全 文 ：第 39 卷　第 2 期
2011 年 2 月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of No rthwest A&F Univer sity(Nat.Sci.Ed.) Vo l.39 No.2Feb.2011
蒺藜苜蓿小 G蛋白MtROP5对拟南芥角果及
侧器官发育的影响＊
衣　娜1 ,刘　伟2 ,谢亚均1 ,粟有志1 ,李　冠1
(1 新疆大学 生命科学与技术学院 ,新疆 乌鲁木齐 830046;2 石河子大学 农学院 ,新疆 石河子 832000)
[ 摘　要] 　【目的】利用拟南芥异源表达 MtROP 基因并研究其功能 , 为蒺藜苜蓿中 Mt ROP 蛋白的功能研究 ,
及进一步探索 Mt ROP 蛋白在蒺藜苜蓿和微生物共生互作过程中的作用提供理论依据。【方法】利用同源克隆方法
获得了蒺藜苜蓿(Medicago tructula)中与拟南芥 AtROP5高度同源的 ROP 蛋白基因 MtROP5 , 用 MtROP5 表达载体
转化拟南芥并严格筛选转化植株 ,观察 T 2 代转化植株角果 、侧枝分叉 、簇毛等器官的表型 , 并结合启动子-GUS 、GFP、
RT-PC R等试验手段 ,研究 MtROP5 的组织表达特性及其对各种激素的应答反应 ,通过拟南芥异源表达 MtROP5 对
其功能进行研究。【结果】与对照相比 , 过表达 CA-MtROP5(Constitute activity MtROP5 , CA-MtROP 5)、MtROP5、
GFP-MtROP 5 的拟南芥植株的角果变短 , 而角果数目相应增加。过表达 CA-MtROP 5植株角果的顶端具有较多花粉
管 ,DN-MtROP 5(Dominant negativ e MtROP5 , DN-MtROP 5)及 MtROP5 转化植株的花粉管则较早凋亡。过表达
CA-MtROP 5 、DN-MtROP 5 植株的侧生器官及花序的极性发生改变 ,转化 CA-MtROP5 和 MtROP5 的转基因拟南芥
的簇毛分支数目增加。启动子-GUS 及 GF P-MtROP 5 的表达模式表明 , 该基因在叶脉 、花药 、下胚轴 、气孔及簇毛等
部位特异表达。 RT-PC R及启动子-GUS 表达分析表明 ,生长激素可诱导该基因的上调表达。【结论】MtROP5 在果
实及侧器官的极性发育中具有较为重要的作用 ,可能参与了生长素相关途径的调控。
[ 关键词] 　蒺藜苜蓿;MtROP5;角果;侧器官
[ 中图分类号] 　Q943.2 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2011)02-0162-09
Effects of over-expression of a Medicago truncatula small G protein
MtROP5 on the development of silique and
lateral organ in Arabidopsis thaliana
YI N a
1 , LIU Wei2 ,XIE Ya-jun1 , SU You-zhi1 , LI Guan1
(1 Co llege o f Li f e Science and Technolog y , X in j ian g Univer sity ,Urumqi , X in j ian g 830046 , Ch ina;
2 Col lege o f Ag ricul ture , Shihez i Universi ty , Shihez i , X in j ian g 832000 , China)
Abstract:【Objective】T he objective w as to study the function o f ROP(Rho G TPase o f plant)gene in
Medicago truncatula by transfo rming various constructs into Arabidopsis thal iana to provide theoretical
basis for further investigation of the function of ROP gene in M.truncatula and the function of M tROP
gene in the process of symbiotic interaction betw een host legume plant and rhizobium.【Method】One small
G pro tein w hich has high homolo gy w ith A tROP5 was cloned by using the pathw ay of homologus cloning
in M.t runcatula , and w as named MtROP 5.The funct ion of MtROP5 w as studied by transforming i t into
Arabidopsis.【Result】Results show ed that ov er-expression of CA-MtROP 5(Const itute activi ty MtROP5 ,
CA-MtROP 5),MtROP5 , GFP-MtROP 5 can sho rten the leng th of silique o f Arabidopsis , and the stigma of
＊ [ 收稿日期] 　2010-06-10
[ 基金项目] 　新疆维吾尔族自治区高技术研究发展计划项目(200711102)
[ 作者简介] 　衣　娜(1985-),女 ,新疆乌鲁木齐人 ,在读硕士 ,主要从事植物生物技术研究。 E-mail:yinadeyouxiang@126.com
[ 通信作者] 　李　冠(1949-),男 ,湖北黄陂人 ,教授 ,硕士 ,博士生导师 ,主要从事植物生理生化与分子生物学研究。
E-m ail:gu anli@xju.edu.cn
plants transformed w ith CA-MtROP 5 has mo re po llen tubes than that t ransfo rmed w i th vecto r , DN-
MtROP 5(Dominant negat ive MtROP5 ,DN-MtROP 5)and MtROP5.The polari ty of lateral o rgan and an-
tho taxy and the polarity of t richome change af ter t ransfo rmation w ith various construnct ion of MtROP5.
