全 文 ：第 15 卷 第 5 期
Vol. 15 No. 5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2007 年 9 月
Sep. 2007
文章编号: 1007-0435( 2007) 05-0429-08
蒺藜苜蓿 SSR反应体系优化及在一年生
苜蓿种质鉴定中的应用
张丽芳 , 魏臻武* , 杨占花
(甘肃农业大学草业学院, 兰州 730070)
摘要: 利用正交设计和完全随机试验优化蒺藜苜蓿 ( Medicag o truncatula Gaertn) SSR 标记的 PCR 反应体系。结
果表明,适合于一年生苜蓿( Med icago L . )遗传分析的 SSR 技术体系为: 10 L 反应体系中 T aqDNA 聚合酶为 1
U , dNTP 浓度为0. 20 mmol/ L , Mg2+ 浓度为 2. 0 mmo l/ L, 引物浓度为 1. 5 umo l/ L, 模板 DNA 用量为 20 ng/ uL ; 利
用该反应体系将 2 个蒺藜苜蓿亲本和杂交种有效鉴别; 利用 SSR标记对 19 个一年生苜蓿种质进行 SSR-PCR 扩
增,用 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 不同种质间 DNA 谱带多态性丰富, 通过 U PGM A 方法聚类分析可
以明确区分 19 个一年生苜蓿种质。
关键词: 一年生苜蓿; 蒺藜苜蓿; SSR反应; 正交设计; 杂交种鉴定; 种质鉴定
中图分类号: S812; Q943 文献标识码: A
Optimization of SSR Reaction System of Medicago truncatula
and Its Application in Annual Medicago Germplasm Identification
ZHANG L-i fang , WEI Zhen-wu
*
, YA NG Zhan- hua
( Pratacul tu ral College, Gan su Agricultu ral University, Lan zhou, Gansu Province 730070, China)
Abstract: SSR react ion condit ions on annual medics w er e opt imized. The model legume, Med icago tr unca-
tula. , w as used to set up a SSR-PCR amplif icat ion system for the annual medics. T he results show that
the opt imal SSR-PCR react ion system for annual medics w as 1 U T aqDNA polymer ase, 0. 20 mmo l/ L
dNT P, 2. 0 mmol/ L M g
2+
, 1. 5 mol/ L primer, and 20 ng/L DNA in the to tal volume of 10 L.
Through above PCR sy stem, SSR fragments of 19 annual medics germplasms w ere obtained and detected.
Polymor phism betw een differ ent lines w as abundant ly detected by 8% po lyacry lamide gel. Germplasms of
19 annual medics w ere def initely different iated using cluster analy sis based on the U PMGA.
Key words: A nnual medic; Medicago t runcatula Gaertn. ; SSR react ion; Or thogonal design; Hybridizat ion
ident ificat ion; Germplasm identif icat ion
随着分子生物学的发展, 分子标记技术已应用
于牧草种质资源遗传多样性评价[ 1] , 同时,分子标记
辅助选择育种也在植物遗传育种研究中显示出巨大
的潜力[ 2]。SSR标记( simp le sequence r ep eat s)即简单
序列重复,又称微卫星 DNA (microsatell ite DNA) ,因
其具有多态性高, 数量丰富、信息含量高和重复性好
等特点[ 3] ,已广泛用于基因定位、遗传作图、多态性分
析、构建 DNA指纹图谱等各个领域[ 4, 5]。近年来,随
着基因组计划的开展和大规模测序工作的进行,人们
可以利用互联网查找 SSR序列及其两端序列来设计
引物。以少的投入,获得较多的信息,应用 SSR标记
进行基因组学和遗传育种的研究, 从少数模式生物
中获得的遗传信息能迅速地应用到苜蓿( M edica-
go)、三叶草( Tr if olium )、大豆( Gly cine max )等基
