3SchoolofBiologicalScience&MedicalEngineering,SoutheastUniversity,Nanjing,
Jiangsu210096China)
Abstract:RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)analysiswasappliedto55pomagranatecultivarsbyusing15random
primersandatotalof125bandsweregenerated,ofwhich92werepolymorphicbands(thepercentageofpolymophicloci,
PPB=73.6%).Theresultsrevealedthattherewasvarianceinthe55cultivars.AccordingtotheresultsofRAPDamplification,
whichwereanalyzedtoNei’sgeneticdistancebyTFPGAsoftware,theclusteringdendrogramwasconstructedbyUPGMA
method.These55cultivarswereclassifiedinto4majorgroups.Atthesametime,thegeneticrelationshipsbetweenthe55
cultivarswerealsorevealed.TheresultsofRAPDhadsomediferenceswithmorphologicalclassification.Theresultsdonot
supportthemorphologicalclassificationbasedontheflowercolorandfruittastebuthaverelevancetothatoftheflowerpetal.
Keywords:Pomegranate;Cultivars;Classification;RAPD
石榴(PunicagranatumL.)又名安石榴、丹若、金
罂、天浆等,为多年生落叶果树,原产伊朗和阿富汗
等中亚地区,在我国已有超过2000a的栽培历史,
是我国古老的栽培果树之一,具有较高的食用、药用
及观赏价值[1]。
我国石榴品种资源十分丰富,但由于长期的引
种和选择,已很难从植物的外部形态上来确定品种
的来源和品种间的亲缘关系,存在着同名异种或同
种异名的问题[2],这给准确进行品种资源鉴定和利用
带来了困难。目前对石榴的研究基本停留在形态学
水平上,对石榴品种资源的分类还没有统一的方法,
各地多以果型大小、果皮色泽、籽粒风味、籽粒口感、
成熟期及用途等进行分类。因此,利用分子标记等先
进手段进行品种分类已成为一个重要的研究方向。
RAPD技术是进入20世纪90年代后发展起来的一
种DNA分子标记技术,被广泛用于植物品种的鉴定
和分类[3-5]。但应用该技术对石榴品种分类研究的报
道较少[6-7]。我们利用RAPD技术对石榴品种进行研
究,以期建立分子水平上的石榴分类体系,分析不
同品种间的遗传关系,为石榴品种的鉴定提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
选取不同花色和花型的 55个石榴品种为材料
(表 1),采集新鲜、无虫斑的幼嫩叶子,用硅胶干燥
保存,用于基因组提取和RAPD分析。
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2007.05.002
表1 用于RAPD分析的石榴品种名称及其类型
Table1PomegranatecultivarsusedinRAPDanalysis
编号
No.
品种名称
Cultivar
采集地区
Samplingregion
花色
Flowercolor
花型
Flowerform
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
大马牙酸Damayasuan
重瓣月季石榴Chongbannana
蓝宝石Lanbaoshi
重萼白花石榴Chongebai
临选20号Linxuan20
玉石子Yushizi
酸绿子Suanlüzi
薄皮糙Baopizao
牡丹白石榴Mudanbai
重萼红花石榴Chongehong
甜绿子Tianlüzi
复瓣白花石榴FubanBai
江石榴Jiangshiliu
小红皮酸Xiaohongpisuan
重瓣红花石榴Chongbanhong
白花Baihua
月季石榴Nana
大粒三白甜DaliSanbaitian
乔黑果Qiaoheiguo
临选14号Linxuan14
新大甜Xindatian
净皮甜Jingpitian
临选1号Linxuan1
岗榴Gangliu
大果黑子DaguoHeizi
牡丹红石榴Mudanhong
小青皮甜Xiaoqingpitian
短枝红Duanzhihong
白花重瓣石榴Multiplex
大红皮甜Dahongpitian
大青皮酸Daqingpisuan
三白甜Sanbaitian
突尼斯软子TunisiRuanzi
玛瑙石榴Lagrelei
小红皮甜Xiaohongpitian
粉皮Fenpi
大青皮甜Daqingpitian
白丰Baifeng
泰山红Taishanhong
天红蛋Tianhongdan
百日雪Bairixue
白皮酸Baipisuan
大马牙甜Damayatian
皮山1号Pishan1
大笨子Dabenzi
重萼黄花石榴Chongehuang
重瓣粉红石榴Chongbanfeng
红玛瑙Hongmanao