The expression pat tern of the promoter of MtROP5 fused G US and GFP-MtROP 5 show ed that MtROP5 is
the speci fic expression in vein , anther ,hypocotyl , stoma and trichome.The analy sis of RT-PCR and the pro-
moter of MtROP5 fused G US af ter t reated wi th various plant hormone show ed that the expression of
MtROP 5 is up regulated by auxin.【Conclusion】MtROP5 play s a crit ical ro le in silique and lateral organ
development , and may be involved in the regulation o f auxin signal pathw ay.
Key words:Med icago truncatula;MtROP5;silique;late ral org an
　　小G TPase 蛋白在真核生物酵母 、哺乳动物 、植
物中广泛存在 ,并形成一个较大的超家族 ,其成员可
以通过在激活和失活形式间的不断转换来行使功
能 ,即结合 G TP 时具有活性(Constitute activi ty ,
CA),当 GTP 水解为 GDP 时为非活性状态(Dom i-
nant negat ive ,DN)。它们具有调节细胞的众多功
能 ,如信号转导 、细胞增殖 、细胞骨架重组和基因表
达等 。在酵母和哺乳动物中 ,该超家族从结构上至
少可以分为 Ras 、Rho 、Rab 、Ar f/Sar1 和 Ran 5 个
族。植物存在 Rho 、Rab 、Ar f/Sar1 、Ran 的同源序
列而没有Ras 的同源序列[ 1] ,但植物进化出了一类
与 RHO 相关的蛋白 , 命名为 ROPs(RHO-related
G TPase f rom plants)。目前 ,拟南芥有 11 个 、水稻
有 7 个 、玉米有 9 个 ROPs 被报道[ 2] 。研究表明 ,
ROPs 参与植物的生长和发育等途径的调控 ,如在
细胞极性建立 、细胞发育与分化 、激素传导以及在各
种生物 、非生物胁迫中起关键的调控作用[ 3-4] 。
近些年来 , ROP 蛋白在植物中参与各种信号通
路调节的功能研究已成为众多的研究热点之一 ,其
中关于 ROP 蛋白功能研究的最大进展是对拟南芥
花粉管和根毛极性生长的研究 。研究表明 ,拟南芥
花粉管中特异表达的 A tROP1 、AtROP 3 、AtROP5
基因编码同源性较高的蛋白 ,均在花粉管生长起始
位点的顶端区域表达 ,并且参与了花粉管极性发育
的调控[ 5-6] 。激活形式的 AtROP1 和 AtROP5 不仅
能在空间上调控花粉管的极性生长 ,而且也能在不
同的时间阶段动态调节花粉管的生长[ 7] 。与花粉管
类似 ,根毛的极性生长过程也受到 AtROP2、AtROP4
和 AtROP6 的调控[ 8-9] 。 AtROP 也定位在根毛起始
形成的极性位点 ,而且在根毛生长的过程中于其顶端
持续表达 ,表明 ROP 在根毛的起始阶段到伸长阶段
中都具有非常重要的作用。此外 ,还有研究表明 , At-
ROP 参与了激素的调控[ 8] 。在豆科植物与根瘤菌的
共生互作过程中 ,激素 、根毛的极性生长对共生互作
前期的信号传导起到了非常重要的作用 ,但是在豆科
植物中关于 ROP 的研究还比较少。蒺藜苜蓿(Medi-
cago tructula)是研究豆科植物与根瘤菌的一种模式
植物 ,生物信息学研究预测 MtROP 可能参与了共生
途径的调控[ 10] ,但目前对于 ROP蛋白如何参与共生
途径的信号调节还不是很清楚 。鉴于 ROP 蛋白在植
物体内的特殊地位 ,以及在根毛的极性发育及其与激
素在共生互作过程中的重要作用 ,研究蒺藜苜蓿 ROP
蛋白的功能具有重要的理论意义。
本研究在 MtROP5 基因的克隆及表达载体构
建完成的基础上[ 11] ,用MtROP5 的各种表达载体转
化拟南芥并严格筛选转化植株 ,观察 T 2 代转化植
株角果 、侧枝分叉 、簇毛等器官的表型 ,并结合启动
子-GUS 、GFP 、 RT-PCR 等 试验 手段 , 研 究了
MtROP5 的组织表达特性及其对各种激素的应答反
应 ,以期通过拟南芥异源表达MtROP5 来初步研究
其功能 ,为后续研究 M tROP5 蛋白在蒺藜苜蓿中的
功能奠定理论基础 ,同时也为进一步探索 M tROP
蛋白在蒺藜苜蓿和微生物共生过程中的作用提供理
论依据 。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1 　供试植物与菌株 　供试植物蒺藜苜蓿
(M.truncatula)CV Jemalong A17种子 、拟南芥(Ara-
bidopsis thaliana)哥伦比亚生态型种子及供试菌株根
癌农杆菌 GV3101 、大肠杆菌 DH5α,均由中国科学院
上海生命科学研究院植物生理生态研究所提供。
1.1.2 　供试植物表达载体 　pCAMBIA2301 、
pRNAi 、pA7-GFP 、pCAMBIA 2300S 载体 ,均由中
国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所
提供。
1.1.3　主要试剂　总 RNA 提取试剂 RNAgent?
