全 文 ：分子植物育种，2009年，第 7卷，第 5期，第 1021-1026页
Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.5, 1021-1026
新基因、新种质、新品种
New Gene & Germplasm
擎天凤梨泛素基因的克隆与序列分析
刘建新 * 沈福泉 张智 田丹青 葛亚英 沈晓岚 俞信英 王炜勇
浙江省农业科学院花卉研究开发中心,杭州, 311202
*通讯作者, ljxljx20002000@yahoo.com.cn
摘 要 鉴于泛素与植物受高温等环境胁迫下产生的一些诱导型蛋白降解有关，本研究根据擎天凤梨Ostara早期
花器的全长 cDNA文库，经大规模随机测序及重叠群(contigs)内 EST序列的拼接，获得了擎天凤梨多聚泛素基因全
长 cDNA序列(GenBank登录号: GQ890686)，序列长 1 896 bp，开放阅读框长 1 323 bp，编码 441个蛋白氨基
酸残基，蛋白质分子质量为 49.3kD，等电点 pI为 6.59。蛋白二级结构预测显示，该蛋白主要由随机卷曲、延伸链、α
螺旋和 β-转角组成；系统进化树分析表明与拟南芥推定的多聚泛素UBQ10(gi|23397122|gb|AAN31845.1|)亲缘关
系最近；经推断它是由 5个单体泛素组成的多聚泛素。本研究有助于进一步探讨该基因在低温胁迫下的反应
机理以及如何采用分子调控手段增强擎天凤梨的耐低温能力。
关键词 擎天凤梨,泛素,克隆,序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Ubiquitin Gene from Guzmania
Liu Jianxin * Shen Fuquan Zhangzhi TianDanqing GeYaying ShenXiaolan YuXinying WangWeiyong
Research & Development Centre of Flower, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, 311202
* Corresponding author, ljxljx20002000@yahoo.com.cn
DOI: 10.3969/mpb.007.001021
Abstract Whereas ubiquitin was concerned with degradation of induced protein which were produced under ad-
verse surroundings such as high-temperature, based on floral organ full length cDNA library constructed success-
fully in Guzmania ostara, we obtained full length cDNA sequence of ubiquitin gene by random sequencing on a
large scale and EST sequences assembly in a congtig (GenBank accession No. GQ890686). The cDNA sequence
consisted of 1 896 bp and had an open reading frame (ORF) of 1 323 bp which encoded a protein of 441 amino
acids residues, while the estimated molecular weight and isoelectric point of the putative protein were 49.3 kD and
6.59, respectively. Prediction of the secondary structure of the protein showed that, the protien was composed of
random coil, extend strand, alpha helix and beta turn, as well as the ubiquitin gene was most near to putative
polyubiquitin UBQ10 (gi|23397122|gb|AAN 31845.1|) in Arabidopsis thaliana based on phylogenetic tree analysis.
In this research, we deduced that the ubiquitin gene obtained in guzmania should be polyubiquitin gene which was
composed of five moner ubiquitins. The research was benefitial to the further discussion for exploring reaction
mechanism of ubiquitin gene in low temperature stress surroundings and finding molecular regulation methods of
enhancing anti-low temperature ability of guzmania.
