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2008 年 第 53 卷 第 8 期: 904 ~ 907


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《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS 论 文
一氧化氮对拟南芥保卫细胞内向钾通道的作用
薛绍武①②, 杨频②*, 何奕昆①*
① 首都师范大学生命科学学院, 北京 100037;
② 山西大学分子科学研究所, 化学生物学与分子工程教育部重点实验室, 太原 030006
* 联系人, E-mail: yhe@mail.cnu.edu.cn; yangpin@sxu.edu.cn
2007-12-10收稿, 2008-03-18接受
国家自然科学基金(批准号: 20701028)资助项目

摘要 研究了一氧化氮(NO)对拟南芥保卫细胞内向钾通道的作用. 当细胞内液不含钙的
络合剂 EGTA(Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)时, NO抑制
内向钾通道电流; 当细胞内液含有 EGTA时, NO对内向钾通道电流没有明显作用. NO还
抑制拟南芥叶片气孔的开放; 当 NO 和 EGTA 共同处理叶片时, 气孔开放与对照相比不
受抑制. 先前有报道 NO 能激活保卫细胞质膜钙通道. 由此推测, NO 通过激活质膜钙通
道引起胞内钙含量升高, 从而抑制内向钾通道电流, 抑制气孔开放.
关键词
内向钾通道
一氧化氮
胞质钙
气孔


一氧化氮(NO)是一种自由基气体分子 , 在动物
中作为信号分子在神经传递、免疫和细胞毒性等方面
有大量的研究报道[1]. 很多的研究表明一氧化氮在植
物的发育、胁迫反应和细胞程序性死亡等方面发挥作
用[2,3]. 在植物中, NO信号和 cGMP、cADP核糖、钙、
水杨酸和蛋白质激酶等有关 , 而且和活性氧信号有
很多对话和交叠[4].
气孔是由一对保卫细胞包围形成的孔 , 大多数
的高等植物的表皮上都存在气孔 . 气孔的开放和关
闭是由保卫细胞的膨压和体积控制的 , 而后者是由
渗透性的物质包括氯化钾和其它的钾盐进入细胞(气
孔张开)和流出细胞(气孔关闭)控制的. 很多研究表
明 , 保卫细胞离子通道调节气孔开闭发挥着重要作
用 [5~7]. 气孔张开时 , 内向钾通道开放 , 钾离子进入
细胞 [8]. 当内向钾通道电流受到抑制时气孔开度减
小[9], 说明内向钾电流在气孔开放过程中起着重要作
用[7,10,11]. 在蚕豆中, 有 NO 调节离子通道的报道[12].
而在拟南芥中, 由于其保卫细胞很小, 对其离子通道
的研究远没有对蚕豆保卫细胞研究的透彻 . 至今未
有 NO调节拟南芥保卫细胞离子通道的报道. 而且不
同植物细胞的反应机制也不相同, 脱落酸(ABA)对拟
南芥和蚕豆的离子通道的调节机制就不同 [13,14]. 本
文应用膜片钳技术研究了 NO 对拟南芥保卫细胞内
向钾通道的作用机制.
1 材料与方法
(ⅰ) 拟南芥保卫细胞的分离. 参照文献[14,15]
方法, 取 4~6周龄的拟南芥植物的叶片分离保卫细胞
原生质体. 取两片叶在 4℃冰水中用搅碎器打 3 次,
每次 20 s, 用 393 μm 的尼龙网过滤, 将表皮条置于
10毫升的酶液, 放在水浴摇床(60 r/min)中酶解 16 h.
酶解完成后过滤离心 , 保存在冰浴中用于膜片钳实
验. 酶解溶液的成分: 1.3%纤维素酶 R-10, 0.7%离析
酶, 0.5% BSA, 0.5 mol/L D-mannitol, 0.1 mmol/L KCl,
0.1 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L ascorbic acid, 0.1%
kanamycin sulfate, 用 Tris调 pH 5.5.
(ⅱ) 数据采集和分析. 采用膜片钳全细胞方式
记录电流信号[16]. 在带显微操作系统的倒置显微镜上
用放大器(Axopatch-200B, 美国 Axon 公司)进行质膜
离子通道电流记录 . 当玻璃微电极尖端与细胞膜形
成高电阻封接(电阻大于 10 GΩ)时, 对电极内腔加负
压可形成膜片钳全细胞(whole cell)记录方式 [17]. 在
封接前后分别调整快慢电容补偿以抵消各部分电容.
测试时保持电位为−40 mV, 刺激电压从−180 mV 逐