Denaturing so lution ,购自美国 Promaga 公司;DNA
163第 2 期 衣　娜 ,等:蒺藜苜蓿小 G 蛋白 Mt ROP5 对拟南芥角果及侧器官发育的影响
Marker DL2000 和 DNA Hind Ⅲ酶 、T4 DNA 连接
酶 、 rTaq DNA 聚 合 酶 、 AMV 反 转 录 酶 、
O lig o(dT)18 、RNA 酶抑制剂 、pMD18-T 载体及限
制性内切酶 Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ ,均购自宝生物工
程(大连)有限公司;KOD plus DNA 聚合酶 ,购自日
本 TO YOBO 公司;质粒抽提试剂盒和胶回收(小
量)试剂盒 ,购自北京博大泰克生物技术有限公司;
其他均为国产分析纯级试剂。
1.2　基因克隆及载体构建
蒺藜苜蓿 MtROP5 的克隆及表达载体的引物
和构建方法已经在另文中发表 ,具体参考文献[ 11-
12] 。RT-PCR使用的引物见表 1 。
表 1　RT-PCR使用的引物及其序列
Table 1　P rime r and sequence used in RT-PCR
引物名称
Primer n ame
引物序列(5′-3′)
Primer sequence (5′-3′)
MtROP5RT-PCR-F T TCTCAT TT TCT CACGCTCCT
MtROP5RT-PCR-R TGCT T TCT TGTGGGTGT ATCT
MtActin2RT-PCR-F TGGCATCACTCAGT ACCT TTCAACAG
MtActin2RT-PCR-R ACCCAAAGCATCAAA TAAT AAG TCAAC
1.3　拟南芥的转化及筛选
利用冻融法将 MtROP5 的各种表达载体转化
进入根癌农杆菌 GV3101 ,花粉管介导拟南芥的转
化及筛选参考文献[ 13] 。T 2 代植株与 T 1 代筛选使
用的抗生素质量浓度(卡那霉素 50 μg/mL ,潮霉素
75 μg/mL)相同。
1.4　拟南芥角果长度及密度的统计
将抗性平板上的转基因拟南芥 T 2 代植株 ,转
移至含饱和 PNS 营养液的土盆中(V(珍珠岩)∶
V(蛭石)=1∶3)培养 ,45 d 后进行统计。角果长度
测量时 ,以第 1 个拟南芥角果为起点 ,以第 10 个角
果为终点 ,每棵植株共测量 10 个角果的长度 ,每个
表达载体转化系统计 15 棵苗。角果密度以 15 cm
内的角果数目表示 ,角果数目统计时 ,以每棵植株的
第 1 个角果为计数起点 ,至 15 cm 处终止 ,统计该区
间内的角果数目 ,每个表达载体转化系统计 15 棵
苗。统计数据利用 EXCEL 软件进行处理。
1.5　拟南芥柱头及花序的观察
待转基因拟南芥 T 2 植株的角果长到 0.5 cm
时 ,取每个表达载体转化植株的 15 个角果于解剖显
微镜(NIKON , Japan)下观察并照相 。
待转基因拟南芥 T2 植株主花序抽薹至 15 cm
时 ,观察花序及侧枝的极性并照相 。
1.6　拟南芥簇毛的观察
待转基因拟南芥长到 5 片真叶时 ,取刚长出来
的倒数第 3 片真叶用于簇毛的观察 ,并分别于光学
显微镜(OLYMPUS , America)和解剖显微镜(NI-
KON , Japan)下观察并照相。
1.7　GUS 染色及绿色荧光蛋白的观察
转化植株的 GUS 活性染色参照 Jef fe rson
等[ 14] 的方法进行 ,将 GUS 染色后的材料置于光学
显微镜(OLYMPUS , America)和解剖显微镜(NI-
KON , Japan)下观察并照相。
将带有绿色荧光蛋白的植株在 488 nm 波长的
激发波下 ,于荧光显微镜(BA-400 , Germany)下观
察荧光在转化植株器官中的分布情况并照相 。
1.8　MtROP 5的表达模式分析
取 MtROP 5启动子启动 GUS 的转基因拟南芥
T 2 植株 ,分别于幼苗(10 d 左右)、苗期(20 d 左右)、
花期(35 d)前后 ,取幼苗 、叶片 、花及角果于 GUS 染
液中染色(参考 1.7 部分)并照相。
1.9　蒺藜苜蓿总 RNA 的提取及 MtROP5基因对
激素的反应
1.9.1　蒺藜苜蓿总 RNA 的提取　参照 Promaga
公司的 RNAgent? Denaturing so lution 试剂操作说