Keywords Guzmania (Guzmania Ruiz & Pav), Ubiquitin, Clone, Sequence analysis
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.007.001021
基金项目：本研究由浙江省科技厅面上项目(2008C22011)和浙江省农业科学院博士科研启动费项目共同资助
擎天凤梨是我国花卉市场上十分流行的高档盆
栽花卉，原产于美洲的热带和亚热带地区，对环境温
度要求较高。我国绝大部分地区气温低于擎天凤梨
原产地，因而十分有必要对其进行以抗寒性为主的
抗逆育种研究。
泛素几乎存在于所有的真核生物中，它是一种高
度保守的小分子球蛋白，分子量为 8.6 kD，由 76个氨
基酸组成(黄海杰和陈雄庭, 2008)。泛素编码基因大致
可分为多聚泛素基因和 C-末端延伸泛素基因两大类，
基本上以融合基因形式存在(Jentsch et al., 1991)。多聚
泛素基因产物主要参与泛素 /26S蛋白酶体途径中的
蛋白质水解，C-末端延伸泛素基因表达所产生的泛素
单体常以分子伴侣形式参与核糖体的组装(王红梅和
祝诚, 2002)。高等植物在高温、干旱、冷害和光辐射等
(侯学文和郭勇, 1998; OMahony and Oliver, 1999)环境
胁迫下会产生诱导蛋白，这些蛋白随逆境消失而被降
解，泛素在这些蛋白的降解过程中起了十分重要的作
用(Von Kampen et al., 1995; Genschik et al., 1992)。泛
素依赖的蛋白质降解途径 (ubiquitin-dependent prote-
olytic pathway)是目前已知最重要的，并且具有高度选
择性的蛋白质降解途径，称为泛素 /26S蛋白酶体通
路或 Ub途径(郭启芳等, 2004;徐晨曦等, 2007)。它通
过降解不正常蛋白或调节功能蛋白质的周转，实现对
多种代谢过程的调节(朱经春等, 1999)。
本研究以擎天凤梨 Ostara为材料，克隆多聚泛
素基因并对其进行序列分析，为进一步探索该基因
在低温胁迫下的反应作用机理以及采用分子调控手
段增强擎天凤梨的耐低温能力打下基础。
1材料与方法
以笔者构建成功的擎天凤梨 Ostara早期花器官
cDNA全长文库(SMART技术,质粒型文库,构建过
程及分析结果另文发表)为材料，随机挑取 2 004个单
克隆送往杭州华大基因研发中心测序，除去载体污
染，然后对高质量序列用 Phrap程序(本地 Linux/Unix
运算服务器,由华大基因提供服务)进行聚类以及拼
接，聚类后获得了重叠群(contigs) 175条、单条序列
(singlet) 1 195个，对重叠群(contigs)内的 EST序列进
行拼接和组装，获得部分基因的全长 cDNA序列，
泛素基因是其中之一，由此获得了泛素基因的全长
cDNA序列。然后将 cDNA序列进行 BlastN的同源
比对以及与其它物种对应基因的多序列比对分析，
以进一步验证序列组装的正确性以及全长序列的完
全性。最后采用生物信息学方法如 BlastN、BlastP、
ExPASy、ProtParam、SPOMA、Find conserved domains
(NCBI)、ClustalW2软件等对其 cDNA序列、氨基酸
序列的特征以及亲缘关系进行了分析。
2结果与分析
2.1泛素基因全长 cDNA序列的获得
经过对 EST序列的大规模测序、拼接及分析后，
获得了同属于一个重叠群的 8 个泛素相关 EST 序
列，将其进行拼接、组装及验证后获得了 1 896 bp的
全长 cDNA 序列，ORF 长度为 1 323 bp，位于第
281~1 603个碱基之间，可翻译成含 441个氨基酸残
基的蛋白质(图 1)。GenBank登录号为 GQ890686。
2.2 泛素基因的生物信息学分析
2.2.1全长 cDNA及氨基酸序列的 Blast分析
将获得的擎天凤梨泛素基因全长 cDNA 序列
与GenBank/DDBL/EMBL 数据库进行核酸同源性
(BlastN)比对，发现与水稻 (Oryza sativa)、玉米 (Zea
mays)、小果野蕉(Musa acuminata)、黑线仓鼠(Cricetu－
lus griseus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、巴西利什曼
虫(Leishmania braziliensis)和大西洋鲑(Salmo salar)等
的泛素基因有较高的同源性。其中与与水稻的多聚泛
素基因 rub1 (X76064.1)一致性最高，达到 90%。将推
断出的 441个蛋白氨基酸序列与蛋白质数据库进行
氨基酸序列同源性(BlastP)比对，结果表明，与豌豆的
泛素基因(gb|AAD03343.1|)一致性最高，达到 99%。
2.2.2推定蛋白氨基酸的特征分析
对推定的氨基酸序列进行 ProtParam预测，可知
蛋白质的相对分子质量为 49.3 kD，等电点 pI 为
6.59。采用 SPOMA进行二级结构预测，实验结果表明
推定蛋白的二级结构主要由随机卷曲(random coil,
39.00%)、延伸链(extend strand, 30.84%)、α 螺旋(alpha
helix, 18.14%)和 β-转角(beta turn, 12.02%)组成。在
NCBI上进行利用 Specialized Blast工具进行保守区
分析，发现包含有 6个保守区：UBQ superfamily和 5
个 Specific hits：Ubiquitin (其中每个都包括 Ubq-E2,
Ubq-UCH, Ubq-CUE作用位点) (图 2)。
2.2.3分子系统树分析
将推定的氨基酸序列与已报道的其它物种泛素氨
基酸序列进行在线 ClustalW2生成分子系统树(图 3)。
实验结果显示，擎天凤梨Ostata的泛素与拟南芥的推
定的多聚泛素 UBQ10 (gi|23397122|gb|AAN31845.1|)
明显聚为一类，推定两者的亲缘关系最为接近。
3讨论
本试验获得的多聚泛素基因的开放阅读框长度
为 1 323 bp，氨基酸 441个，接近单体泛素的 5倍多
