全 文 ：华北农学报·2014，29(6) :58 -62
收稿日期:2014 － 09 － 09
基金项目:国家自然科学基金项目(31070180;31270254) ;黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD201408)
作者简介:张梅娟(1982 －) ，女，山东海阳人，在读博士，主要从事苔藓植物分子生物学方面的研究。
通讯作者:沙 伟(1963 －) ，女，黑龙江齐齐哈尔人，教授，博士，博士生导师，主要从事苔藓植物遗传学和分子生物学研究。
doi:10． 7668 /hbnxb． 2014． 06． 011
毛尖紫萼藓类泛素蛋白基因的克隆与表达分析
张梅娟1，沙 伟1，2，刘 博2，安洪雪2，宋 璐2
(1．东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040;2．齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘要:为研究类泛素蛋白基因在苔藓植物中的生物学功能，从毛尖紫萼藓干旱 cDNA文库中获得了类泛素蛋白基
因 cDNA全长序列，命名为 Gp-UBL5。该基因 cDNA全长 471 bp，包含 1个 222 bp的完整开放阅读框，编码 73 个氨基酸
组成的蛋白。生物信息学分析表明，Gp-UBL5基因编码蛋白分子质量为 8． 525 kDa，等电点为 7． 84，为稳定型蛋白。进化
分析显示，该编码蛋白与二穗短柄草、大麦等类泛素蛋白具有较高一致性，达 96% ～ 99%。实时荧光定量 PCＲ 结果表
明，Gp-UBL5基因在复水和快速干旱的各个时期均有表达，推测该基因可能在毛尖紫萼藓的抗旱机制中发挥作用。
关键词:毛尖紫萼藓;类泛素蛋白基因(Gp-UBL5);基因克隆;实时荧光定量 PCＲ
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2014)06 － 0058 － 05
Cloning and Expression Analysis of Ubiquitin-like Protien
Gene in Grimmia pilifera
ZHANG Mei-juan1，SHA Wei1，2，LIU Bo2，AN Hong-xue2，SONG Lu2
(1． College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China;
2． College of Life Science and Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China)
Abstract:In order to study biological function of ubiquitin-like protein(UBL)in bryophytes，A full-length cD-
NA sequence of ubiquitin-like protein (UBL)gene was obtained from Grimmia pilifera cDNA library，named Gp-
UBL5． The full length of Gp-UBL5 was 471 bp，contained a 222 bp open reading frame(OＲF) ，and encoding a pro-
tein with 73 amino acids． Bioinformatics analysis suggested that this protein was a stable protein with a calculated
molecular mass of 8． 525 kDa and a theoretical pI of 7． 84． Phylogenetic analysis indicated that Gp-UBL5 protein
had 96% to 99% identities with other UBL5 proteins from different species，such as Brachypodium distachyon and