明书 ,提取蒺藜苜蓿根系的总 RNA 。利用紫外分光
光度计检测总 RNA 的质量 ,用 8 g/L 琼脂糖凝胶
电泳检测 RNA 的完整性。
1.9.2　MtROP5的 RT-PCR　以蒺藜苜蓿总 RNA
反转录合成的 cDNA 第 1 链为模板 ,用 rTaq DNA
聚合酶进行 RT-PCR 检测 。扩增 MtROP5 基因的
RT-PCR 引物(MtROP5RT-PCR-F 、MtROP5RT-
PCR-R)和扩增 MtActin2 基因的 RT-PCR 引物
(Mt Actin 2RT-PCR-F 、MtActin2RT-PCR-R)如表1
所示。PCR反应体系为 25 μL:10×Buf fer 2.5 μL ,
dN TPs(2.5 mmol/L)2 μL , cDNA 模板 1 μL ,上 、
下游引物(MtROP5RT-PCR-F 、MtROP5RT-PCR-
R 及MtActin2RT-PCR-F 、MtAct in 2RT-PCR-R ,浓
度为 20 mmol/L)各 0.5 μL , rTaq DNA 聚合酶(5
U/μL)0.25 μL ,无菌水补足 25 μL 。反应条件为:
94 ℃预变性 5 min;94 ℃30 s ,55 ℃30 s;72 ℃30
s(MtROP5 基因扩增 30 个循环 ,MtAct in2 基因扩
增 25 个循环), 72 ℃延伸 10 min。取 PCR 产物 ,用
15 g/ L 琼脂糖凝胶进行电泳检测 。
1.9.3　生长激素对 MtROP5的诱导表达　取蒺藜
苜蓿种子 ,用体积分数 75%乙醇灭菌 5 min ,再用体
积分数 20%次氯酸钠水溶液灭菌 20 min ,无菌水清
洗 5 ～ 7 次 。然后将消毒后的种子播于 FM 培养基
上[ 15] ,于 25 ℃的光照培养箱(16 h 光照 , 8 h 黑暗)
164 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 39 卷
中培养至幼苗高约 3 cm 时 ,移至含有终浓度为 1
μmol/mL ABA 、1 μmol/mL 6-BA 、0.5 μmol/mL
NAA 、0.5 μmol/mL IAA 、1 μmol/mL ACC 、0.5
μmol/mL AVG 或 1 μmo l/mL GA 等生长激素的
FM 培养基上 ,于 25 ℃的光照培养箱(16 h 光照 ,8
h 黑暗)中培养 24 h 后用于 RT-PCR。
1.9.4　IAA 对MtROP5的诱导表达　按文献[ 13]
的方法 ,于 MS 平板上种植转化 pMtROP5∷GUS
的拟南芥 T 2 代植株 ,待长至 2 ～ 3 cm 时 ,分别移至
含 1 ,2.5 ,5 , 10 μg/mL IAA 的无抗 MS 平板上继续
培养 ,于 24 , 48 h 后取材用于 GUS 染色 ,并拍照。
2　结果与分析
2.1　MtROP 5过表达对拟南芥角果发育的影响
图 1 和图 2-A 表明 , 过表达 CA-MtROP 5 、
MtROP5 、GFP-MtROP 5 的拟南芥植株的角果长度
较对照和过表达 DN-MtROP 5 的拟南芥植株短 ,其
中过表达MtROP5 、GFP-MtROP 5 的拟南芥植株的
角果长度居于过表达 CA-MtROP 5 、DN-MtROP 5
的拟南芥植株之间。
图 1　转基因拟南芥角果的表型
A、F.对照;B 、G.35S∷CA-MtROP 5;C 、H.35S∷DN-MtROP 5;D、I.35S∷MtROP5;E 、J.35S∷GFP-MtROP 5;标尺=1 cm
Fig.1　The silique pheno type of v arious constructions tr ansfo rmed plants
A , F.CK;B , G.35S∷CA-MtROP 5;C , H .35S∷DN-MtROP 5;D , I;35S∷MtROP 5;E , J.35S∷GFP-MtROP5;Bar=1 cm
　　通过统计以第 1 个角果为起点至 15 cm 之间的
角果数目 ,发现各过表达处理之间也具有较大的差
异(图 2-B)。其中以过表达 CA-MtROP 5 的拟南芥
植株的角果密度最大 , 过表达 MtROP5 、GFP-
MtROP 5 植株的角果密度较对照植株大 ,而过表达
DN-MtROP 5 植株的角果密度最小 ,但与对照相比
无明显差异 。可见 ,在拟南芥中过表达MtROP5 基