(单体泛素长度为 76个氨基酸)，从图 2中的保守区分
析可知，该多聚泛素基因是由泛素单体以头尾相连形
式组成的多聚泛素基因(5个单体泛素)，与 Genschik
等(1994)从烟草中获得的五串子泛素类似。5个完整
擎天凤梨泛素基因的克隆与序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Ubiquitin Gene from Guzmania 1022
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 1泛素基因的 mRNA序列及推定氨基酸序列
Figure 1 mRNA sequence and putative amino acid sequence of ubiquitin gene
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.0010211023
单体都是由 76个氨基酸残基组成，这与很多其它物
种中发现的泛素氨基酸数目是一致的，但将 5个完
整单体氨基酸序列进行多序列比对可发现：第 3个
单体与其余 4个单体仅有一个氨基酸的差异，即第 3
个单体中的第 39个氨基酸由天冬氨酸(D: Asp)变成
了谷氨酸(E: Glu) (图 4)；但将这 5个单体进行核苷
酸多序列比对，可发现 5个单体中对应碱基不完全
一致的地方有 25处(图 5)，说明泛素基因在进化过
程中核苷酸的变异程度远高于氨基酸，但由于兼并
密码子的存在而使得蛋白氨基酸的保守性更高，该
结论与前人在其它物种上的研究结果相一致(陆小平
等, 2006)。
多聚泛素基因是泛素编码基因中的一种，有重
复排列的多个单体泛素基因序列。受环境胁迫等不
利因素的影响，这些泛素基因的表达量会大量增加
(Vijay-Kumar et al., 1987; Pickart, 2000)。根据 Von
Kampen等(1995)的研究报道，4℃处理衣藻后，多聚
泛素基因的 mRNA量增加了 7 倍之多。Gindin 和
Borochov (1992)的研究证明，3℃低温条件下处理大
青属(Clerodendrum speciosun)植物后导致多聚泛素
基因大量表达，其原因在于补充细胞内游离泛素的
不足；此外结合型泛肽数量增加了约 5倍，其中的大
部分与膜蛋白发生结合而导致膜蛋白数量降低了
80%以上。Lee和 Goldberg (1998)研究认为：受逆境
影响而产生的诱导型蛋白为短命蛋白，它们在完成
生物学功能后便通过泛素 /26S蛋白酶体通路途径降
解，以消除这些异常蛋白在体内大量积累可能产生
的不良影响。在擎天凤梨中，泛素相关的研究鲜有报
道，泛素基因表达与低温胁迫间的相互关系及作用
机理将是笔者下一步的研究方向。
图 2泛素基因氨基酸序列的保守区
Figure 2 Conservative domain of ubiquitin amino acid sequence
图 3泛素推定氨基酸序列的分子进化分析
Figure 3 Molecular evolution analysis in putative amino acid se-
quence of ubiquitin
擎天凤梨泛素基因的克隆与序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Ubiquitin Gene from Guzmania 1024
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
参考文献
Guo Q.F., Zou Q., and Wang W., 2004, Physiological function of
plant ubiquitin/26S proteasome pathway and its molecular
biology, Zhiwu Shenglixue Tongxun (Plant Physiology Com-
munications), 40(5): 533-539 (郭启芳,邹琦,王玮, 2004,植
物泛素 /26S蛋白酶体通路的生理功能和分子生物学,植
物生理学通讯, 40(5): 533-539)
Genschik P., Marbach J., Uze M., Feuerman M., Plesse B., and
Fleck J., 1994, Structure and promoter activity of a stress
and developmentally regulated polyubiquitin encoding gene
of Nicotiana tabacum, Gene, 148(2): 195-202
Genschik P., Parmentietr Y., Durr A., Marbach J., Criqui M.C.,
Jamet E., and Fleck J., 1992, Ubiquitin genes are differentially
expressed in protoplast-derived cultures ofNiaotiana sylvestris
and in response to various stresses, Plant Mol. Biol., 20:
图 4多聚泛素中 5个单体组分蛋白序列比对
Figure 4 Alignment of amino acid sequences on five monomers of polyubiqutin
图 5多聚泛素 5个单体组分核苷酸序列比对
Figure 5 Alignment of nucleotide sequences on five monomers of polyubiqutin
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.0010211025
897-910
Gindin E., and Borochov A., 1992, Ubiquitin conjugation to p