白玉娘Baiyuniang
重萼粉红花石榴Chongefeng
小青皮酸Xiaoqingpisuan
大红皮酸Dahongpisuan
复瓣红花石榴Fubanhonghua
墨石榴Nigra
复瓣月季石榴FubanNana
蒙自Mengzi
合肥Hefei
淮北Huaibei
开封Kaifeng
临潼Lintong
蒙自Mengzi
蒙自Mengzi
蒙自Mengzi
合肥Hefei
开封Kaifeng
蒙自Mengzi
黄山Huangshan
蒙自Mengzi
蒙自Mengzi
合肥Hefei
蒙自Mengzi
黄山Huangshan
蒙自Mengzi
淮北Huaibei
临潼Lintong
临潼Lintong
蒙自Mengzi
临潼Lintong
蒙自Mengzi
淮北Huaibei
合肥Hefei
蒙自Mengzi
合肥Hefei
合肥Hefei
蒙自Mengzi
蒙自Mengzi
蒙自Mengzi
郑州Zhengzhou
合肥Hefei
合肥Hefei
合肥Hefei
合肥Hefei
合肥Hefei
合肥Hefei
合肥Hefei
蒙自Mengzi
蒙自Mengzi
蒙自Mengzi
淮北Huaibei
合肥Hefei
郑州Zhengzhou
合肥Hefei
合肥Hefei
淮北Huaibei
郑州Zhengzhou
合肥Hefei
合肥Hefei
合肥Hefei
合肥Hefei
合肥Hefei
红色Red
红色Red
红色Red
白色White
红色Red
红色Red
红色Red
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白色White
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白色White
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白色White
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白色White
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白色White
白色White
红色Red
红色Red
红色Red
黄色Yelow
粉红色Pink
红色Red
白色White
粉红色Pink
红色Red
红色Red
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红色Red
红色Red
I
II
I
IV
I
I
I
I
II
IV
I
I
I
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II
I
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I
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I
I
I
I
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I
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I
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I
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II
I
I
I
I
IV
II
I
I
IV
I
I
I
I
I
注:I单瓣,I复瓣,II重瓣,IV重萼。
Note:Isingleflower,Idoubleflower,IIdoubleflower,IVdoublesepal.
5期
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 每样取0.1g左右,利用改进
的 CTAB法[8]提取总 DNA,溶于 1×TE缓冲液中备
用。用质量分数0.8%的琼脂糖凝胶电泳,以Lambda
DNA/HindIIMarker为对照,确定各样品的分子质
量大小。并且用UV/VIS分光光度计测定纯度,然后
将基因组DNA稀释成一定浓度,保存在-20℃冰箱
中备用。
卢龙斗等:RAPD技术在石榴品种分类上的应用 635
果 树 学 报 24卷
图1 引物S66的RAPD扩增图谱
1~55为样品的编号见表1,M为DNA分子质量标准。下同。
Fig.1RAPDpaternsofprimerS66
1-55:NumberofsampleinTable1,M:DNAmarker.Thesamebelow.
引物
Primer
引物碱基序列
Primersequence
位点总数
Nl
多态性位点数
Npl
多态性位点比例
Ppl(%)
S62
S66
S67
S68
S228
S1304
S1309
S1311
S1440
S1500
S1501
S1507
S1510
S1512
S2085
总Total
平均Mean
5′GTGAGGCGTC3′
5′GAACGGACTC3′
5′GTCCCGACGA3′
5′TGGACCGGTG3′
5′AGGAGCGACA3′
5′AGGAGCGACA3′
5′ACTGGGTCGG3′
5′CTGCCACGAG3′
5′ACGGAAGTGG3′
5′CTCCGCACAG3′
5′CTACGGCTTC3′
5′CACAGACCTG3′
5′ACTGCCCGAC3′
5′CTCCCAGGGT3′
5′GGAACGCTAC3′
8
8
6
4
12
13
7
8
11
5
7
10
8
10
8