Hordeum vulgare． The qＲT-PCＲ result showed that Gp-UBL5 gene could express in rehydration and dehydration． It
was speculated that the gene might play an important role in response to drought． These results provided important
information for the further study of functional verification．
Key words:Grimmia pilifera;Ubiquitin-like protien gene (Gp-UBL5) ;Gene clone;Ｒeal-time qPCＲ
自然界中，蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白
就没有生命。生物体内存在成千上万的蛋白，细胞
可通过调控蛋白的合成和降解来完成生物体正常的
生长过程。蛋白合成的转录和翻译过程一直是生物
学领域研究的热点，而蛋白的降解直到近几十年才
引起重视［1］。细胞内蛋白的降解是一个复杂的过
程，而在此过程中扮演重要角色的一个成员就是泛
素(Ubiquitin)。泛素是真核生物中广泛存在的一类
具有 76 个氨基酸残基的高度保守的小蛋白，在动植
物、藻类和酵母中仅有 1 ～ 3 个氨基酸差异，主要功
能是标记生物体内需要分解掉的蛋白质，使其被水
解，避免异常蛋白过多积累对生物体造成伤害［2 － 4］。
泛素-26S蛋白酶体降解途径是已知的最重要的蛋
白质降解途径［1，5］，细胞内 80% ～ 90%的蛋白通过
此途径降解掉［1，6］。研究发现，在干旱、高温、寒冷
及重金属胁迫等逆境下，各种异常蛋白急剧增加，而
泛素-蛋白酶体系统与这些蛋白的降解关系密
切［7 － 8］。
随着对泛素研究的深入，一些类泛素蛋白
(Ubiquitin-like protein，UBL)也相继被发现，如 1 型
6 期 张梅娟等:毛尖紫萼藓类泛素蛋白基因的克隆与表达分析 59
泛素相似修饰物(Ubiquitin-like modifiers，UBLs) ，2
型 UBLs 和 UBL5［9］。UBL5 最早发现于视觉疾病
中，该基因编码一种 73 个氨基酸组成的蛋白，分子
质量为 8． 5 kDa，等电点为 8． 6［10］。虽然其氨基酸
序列与泛素的相似性较差，低于 25%，但有着与泛
素和类泛素蛋白相同的三维核心结构 － β 抓握折
叠［11 － 13］。UBL5 的 C端有双酪氨酸花式，不同于泛
素和其他类泛素蛋白的保守的双甘氨酸花式。目前
已在许多物种中发现了 UBL5 基因的同源基因，被
命名为 BEACON或 HUB1［9］。有研究提出，UBL5 具
有单泛素化 H2B、参与 mＲNA前体剪接及调节能量
代谢等生物功能［9，14 － 15］，但具体功能还不完全清
楚。UBL5 是否与植物的抗旱性有关不得而知，目
前也未见任何报道。因此，从苔藓植物毛尖紫萼藓
(Grimmia pilifera)中克隆类泛素蛋白基因 UBL5，通
过分子生物学技术初步研究其与抗旱性的关系具有
重要意义。
毛尖紫萼藓属紫萼藓科(Grimmiaceae)紫萼藓
属(Grimmia)，为典型的小型耐旱藓类植物，体内蕴
藏着巨大的耐旱基因资源。齐齐哈尔大学遗传学实
验室在前期构建的毛尖紫萼藓干旱 cDNA文库中发
现一个 EST 序列(GenBank 登录号:GＲ307993． 1)，
与类泛素蛋白基因有较高的同源性。本研究利用
PCＲ技术从毛尖紫萼藓中克隆了类泛素蛋白基因
的 cDNA 全长序列，进行了生物信息学分析，并对其
在复水和快速干旱处理下的表达特性进行分析，以
期推测其功能，为进一步研究毛尖紫萼藓的耐旱机
制提供理论依据，并为植物抗逆境胁迫育种提供新
的基因资源。
1 材料和方法
1． 1 试验材料及处理方法
试验所用材料为 2009 年采自黑龙江省五大连
池风景区石龙的毛尖紫萼藓。