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级去极化到 0 mV, 每级为+20 mV, 持续时间为 4 s,
频率为 0.2 Hz. 电流信号由 Axopatch-200B膜片钳放
大器(美国 Axon 公司)、Lab Master 数据采集卡和
PCLAMP9.0软件(美国Axon公司)采集原始数据输入
储存到计算机, 利用 Clampfit9.0 和 Origin5.0 对数据
进行分析. 整个记录过程在 20~25℃下进行.
(ⅲ) 溶液组成. 细胞内液 1: 30 mmol/L KCl, 70
mmol/L K-glutamate, 2 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L
HEPES, 5 mmol/L MgATP, pH 7.1, 用 D-sorbitol调节
渗透浓度为 510 mmol/kg. 细胞内液 2: 30 mmol/L
KCl, 70 mmol/L K-glutamate, 2 mmol/L MgCl2, 10
mmol/L HEPES, 5 mmol/L MgATP, 3.35 mmol/L CaCl2,
6.7 mmol/L EGTA, pH 7.1. 内液 2的 Ca2+游离浓度用
络合软件计算结果为 0.2 μmol/L. 细胞外液 : 30
mmol/L KCl, 40 mmol/L CaCl2, 2 mmol/L MgCl2, 10
mmol/L MES, pH5.5, 用 D-sorbitol 调节渗透浓度为
485 mmol/kg.
(ⅳ) 气孔开度分析. 实验取相同叶龄和大小的
叶片分析. 取气孔关闭的叶片置于溶液中(5 mmol/L
KCl, 10 mmol/L Mes-KOH, 50 μmol/L CaCl2, pH 6.15).
溶液加入 100 μmol/L SNP (Sodium nitroprusside, NO
释放剂)观察对气孔开放的影响 . 叶片在光照(光强
150 pmol·m−2·s−l) 2 h后观察气孔开度. 取不同处理
的叶片用搅碎器搅碎, 尼龙网过滤, 置于载玻片上在
显微镜 (TE2000-U, Nikon, Tokyo)下用数码相机
(model DXM-1200F; Nikon, Tokyo)拍照 . 用软件
(Scion Image; Scion Corporation, Frederick, MD; and
National lnstitutes of Health, Bethesda, MD)测量气孔
开度. N = 90每个处理. 数据分析和 t检验用Microsoft
Excel software (version 5.0; Microsoft Corporation, Red-
wood, CA).
2 结果
2.1 NO抑制保卫细胞内向钾电流
在拟南芥保卫细胞原生质体上 , 膜电位保持在
−40 mV, 给一系列跃迁电位(0~−180 mV, 每级 20 mV,
可以激活内向钾通道电流(图 1(a)). SNP是 NO的供体.
在细胞外液中加入 100 μmol/L SNP 后, 钾电流受到
明显的抑制(图 1(b)). 图 1(c)表示 NO 作用前后内向
钾电流的电压-电流关系曲线变化.
2.2 胞内钙被络合后内向钾电流不受 NO抑制
细胞内液中加入 3.35 mmol/L Ca2+和 6.7 mmol/L
EGTA, 此时细胞内游离Ca2+浓度为 0.2 μmol/L. 我们
用细胞内液 2观察 NO对内向钾电流的影响. 图 2(a)和