125
8.3
6
7
4
3
7
12
5
7
5
3
7
8
5
8
5
92
6.1
75.0
87.5
66.7
75.0
58.3
91.5
71.4
87.5
45.4
60.0
100.0
80.0
62.5
80.0
62.5
73.6
表2 RAPD引物序列及扩增结果
Table2RAPDprimersusedandtheiramplificationresults
1.2.2 随机引物的筛选 利用180条上海生工提供
的10碱基随机引物,进行PCR扩增,选择了品种间
存在多态性和扩增效果好的 15条引物用于模板扩
增。这些引物的编号及碱基序列见表2。
1.2.3 PCR及电泳 采用上海生工 10碱基引物,
天为时代公司的dNTP,宝赛公司的TaqDNA聚合
酶。反应在德国产的Eppendorf梯度PCR仪上进行。
反应体系为25μL,其中模板为50ng、Taq酶1.25u、
dNTP0.2mmol/L、引物 0.3μmol/L、MgCL22mmol/L。
扩增程序为 94℃预变性 5min;然后 94℃,30s;
36℃,45s;72℃,1.5min为1个循环,扩增 40个循
环,最后在72℃下延伸7min。扩增产物在质量分数
1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,电泳和凝胶用50×TAE
缓冲液,EB染色,而后在紫外灯下观察多态性,并用
Polaroid胶片拍照。
1.2.4 数据处理 以100bpDNA作分子质量对照,
有带记为1,无带记为0,获得0、1二元数据矩阵。用
TFPGA软件计算 55个石榴品种间的 Nei’s遗传距
离,并用UPGMA法构建聚类图。
2 结果与分析
2.1 DNA扩增结果
从 120条随机引物中筛选出 15条扩增条带较
多、信号强、背景清晰的引物。从全国各地采集的55
个石榴品种作为研究对象进行PCR扩增,共扩增出
125个位点,其中92个为多态性位点,多态性位点的
百分率为73.6%(表2),每条引物扩增条带数范围从
4~13。引物S66、S2085扩增的结果分别如图1、图2。
55545352 5150494847464544434241 3938373635343332313029M 2827262524232221201918171615141312111098 76 5 4 3 21M
注:Nl:位点数;Npl:多态性位点数;Ppl:多态性位点百分含量。
Note:Nl:No.oflocus;Npl:No.ofpolymorphiclocus;Ppl:percentageofpolymorphiclocus.
636
5期
图2 引物S2085的RAPD扩增图谱
Fig.2RAPDpaternsofprimerS2085
图3 55个石榴品种的UPGMA树状图
图中的数字与表1中的品种编码一致
Fig.3Dendrogramof55pomegranatecultivarsbyUPGMAmethod
ThenumberinthefigurearethesameasthoseinTable1
卢龙斗等:RAPD技术在石榴品种分类上的应用
2.2 品种聚类分析
根据RAPD多态性位点计算的遗传距离范围在
0.0889～0.9808(图3)。平均遗传距离0.300,其中3
与20之间的遗传距离最大为0.9808,它们的花色
都为红色,花型为单瓣;26与27之间的遗传距离最
小为 0.0889,它们的花色为红色,花型:26为重瓣,
27为单瓣。
依据遗传距离应用 UPGMA建立了 55个石榴
品种的聚类图(图3)。根据聚类图,在遗传距离4.0
处,将 55个石榴品种分为 4个类群(A、B、C、D)。其
中单瓣、花红色、果皮红色、味甜的临选 14号、净皮
甜、新大甜、临选1号可以划分为一类(D);单瓣、花
红色、果皮红色的江石榴 、小红皮酸和单瓣红色花、
果皮青色的玉石籽、薄皮糙、大青皮酸以及单瓣白
0.800 0.600 0.400 0.200 0.000
555453525150494847464544434241403938373635343332313029M 282726252423222118191817161514131211109 8 76 5 4 3 2 1 M
遗传距离Geneticdistance
26
27
24
3
2
9
29
30
38
32
25
28
36
39
55
12
17
1
47
48
52
50
54
53
45
33
37
41
42
35
40
44
34
7
46
15
19
11
51
4
5
10
49
43
6
8
13
16
14
18
31
20
21
22
23
A
C
D
B
637
果 树 学 报 24卷
花、果皮白色的白花、大粒三白甜划分为另一类
(C)。在这2个分类群中,它们的花都为单瓣花;单
瓣花的酸绿籽、甜绿籽、小青皮酸、临选 20号、大马
牙甜、乔黑果、白玉娘和花重萼的重萼黄石榴 、重萼
白花石榴 、重萼红花石榴 以及花重瓣的重瓣红石榴
划分为第三类(B),除上述 3类之外的其它可划分
为最后一类(A)。
3 讨 论
石榴作为果树在我国被广泛栽培,对品种分类
没有统一的方法[1]。中国园艺学家把石榴种下分为7
个变种,分别为月季石榴(P.granatumvar.nana)、墨
石榴(P.granatumvar.nigra)、白石榴(P.granatumvar.
albesoens)、重瓣红石榴(P.granatumvar.pleniflora)、
重瓣白石榴(P.granatumvar.multiplex)、玛瑙石榴(P.
granatumvar.legralei)和黄石榴 (P.granatumvar.