因 ,对拟南芥角果的正常发育有一定影响 。
图 2　转基因拟南芥角果长度和角果密度的比较
A.角果长度(n=40, P<0.01);B.角果密度(n=150 , P<0.01);＊＊.差异极显著
Fig.2　Comparison o f silique length and density between Arabidopsis transformed with MtROP5
A.Si lique length(n=40 , P<0.01;B.Silique densi ty (n=150 , P<0.01)), ＊＊.Ex t remely signifi cant dif ferences
2.2　MtROP5过表达对拟南芥柱头发育的影响
转化植株的育性分析结果表明 , 转化 CA-
MtROP 5 的拟南芥植株几乎不育 ,仅有少数角果有
种子产生 ,而转化 DN-MtROP 5 、GFP-MtROP 5 和
165第 2 期 衣　娜 ,等:蒺藜苜蓿小 G 蛋白 Mt ROP5 对拟南芥角果及侧器官发育的影响
MtROP 5的拟南芥均可以正常结籽。小 G 蛋白
ROP 可以调控花粉管的极性发育 , 由此推测 CA-
MtROP 5可能通过作用于花粉管而影响植株的正常
受精 。通过对转基因植株角果顶端的观察 ,发现过
表达 CA-MtROP 5 植株的柱头具有较多的花粉管
(图 3-C 、D),对照植株(图 3-A 、B)虽也有花粉管结
构 ,但其长度较 CA-MtROP 5 短(图 3-C 、D),而转化
DN-MtROP 5 、MtROP5 植株角果顶端的花粉管则
出现凋亡现象(图 3-E ～ H)。这可能是由于 CA-
MtROP 5 的过量表达 ,使萌发花粉管不能定向延伸 ,
从而导致植株不能正常受精 ,使其育性降低。
图 3　各种转基因拟南芥的柱头发育表型
A 、B.对照;C 、D.35S∷CA-MtROP 5;E 、F.35S∷MtROP 5;G 、H .35S∷DN-MtROP 5;标尺=0.5 mm
Fig.3　Development phenotype of plants stigma tr ansfo rmed w ith va rious construction
A , B.Cont rol;C , D.35S∷CA-MtROP 5;E , F.35S∷MtROP5;G , H .35S∷DN-MtROP 5 , Bar=0.5 mm
2.3　MtROP 5过表达对拟南芥花序及侧器官生长
极性的影响
由图 4 可以看出 ,过表达MtROP5 改变了拟南
芥角果在花序轴上的排列顺序及侧枝的生长极性。
对照植株的角果以互生的方式排列于花序轴上(图
4-A),过表达 CA-MtROP 5 、MtROP5 植株的角果均
出现了对生现象(图 4-B 、D),在转化 DN-MtROP 5
和MtROP 5的植株上出现了 2 个角果生长在同一
位点的现象(图 4-C 、D)。对照植株的角果以等间距
排列于花序轴上(图 4-A),而转化 MtROP5 各种表
达载体的拟南芥植株 ,角果均毫无规律地排列于花
序轴上 ,且角果之间的间距相差很大(图 4-B ～ E)。
　　过表达 MtROP5 可以改变拟南芥侧枝的生长
极性 。由图 4可知 ,对照植株的侧枝以互生为主(图
4-F),而转化 CA-MtROP 5 和 DN-MtROP 5 的植株
分别出现了 2个侧枝生长在同 1 个位点以及对生现
象(图 4-G 、H);转化 DN-MtROP 5的植株在侧枝对
生的地方出现了角果(图 4-H);转化 MtROP5 、
GFP-MtROP 5 植株的侧枝则与对照植株无明显差
异(图 4-I 、J)。
图 4　各种转基因拟南芥花序(A～ E)及侧枝(F ～ J)的表型
A 、F.对照;B 、G.35S∷CA-MtROP 5;
C 、H .35S∷DN-MtROP 5;D 、I.35S∷MtROP5;
E 、J.35S∷GFP-MtROP 5;标尺=1 cm
F ig.4　Antho ta xy(A-E)and branch point(F-J)
pheno type of va rious construction tr ansfo rmed plants
A , F.Cont rol;B , G.35S∷CA-MtROP 5;
C , H .35S∷DN-MtROP 5;D , I.35S∷MtROP5;