将保存于标本馆的毛尖紫萼藓材料取出，分两
部分处理:一部分提取总 ＲNA，用于 Gp-UBL5 基因
的克隆;另一部分按照沙伟等［16］的方法进行处理，
并提取总 ＲNA，用于实时荧光定量 PCＲ 分析。总
ＲNA提取方法为改良的 SDS 法［16］，根据 Invitrogen
公司的 M-MLV 逆转录酶说明，取总 ＲNA 2 μg，以
Oligo(dT)13为引物进行逆转录，合成 cDNA第一链。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 Gp-UBL5 基因克隆 从毛尖紫萼藓干旱
cDNA文库中获得的与类泛素蛋白基因有较高同源
性的 EST序列，含有完整的开放阅读框(OＲF) ，故
设计 特 异 引 物 Gp-UBL5-F (5-TGTCGCTGCTAT
CTCGTTCC-3)和 Gp-UBL5-Ｒ(5-CTCACAGGCAGA
GTAAGGGTAG-3) ，利用 PCＲ技术扩增毛尖紫萼藓
类泛素蛋白基因编码区，命名为 Gp-UBL5。PCＲ 扩
增条件如下:预变性 94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃
30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环;72 ℃ 10 min。扩增的
目的片段按照上海生工公司的胶回收试剂盒说明进
行回收，连接到 pMD18-T 克隆载体上(TaKaＲa)。
转化大肠杆菌 DH5α，挑取阳性菌落，经 PCＲ鉴定送
北京华大基因测序。
1． 2． 2 Gp-UBL5 基因的生物信息学分析 利用
ProtParam、ProtScale、SignalP 4． 1、PSOＲT Prediction
和 SOPMA等一系列软件工具对 Gp-UBL5 基因编码
的氨基酸序列进行一级结构和二级结构的预测;采
用 NCBI中的 BlastX和 Conserved Domains对蛋白序
列进行同源性比对和结构域预测;采用 MEGA 5. 0
软件构建系统进化树。
1． 2． 3 Gp-UBL5 基因的实时荧光定量 PCＲ 分析
根据 Gp-UBL5 基因全长 cDNA 序列，按照荧光定量
PCＲ引物设计要求设计引物 Gp-UBL5-qF(5-TAAC
GACAGGTTGGGAAAGAAG-3)和 Gp-UBL5-qＲ(5-
ACCATCGTGAATTTCGTAGTCC-3)。同时以毛尖紫
萼藓 18S rＲNA 为内参基因，引物为 18S-F(5-TTG
ACGGAAGGGCACCA-3)和 18S-Ｒ(5-ACCACCAC
CCATAGAATCAAGAA-3)。
荧光定量 PCＲ反应按照 SsoFastTM EvaGreen Su-
per mix试剂盒说明书提供的方法进行。在 PCＲ 管
中依次加入 10 μL SsoFast EvaGreen Supermix(2 ×) ，
0． 8 μL(10 μmol /L)上游引物，0． 8 μL(10 μmol /L)
下游引物，2 μL 稀释的 cDNA，无菌水补至 20 μL。
扩增反应于 CFX-96 实时荧光定量 PCＲ 仪(Bio-
Ｒad)上进行。扩增条件为:95 ℃ 20 s;95 ℃ 10 s，
58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40 个循环;每个循环结束后采
集荧光信号，溶解曲线分析温度为 65 ℃到 95 ℃，每
升高 0． 5 ℃保温 5 s。采用 2 － ΔΔCt法计算 Gp-UBL5 基
因的相对表达量。每个样品重复 3次，并做阴性对照。
2 结果与分析
2． 1 Gp-UBL5 基因的克隆及序列分析
对毛尖紫萼藓干旱 cDNA 文库进行测序，获得
1 条与类泛素蛋白基因有较高同源性的 EST 序列。
根据该序列设计特异引物进行克隆、测序，获得 1 条
471 bp的全长 cDNA 序列(图 1) ，含有 1 个 222 bp
的开放阅读框，编码 73 个氨基酸。5非编码区长为
143 bp，3非编码区长为 106 bp(图 2)。
60 华 北 农 学 报 29 卷
M． DL2000。