flavesens)[9-10];汪小飞等[11]认为石榴在栽培过程中形
成的应是品种群(cultivargroup)和品种(cultivar),而
并非变种,因此他根据瓣型不同将石榴品种分为4
个品种群,即单瓣品种群﹑复瓣品种群﹑重瓣品种群﹑
台阁品种群,然后品种群内可根据形态特征进行品
种分类。我们应用15个引物通过PCR扩增共检测
到了 92个多态性基因位点,多态性比率达到
73.6%,说明品种间有变异。Besse等 [12]、Obara-
Okeyo等[13]和Choi等[14]在兰花品种鉴定中得到了高
达90%的多态性,因此,为获得更高的多态性RAPD
标记和特征性条带,有必要增加引物的数量,同时使
用长一些的引物,如15碱基引物[15]。我们的研究中
有些品种之间的遗传距离相同并且花色和花型相
似,他们可能是同物异名。通过增加引物的数量可能
会筛选出某些特征性分子标记用于同物异名和同名
异物的品种鉴定。
根据聚类图,在遗传距离 4.0处,将 55个石榴
品种分为 4群(A、B、C、D),6、8、13、14、16、18、31共
7个品种均为单瓣花形成C群;D群中的20、21、22、
23也是单瓣花,它们的遗传背景相似,并且都是陕
西临潼的品种,23是在22品种中优选出来的,亲缘
关系比较近,聚在了一起;在 A群中除了重瓣红花
外,重瓣花都在此群之中,但花色有红、白、粉红等;
在 B群中也有各种颜色(红、白、黄)和花型(单瓣、
重瓣、重萼)的花而重萼花除了重萼粉红花外都在B
群内分布。若在遗传距离为3.0处可将55个品种分
为10个群,则所有的复瓣花12、53、55也分在一个
群中。根据汪小飞等[11]建立的形态分类标准,在A群
和B群中出现了特殊的品种,A群有重萼粉红花,B
群中有重瓣粉红花,他们没有分到应有的群中,这与
以花型作为分类标准相冲突,可能与石榴的长期栽
培导致的品种来源复杂有关。虽然这样,聚类结果表
明,复瓣花、重瓣花、重萼花的大多数品种间仍表现
出了较高的遗传相似性而聚在了一起,RAPD结果
与根据花型做的品种分类仍有一定的相关性。重瓣
红花、重萼黄花、重萼白花和重萼红花聚在了一起暗
示了它们的遗传背景的相似性。从瓣型分析,重瓣和
重萼品种聚合在一起说明它们在品种的形成上具有
共同起源的特性,如12、53、55为复瓣品种;2、9、29
均为重瓣品种;4、10、15、46为重瓣、重萼品种也分
别聚合在一起,显示出在品种形成时具有共同的背
景。从花色上分析,每群(除了C其群)中都有不同
的花色(白色、黑色、红色、粉红色),可见以花色对品
种进行分类,具有一定局限性,因性状的表达极易受
环境作用而不稳定,不能正确反映品种间的亲缘关
系。但可以作为群内的划分品种的一个参考[11]。从品
种的风味上看,D这一类群都是甜味的,与形态上将
果味作为分类标准相一致。但在C这一类群中出现
了不同,16和 18的花色为白色,果味为甜,但 2者
并没有聚在一起,14和18却聚在了一起。13、14和
8的花色都为红色、果皮也是红色、但味道不同,前2
者味酸后者味甜,聚在了一起。在A群中1、12、17、
47、52、53、54均为酸石榴品种,基本聚合在一起,但
在其中出现了48为甜石榴品种。B类群有11个品
种,7、51、49为酸石榴;19是酸甜石榴;5、11、43是
甜的,从聚类图上看到他们交叉分布没有什么规律。
RAPD分析结果也未完全支持酸、酸甜和甜3类的
品种划分方法[16-17],这可能与控制品种风味的遗传物
质差异不大有关。由上可见,分子标记与形态分类不
完全一致,依据形态分类有一定的局限性。形态容易
受到环境[18-19]以及长期引种、杂交、芽变等的影响[20],
而分子标记从遗传物质上进行研究,不易受到环境
的影响。
4 结 论
RAPD分子标记能够用于石榴栽培品种的多态
性分析,RAPD分析结果与根据花型所做的品种划
分有一定的相关性,而与根据花色和风味进行的分
类没有明显的相关性。在今后的研究工作中,应将包
括分子生物学技术在内的多种方法应用到石榴品种
的分类研究中,以期找到比较科学的分类方法。
638
5期
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卢龙斗等:RAPD技术在石榴品种分类上的应用
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