E , J.35S∷GFP-MtROP 5;Bar=1 cm
166 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 39 卷
2.4　MtROP5过表达对拟南芥簇毛发育的影响
簇毛是拟南芥表皮上的一种单细胞管状结构 ,极
性生长是维持其正常分支的重要方式。鉴于 ROP 蛋
白在极性调控中的重要作用 ,本研究观察了过表达
MtROP5 植株的簇毛发育情况 , 结果表明 ,MtROP5
对拟南芥簇毛的极性生长有一定影响 。由图 5 可见 ,
对照植株的成熟簇毛多为 3 个分支 ,很少出现其他分
支形式(图 5-A 、F),而转化 CA-MtROP5 、MtROP5 、
GFP-MtROP5 植株的簇毛出现4 和2 个分支的现象 ,
转化DN-MtROP 5植株的簇毛以 2 个分支居多(图 5-
B ～ E ,G ～ J),说明 MtROP5 的过表达使拟南芥簇毛
的分支数目有所增加。
图 5　各转基因拟南芥簇毛的表型
A 、F.对照;B 、G.35S∷CA-MtROP 5;C 、H .35S∷DN-MtROP 5;D、I.35S∷MtROP5;E 、J.35S∷GFP-MtROP 5
Fig.5　T richome pheno type of va rious construction t ransfo rmed plants
A , F.Cont rol;B ,G.35S∷CA-MtROP 5;C , H .35S∷DN-MtROP 5;D , I.35S∷MtROP 5;E , J.35S∷GFP-MtROP 5
2.5　MtROP5在拟南芥组织中的表达模式
对蒺藜苜蓿组织特异性表达的分析发现 ,
MtROP 5在茎 、花等部位的表达量较高 ,在根和叶中
的表达量相对较低 。为了进一步探明 MtROP 5 的
组织表达特异性 ,特对拟南芥植株各组织部位 GUS
基因的表达情况进行了检测 ,结果表明 ,MtROP5 在
叶片和下胚轴的表达量较高 ,在根部的表达量较对
照低(图 6-A ～ C ,D ～ F),在叶脉 、气孔 、簇毛等部位
特异表达(图 6-D 、J 、K);另外还发现 ,其在雄蕊中的
表达量较高 , 而在雌蕊中的表达量较低(图 6-G 、
H);而且MtROP 5仅在角果的顶端表达 ,在角果壁
及种子中的表达量较低(图 6-I)。
图 6　MtROP5 在拟南芥组织中的特异表达
A～ C.35S∷GUS ,其中 A 为全植株 , B 为放大的叶 ,C 为放大的根;D ～ K.pMtROP 5∷GUS ,其中 D 为放大的叶 ,
E 为放大的根 , F 为全植株 ,G 为花朵 , H 为雄蕊 , I 为角果 , J 为气孔 , K 为簇毛
Fig.6　T issue expre ssion pattern o f MtROP5 in Arabi dopsis
A-C.35S∷GUS , the A w as w hole plant , B w as am plifi ed leaf ,C w as amp lified root;D-K:pMtROP 5∷GUS , the D was
am plifi ed leaf , E w as am plifi ed root , F w as w hole plan t , G was f low er , H w as stam en , I w as si lique , J w as stom a , K w as t rich ome
167第 2 期 衣　娜 ,等:蒺藜苜蓿小 G 蛋白 Mt ROP5 对拟南芥角果及侧器官发育的影响
　　用载体 35S∷GFP-MtROP5 转化拟南芥发现 ,
MtROP5 在拟南芥簇毛中的表达量较高(图7-A 、B)。
图 7　MtROP5 融合 GFP 在拟南芥簇毛中的定位
A.35S∷GFP;B.35S∷GFP-MtROP 5;标尺=0.1 mm
Fig.7　Location o f MtROP5 fused w ith GFP
in Arabidopsis trichome
A.35S∷GFP;B.35S∷GFP-MtROP 5;Bar=0.1 mm
　　由此可见 ,MtROP5在植株地上部分具有极性生
长特性的部位特异表达 ,结合拟南芥的转化表型 ,推
断该基因在极性发育中具有较为重要的调控作用 。
2.6　生长激素对MtROP5的诱导表达
对蒺藜苜蓿根系用激素 ABA 、6-BA 、NAA 、