图 1 Gp-UBL5 基因 PCＲ扩增
Fig． 1 PCＲ amplication of Gp-UBL5 gene
Protparam软件预测分析发现，Gp-UBL5 基因编
码的蛋白分子量是 8． 525 kDa，等电点 pI 为 7． 84;
正电荷氨基酸(Arg + Lys)总数为 12，负电荷氨基酸
(Asp + Glu)总数为 11;不稳定系数为 20． 72，属稳定
型蛋白(＜ 40 蛋白稳定)，脂肪系数为 97． 40。用
SignalP 4． 1 和 ProtScale 软件预测 Gp-UBL5 蛋白无
信号肽且为亲水性蛋白。PSOＲT Prediction 软件预
测该蛋白定位于细胞质和细胞核。通过 Conserved
Domains对该蛋白进行预测，发现其具有典型的
UBQ结构域，属于泛素超家族(图 3)。SOPMA软件
进行蛋白质二级结构预测表明，该蛋白由 α-螺旋、β-折
叠和无规则卷曲组成，其中 α-螺旋占 19． 18%、β-折叠
占 39． 73%、无规则卷曲占 41． 09%。
方框代表起始密码子;圆圈代表终止密码子。
Frame． Initiator codon;Ｒound． Terminator codon．
图 2 Gp-UBL5 基因核苷酸及编码蛋白的氨基酸序列
Fig． 2 Nucleotide and amino acid sequence of Gp-UBL5
图 3 Gp-UBL5 蛋白功能域预测
Fig． 3 Domains prediction of Gp-UBL5 protein
2． 2 Gp-UBL5 蛋白的同源序列比对和系统进化树
分析
将 Gp-UBL5 基因在 NCBI 中进行 BlastX 比对，
发现该基因编码的氨基酸序列与多种其他植物的
UBL5 蛋白序列具有较高相似性。选取 12 种其他植
物的 UBL5 蛋白与 Gp-UBL5 蛋白进行多序列比对
(图 4)，结果显示:Gp-UBL5 蛋白与二穗短柄草
(Brachypodium distachyon)序列的一致性最高，达到
99%;与小立碗藓 (Physcomitrella patens)、可可
(Theobroma cacao)、芜萍(Wolffia australiana)、琴叶
拟南芥(Arabidopsis lyrata)、黄瓜(Cucumis sativus)、
拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大
麦(Hordeum vulgare)、麻风树(Jatropha curcas)、野
茶树(Camellia sinensis)和蒺藜苜蓿(Medicago trun-
catula)一致性也为 96% ～ 97%。Gp-UBL5 与其他
植物的类泛素蛋白在蛋白质水平上表现较高的相似
性，说明类泛素蛋白基因家族在植物中具有高度的
保守性。
图 4 Gp-UBL5 与其他植物的类泛素蛋白的多序列比对
Fig． 4 Multiple alignment of Gp-UBL5 protein and proteins of other plants
为进一步研究植物类泛素蛋白的进化关系，将
这 13 种植物的 UBL5 蛋白构建系统进化树进行分
析。从图 5 可以看出，以上物种聚为两类，毛尖紫萼
藓与二穗短柄草、小立碗藓、可可、芜萍、琴叶拟南
6 期 张梅娟等:毛尖紫萼藓类泛素蛋白基因的克隆与表达分析 61
芥、黄瓜、拟南芥和玉米聚为一类，说明 UBL5 蛋白
在这些物种的进化过程中相当保守;大麦、麻风树、
野茶树和蒺藜苜蓿聚为一类，推测 UBL5 蛋白在不
同的物种中是由不同的分子进化途径产生的。
图 5 Gp-UBL5 与其他植物 UBL5 蛋白的系统进化树分析
Fig． 5 Phylogenetic tree analysis of Gp-UBL5
and other known UBL5 proteins
2． 3 Gp-UBL5 基因的表达分析
利用 qＲT-PCＲ 分析发现，毛尖紫萼藓 Gp-UBL5
基因在不同复水和干旱时间中有不同的表达模式。
在复水和快速干旱的各个时期，Gp-UBL5 基因均有
表达，但在不同时间下有所差异。复水 1，3，12 h 以