rotein increases following chilling of Clerodendrum leaves,
Plant Physiol., 100(3): 1392-1395
Hou X.W., and Guo Y., 1998, Ubiquitin and responses of plant to
stree, Zhiwu Shenglixue Tongxun (Plant Physiology Commu-
nications), 34(6): 474-478 (侯学文, 郭勇, 1998, 泛肽与植
物逆境响应,植物生理学通讯, 34(6): 474-478)
Huang H.J., and Chen X.T., 2008, The progress on the ubiquitin
26S proteasome pathway in plants, Zhongguo Shengwu
Gongcheng Zazhi (China Biotechnology), 28(7): 127-132 (黄
海杰,陈雄庭, 2008,植物泛素 /26S蛋白酶体途径研究进
展,中国生物工程杂志, 28(7): 127-132)
Jentsch S., SeufertW., and Hauserh P., 1991, Genetic analysis of the
ubiquitin system, Biochem. Biophys. Acta., 1089(2): 127-139
Lee D.H., and Goldberg A.L., 1998, Proteasome inhibitors: valu-
able new tools for cell biologists, Trends Cell Biol., 8(10):
397-403
Lu X.P., Xiao J., Chen Z.K., Wang L.F., and Lou C.F., 2006,
Cloning and sequence analysis of poly ubiquitin gene from
mulberry, Morusmonglicas, Canye Kexue (Acta Sericologica
Sinica), 32(3): 301-306 (陆小平,肖靓,陈正凯,王利芬,楼
程富, 2006,桑树多聚泛素基因的克隆及序列分析,蚕业
科学, 32(3): 301-306)
OMahony P.J., and Oliver M.J., 1999, The involvement of ubiq-
uitin in vegetative desiccation tolerance, Plant Molecular Bi-
ology, 41(5): 657-667
Pickart C.M., 2000, Ubiquitin in chains, Trends Biochem Sci-
ence, 25(11): 544-548
Vijay-Kumar S., Bugg C.E., Wilkinson K.D., Vierstra, R.D., Hat-
field P.M., and Cook W.J., 1987, Comparison of the three-
dimeusional structures of yeast and oat ubiquitin with hu-
man ubiquitin, J. Biol. Chem., 262(13): 6396-6399
Von Kampen J., Nielander U., and Wettern M., 1995, Expression
of ubiquitin genes in Chlamydomonas reinhardtii involve-
ment in stress response and cell cycle, Planta, 197 (3):
528-534
Wang H.M., and Zhu C., 2002, Ubiquitin proteasome pathway in
reproductive tissues, Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli
Jinzhan (Progress in Biochemistry and Biophysics), 29(1):
31-34 (王红梅, 祝诚, 2002, 泛素——蛋白水解酶复合体
通路在生殖系统中的研究进展,生物化学与生物物理进
展, 29(1): 31-34)
Xu C.X., Jiang J., Liu T.T., Wang Y.C., Liu G.F., and Yang C.P.,
2007, Sequence analysis and function determination of E2s
gene from Tamarix androssowii, Dongbei Linye Daxue Xue-
bao (Journal of Northeast Forestry University), 35(11): 1-4
(徐晨曦,姜静,刘甜甜,王玉成,刘桂丰,杨传平, 2007,柽
柳泛素结合酶基因(E2s)的序列分析及功能验证,东北林
业大学学报, 35(11): 1-4)
Zhu J.C., Wang T., and Chen K.C., 1999, Components and func-
tions of the ubiquitin system (Ⅰ)—components, recognition
of substrates and protein ubiquitination, Zhiwuxue Tongbao
(Chinese Bulletin of Botany), 16(3): 208-218 (朱经春,王台,
陈克成, 1999,泛肽系统的组成和功能 (一)——系统组成、
底物识别与蛋白质泛肽化,植物学通报, 16(3): 208-218)
擎天凤梨泛素基因的克隆与序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Ubiquitin Gene from Guzmania 1026