IAA 、ACC 、AVG 和 GA 分别进行处理 ,探讨各激素
对MtROP 5 表达的影响。 RT-PCR 结果(图 8)表
明 ,在各种激素处理 24 h 后 ,NAA 、IAA 、ACC 、AVG
可诱导 MtROP 5的上调表达 ,GA 、ABA 和 6-BA 对
MtROP5 表达的影响不大 。
图 8　各激素处理蒺藜苜蓿根系 24 h 后 MtROP5
表达的 RT-PCR检测
Fig.8　Expression detection o f MtROP5 in M.truncatula
r oo t af te r dealting w ith various plant
hormone by RT-PC R
　　为进一步探明生长素与 MtROP5 的关系 ,本研
究用不同质量浓度 IAA 对转化 pMtROP 5∷GUS
的转基因拟南芥进行了处理 。研究结果表明 ,用质
量浓度为 1 μg/mL 的 IAA 处理 24 h 时 ,MtROP5
呈上调表达 , 而当 IAA 质量浓度为 2.5 , 5 , 10
μg/mL时 ,MtROP5 没有上调表达(图 9-A 、B)。在
上述 IAA 质量浓度下处理 48 h 后 ,GUS 的表达量
没有明显差异(图 9-C 、D)。由此可见 ,MtROP5 可
响应多种植物激素 ,并且对 IA A 表现出时间和质量
浓度积累效应。
图 9　生长素 IAA 对 MtROP5 的诱导表达
A 、B.IAA 处理 24 h ,其中 A 为 35S∷GUS , B 为 pMtROP 5∷GUS;
C 、D.IAA 处理 48 h ,其中 C 为 35S∷GUS , D 为 pMtROP 5∷GUS
1.对照;2.1μg/mL IAA;3.2.5μg/mL IAA;4.5μg/mL IAA;5.10μg/mL IAA
Fig.9　Expression level of MtROP5 is induced by IAA
A , B:24 h af ter dealing w ith IAA , A w as 35S∷GUS , B w as pMtROP5∷GUS;
C , D:Deal t wi th IAA 48 h , C w as 35S∷GUS , D was pMtROP5∷GUS
1.CK;2.1μg/mL IAA;3.2.5μg/mL IAA;4.5μg/mL IAA;5.10 μg/mL IAA
3　讨　论
3.1　ROPs蛋白在极性发育中的作用
目前 ,研究极性发育的最好模型是花粉管 、根毛
和叶表皮细胞。 ROP 蛋白是植物极性发育中较为
重要的一类调节蛋白 ,在这 3 种模型中也得到了充
分的体现。目前 ,关于 ROP 蛋白参与花粉管 、根毛 、
叶表皮细胞极性发育以及防卫反应的研究较
多[ 3 , 16] 。有研究表明 , ROP 蛋白是根毛极性发育的
重要调控因子[ 17-18] 。AtROP6 基因可以特异性地诱
导根毛的去极化生长[ 5-6] 。在拟南芥中 ,利用 ROP4
抗体和 GFP-ROP2 检测发现 , ROP4 、ROP2 定位于
168 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 39 卷
根毛顶端的质膜上[ 19] 。过量表达 ROP2 、ROP4 、
CA-ROP 6 形式的转基因植株 ,可以诱导根毛等的极
性生长 ,而 ROP2 的 DN 突变体则对根毛的生长表
现出抑制作用[ 18] 。A tROP1 基因特异地诱导花粉
细胞的极性生长 ,在拟南芥中过表达 LA T52 启动
子(花粉管特异启动子)驱动 DN-ROP 1 或 DN-
ROP 5形式 ,可导致拟南芥花粉萌发率降低和极性
生长变慢[ 7 , 20] 。在烟草中瞬时表达 ROP5 , 发现
ROP 5和 ROP 1具有相似的功能[ 7] 。编码较高同源
序列的 ROP 基因(ROP1 、ROP3 和 ROP5)均可以
在花粉管中表达 ,它们可能在功能上具有冗余性。
过表达 ROP1 的 DN 形式也可以抑制花粉的萌发 ,
而过表达野生型的 ROP1 则可以促进花粉的萌
发[ 21] ;过表达 ROP1 的作用与 ROP1 的量有关 ,低
表达水平可促进伸长 ,而高表达水平则会导致去极
化生长[ 21] 。过表达 ROP1 或 ROP5 的 CA 形式 ,可
导致严重的去极化 。前期的研究表明 ,MtROP5 与