及 48 ～ 120 h时，表达量相对于 CK(复水 144 h，表
达量定义为 1)是上调的;复水 6，24 h 时，表达量相
对于 CK是下调的，表达受到抑制。在复水过程中
(图 6-A)，Gp-UBL5 基因的表达量呈现高-低-高-低
的总体趋势，复水 1 h 的表达量最高，为 CK 的
27. 47 倍，随着复水时间的延长，表达量逐渐降低，
复水24 h达到了最低点，48，72，120 h时基因的表
图 6 Gp-UBL5 基因在复水(A)和
快速干旱(B)后的相对表达量
Fig． 6 The relative expression of Gp-UBL5
under rehydration (A)and quick dehydration (B)
达量与 CK 相当，但在复水 96 h 时表达量大幅度提
高，为 CK的 16． 91 倍。在硅胶快速干旱处理过程
中(图 6-B)，干旱 10 min 时 Gp-UBL 基因的表达量
升高，当干旱 20，30 min时，表达量与 CK相当，但在
干旱 1 h时表达量下调，说明表达受到抑制。
3 讨论
类泛素蛋白 UBL5 广泛分布于真核生物中，在
系统发生中非常保守。目前，植物中有关该基因功
能研究的报道较少，且多是有关拟南芥的研究，主要
涉及根和叶的生长、开花诱导、种子休眠和抗病性等
方面［17 － 21］，还未见在植物耐旱性方面的报道。所以
从具有耐旱性的植物中克隆类泛素蛋白基因，进一
步研究这一类基因在逆境胁迫下的功能显得非常重
要。本研究从耐旱植物毛尖紫萼藓中分离克隆得到
类泛素蛋白基因 Gp-UBL5。用 ProtParam软件预测，
结果显示 Gp-UBL5 基因编码的蛋白分子量为 8． 525
kDa，与视觉疾病中 UBL5 基因的分子量相近［10］;含
有 1 个保守的 UBQ 结构域，属于泛素超家族成员，
这与前人的观点相一致［11 － 13］。
泛素是一种逆境响应蛋白，许多逆境条件(如
干旱)都会诱导泛素相关基因的表达，使其发挥作
用［1］。Kiyosue等［22］从拟南芥中克隆得到类似于泛
素的 EＲD 基因，在干旱条件下被诱导表达。Ko
等［23］从拟南芥中鉴定出泛素连接酶基因 XEＲICO，
在干旱胁迫下，该基因过表达植株中 ABA含量明显
升高，说明 XEＲICO基因可能通过介导 ABA来正调
控植物响应干旱胁迫。宁约瑟等［24］对鉴定出的泛
素连接酶 E3(SCF 复合体、U-box 及 ＲING-finger 等
类型)参与植物的干旱胁迫调控过程进行了综述。
UBL修饰途径与泛素化修饰途径类似，参与 UBL修
饰途径的酶虽然各不相同，但在进化上都与参与泛
素化途径的酶具有相关性［8］。因此，初步推断 UBL
修饰途径相关酶类在干旱胁迫发生时也会参与植物
的胁迫调控过程。苔藓植物中，有关泛素在逆境响
应方面的研究甚少。有报道指出［1］，山墙藓(Tortula
ruralis)中有 1 种 1． 3 kb的泛素转录产物，在缓慢和
快速失水时都能增加，但再水化时只在快速失水的
组织中增加，此现象与其他复水因子的转录产物积
累状况恰恰相反，说明快速失水对山墙藓细胞的伤
害较严重。Chen 等［25］在山墙藓中克隆得到泛素
26S蛋白酶体的亚基基因 TrＲpt2，ＲNA 印迹杂交分
析表明，该基因在干旱和复水过程中均能连续表达。
沙伟等［26］从毛尖紫萼藓中克隆得到泛素延伸蛋白
基因，进行了序列分析，为进一步研究在苔藓植物中
62 华 北 农 学 报 29 卷
的抗非生物胁迫方面的功能提供了理论依据。本研
究中，复水和快速干旱处理后，Gp-UBL5 基因的表达
量发生明显变化，既有表达量大幅度提高的阶段，也
有表达被抑制的阶段，可能是该基因在清除一些异
常蛋白对植物体进行修复，因此，推测 Gp-UBL5 基因
可能参与了毛尖紫萼藓抗旱过程并发挥调控作用。
为进一步研究 Gp-UBL5 基因与毛尖紫萼藓抗旱
反应的关系及其参与的调控机制，现已将其遗传转化
模式植物烟草，并通过对转基因烟草进行验证，来推
断该基因是否能提高其耐旱能力具有重要的意义。
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