图 1 NO抑制拟南芥保卫细胞内向钾电流
(a) 拟南芥保卫细胞内向钾电流; (b) 细胞外液加入 100 μmol/L SNP
后的内向钾电流; (c) 100 μmol/L SNP处理前(■, n = 6)和处理后(●, n
= 7)内向钾电流的电压-电流变化曲线. 图中电流使用细胞内液 1记
录. 箭头表示电流零点

图 2 细胞内钙络合后, NO对拟南芥保卫细胞内向钾电流
抑制作用消失
(a) 拟南芥保卫细胞内向钾电流; (b) 细胞外液加入 100 μmol/L
SNP后的内向钾电流; (c) 100 μmol/L SNP处理前(■, n = 6)和处理
后(●, n = 9)内向钾电流的电压-电流变化曲线. 图中电流使用细胞
内液 2记录. 箭头表示电流零点

图 2(b)表示 NO作用前后内向钾电流的变化, 结果表明
此时内向钾电流不受 NO 抑制. 图 2(c) 表明胞内低钙
时 NO作用前后内向钾电流的电压-电流关系曲线.
2.3 NO抑制气孔开放
同时观察了 NO 对拟南芥气孔开放的影响. 图 3



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图 3 NO抑制拟南芥气孔开放
100 μmol/L SNP抑制气孔开放; 2 mmol/L EGTA和 100 μmol/L
SNP共同处理与对照相比则气孔开放不受抑制

表明, 100 μmol/L SNP能够抑制气孔的开放. 当溶液
中加入 2 mmol/L EGTA和 100 μmol/L SNP时, 与对
照相比, 气孔开放不受抑制. 对照组气孔开度为(1.34
±0.11) μm, NO处理组气孔开度为(1.08±0.08) μm;
NO和 EGTA共同处理组气孔开度为(1.30±0.12) μm.
3 讨论
近年来有关植物中一氧化氮的研究较多 [18~20],
但研究其对植物离子通道作用的还较少 . 目前只有
NO 对蚕豆保卫细胞离子通道作用的报道[12]. 由于拟
南芥保卫细胞很小 , 对其离子通道的研究要远少于
蚕豆保卫细胞. 本文研究了 NO对拟南芥保卫细胞内
向钾通道的作用.
先前的研究表明, 细胞内钙含量升高可以抑制内
向钾通道电流[21,22]. 当细胞内不含 EGTA 时, NO 抑制
了内向钾电流; 当细胞内含有 EGTA时, 内向钾电流不
受NO的抑制作用. 这说明, NO对内向钾电流的作用需
要胞内钙的参与, NO 可以引起胞内钙升高, 这与文献
报道[12]结果一致. NO 对内向钾电流的作用和脱落酸
(ABA)的作用有些相似, 当胞内钙被 EGTA 络合时,
ABA对内向钾电流没有作用[14]; 当胞内不含 EGTA时,
ABA抑制了内向钾电流[23]. 而且NO也参与ABA的信
号[24,25]. 这提示, 钙是 ABA和 NO的下游信号.
NO可以引发豌豆、蚕豆、鸭趾草和拟南芥等植
物气孔关闭[3,24~26]. 而且钙参与了 NO 对气孔关闭的
调控 [27]. 虽然气孔开放和关闭决定气孔大小, 但是
NO 对气孔开放的影响却研究的较少. 近来有报道,
NO 在蓝光照下, 抑制蚕豆气孔的开放[28]. 本实验发
现, NO能够抑制拟南芥气孔的开放; 当 NO和 EGTA
共同作用时, 气孔开放与对照相比不受影响. 这说明
胞外钙参与了这一过程. 有报道, NO 可以激活保卫
细胞的质膜钙通道[29,30]. 因此我们推测, NO 通过激
活钙通道引起胞内钙升高 . 细胞内的钙升高除了由
细胞外流入以外还可能由细胞内的钙库释放 , 我们
不能排除细胞内钙库是否参与了 NO信号.
总之, NO 通过引起细胞内的钙升高抑制内向钾
电流, 从而抑制气孔开放.
致谢 感谢杜克大学裴真明教授和山西师范大学刘维仲博士对本实验的帮助.
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