拟南芥 ROP1 、ROP3 、ROP5 的氨基酸序列具有较
高的同源性 ,该基因在蒺藜苜蓿茎和花中的表达量
较高[ 11] 。本研究结果表明 ,MtROP5 基因在拟南芥
花的下胚轴等部位具有较高的表达量。由序列的同
源性和表达部位的特异性推断 ,该基因可能与 A t-
ROP1 具有相似的功能 。MtROP5 转化拟南芥角果
顶端花粉管的观察结果表明 , CA-MtROP 5 转化植
株具有较多的花粉管 ,同时 ,该转基因拟南芥的角果
在所有转基因植株中长度最短 、密度最大 。由此可
以推测 ,MtROP5 可以调控花粉管的极性发育 ,使柱
头上萌发的花粉管不能向柱头的内部延伸至胚珠位
置 ,进而导致花粉管不能正常受精 ,从而降低了植物
的育性。由于植物要繁殖后代 ,在受精不足的情况
下 ,只能通过多开花 、多结果荚来弥补受精数目的不
足 ,故又导致角果密度增加 , 但目前尚未见有关
ROP 蛋白参与角果发育调控的报道 ,该推测还需要
进一步的试验来证明。花序及侧枝极性的改变 ,可
能是由于过表达 MtROP5 导致与其相互作用蛋白
的功能调节失常而出现的表型 ,但目前也未见关于
ROP 蛋白参与植物花序和侧器官极性发育调控 ,以
及 AtROP1 、AtROP3 、A tROP5 参与拟南芥侧枝分
叉位点和簇毛分支形式调控的报道 ,因此 ,关于拟南
芥过表达 MtROP5 导致的簇毛 、侧枝起始位点发生
改变等异常表型的机理 ,还需进一步研究。
最近有研究表明 , ROP 蛋白在植物的抗逆生理
方面也具有一定的作用。如在拟南芥中过表达烟草
的 N tROP1 ,可以增加拟南芥对 NaCl 的敏感性[ 22] 。
但MtROP 5是否也在抗逆性中起作用 ,还有待进一
步研究证实 。
3.2　ROPs蛋白与生长素的相互作用
生长素在宏观水平上可以维持顶端分生组织 、
调节植物的向性反应 、侧根的形成及微管系统的发
育和植物的衰老 ,在微观水平上可以调控细胞分裂 、
伸长 、分化等。
生长素可以诱导拟南芥 AtRac1 蛋白的活性 ,从
而启动生长激素应答基因的表达。过表达 CA-At-
Rac1或干扰拟南芥内源 AtRac1的表达 ,均会使拟南
芥幼苗表现出多效性的表型 ,包括根发育缺陷 、子叶
融合 、胚轴极性消失等[ 23] ,这与植物生长素缺陷的相
关表型类似。拟南芥及烟草的 RAC/ROP GTPase可
以介导生长素诱导的核蛋白复合体的形成 ,该复合体
含有 AUX/ IAA 蛋白并具有蛋白降解活性[ 24] 。增强
Rac蛋白的活性可以促进 AUX/ IAA 蛋白的降解 ,上
调生长素应答基因的表达 ,减弱 Rac蛋白的活性而增
强生长素抑制因子 AUX/ IAA 的活性 ,从而降低生长
素的水平。从植物整体来看 ,生长素可以维持顶端分
生组织 、调节植物的反应 、侧根的形成 、微管系统的发
育及植物的衰老;在细胞水平上 ,生长素与细胞分裂 、
伸长 、分化等相关。生长素可以通过 ROP 影响植物
的形态发育 、花粉管生长及极性的建立等[ 25] 。同时 ,
过表达 CA-ROP2 可加强 PIN2蛋白在根伸长区的极
性积累 ,从而加强植物的向重力性[ 26] 。研究表明 ,小
G 蛋白 ROP GTPase 与生长素具有较为密切的关
系[ 23] 。本研究利用 RT-PCR 分析表明 , MtROP5 受
NAA 、IAA 、ACC 、AVG 等植物激素的诱导。而越来
越多的研究表明 ,生长素之间存在着交互作用[ 27-29] 。
生长素是植物中比较重要的一类激素 ,多种激素的作
用都是通过其起作用的 ,而MtROP5 的功能比较强
大 ,其是否是多种激素交互作用中的关键调控因子 ,
其作用是否与生长素有关 ,拟南芥中过表达该基因后
出现的一系列异常表型是否是由于其打破了植物体
内的激素平衡而出现的 ,这些问题均需要进一步研
究。
4　结　论
MtROP5 可以影响拟南芥的角果 、果序发育及侧
生器官腋芽 、花序的极性和簇毛的分支形式等。
MtROP5 可以在叶脉 、花药 、下胚轴 、气孔及簇毛等部
位特异表达 ,该基因受生长素诱导 。因此 ,MtROP5
在果荚及侧器官等的极性发育中具有较为重要的作
用 ,可能是生长素交互作用中的关键调控因子。
169第 2 期 衣　娜 ,等:蒺藜苜蓿小 G 蛋白 Mt ROP5 对拟南芥角果及侧器官发育的影响
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