收稿日期: 2007-04-05; 修回日期: 2007-06-13
基金项目: 甘肃省教育厅科学技术研究项目( 0507) , 甘肃农业大学科技创新项目( 200518) , 草业生态系统教育部省部共建重点实验室和
国家自然科学基金( 30671486)
作者简介: 张丽芳( 1981-) ,女,汉族,甘肃定西人,硕士研究生,研究方向为牧草种质资源评价和育种, E-mail: zhanglif ang1981@ 163. com ;
* 通讯作者 Auth or for correspon dence, E-m ail : zh enw u_w ei@ yahoo. com. cn
草 地 学 报 第 15卷
因组研究比较薄弱或困难的牧草和作物中。
蒺藜苜蓿(M edicago t runcatula Gaertn) , 具有
高的遗传转化效率, 生长期短、自花授粉、基因组小、
染色体组为 2 8( 2n= 16)等特点,是极好的豆科生
物学和基因组学研究的模式植物[ 6~ 8] 。Young 等人
利用蒺藜苜蓿开展苜蓿基因组学的比较研究 [ 9]。
Diw an、魏臻武已建立了多年生苜蓿 SSR分析体系
进行苜蓿遗传作图和遗传多样性的研究 [ 10~ 12]。
SSR标记具有物种及染色体组特异性,其 PCR扩增
过程受诸多因素影响, PCR 扩增中会产生非特异、
扩增质量差等问题, 从而给研究工作带来不便 [ 13]。
本研究在一年生苜蓿种质资源搜集整理的基础
上,探索其基因组 DNA制备方法, 通过筛选反应体系
中各因素的最佳组合,建立一套适合于模式植物蒺藜
苜蓿基因组 SSR扩增的反应体系,为研究一年生苜蓿
种质遗传多样性评价、开展蒺藜苜蓿和苜蓿基因组分
析、分子标记辅助选择育种和遗传改良研究提供条件。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验材料于 2006 年 2月在国家大豆改良中心
江浦试验站种植, 在幼苗时取嫩叶研磨。提取的
DNA 作为 SSR-PCR 反应体系的模板。引物序列
来自苜蓿、大豆和蒺藜苜蓿等物种已开发序列, 由上
海生物工程公司合成。实验所用的 MgCl2 , dN TP,
T aq聚合酶试剂均购自上海生物工程公司。
1. 2 DNA提取
取 6~ 7个叶片在液氮中研磨成粉末,蒺藜苜蓿
叶片基因组 DNA 的提取参照 CTAB 法,稍加改进。
提取的 DNA 质量和浓度经 0. 8%琼脂糖凝胶和紫
外分光光度计检测。样品稀释液放入 4 冰箱备
用,原液放入- 70 冰箱长期保存。
1. 3 蒺藜苜蓿和一年生苜蓿种质的整理
搜集整理了以蒺藜苜蓿为主的 19个一年生苜
蓿种质,分别来自法国、澳大利亚和中国。其中蒺藜
苜蓿 DZA、J51等 6份材料来自原产地法国, SA37
和 SA36来自一年生苜蓿面积最广的澳大利亚。观
察种质间在田间农艺性状上的差异: 叶斑有无的差
异、株高的差异以及荚果形状和螺旋等方面的差异。
一年生苜蓿种质名称和来源见表 1。
表 1 一年生苜蓿种质名称与来源
T able 1 Name and or ig in of annual medic
序号
No.
种质编号
Germplasm No.
品种名
Species name
拉丁名
Latin name
种质来源
Origin
01 ML 天蓝苜蓿 M. lu pu lin L . 甘肃 Gansu
02 GN14 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 南京 Nan jing
03 J51 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 法国 French
04 FE62 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 法国 French
05 DZA 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 法国 French
06 MS56 蜗牛苜蓿 M. scutel lata ( L. ) M il l. 甘肃 Gansu
07 MS54 蜗牛苜蓿 M. scutel lata ( L. ) M il l. 甘肃 Gansu
08 FE61 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 法国 French
09 GN15 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 南京 Nan jing
10 SA37 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 澳大利亚 Au st ralia
11 SA36 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 澳大利亚 Au st ralia
12 Caliph 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 甘肃 Gansu
13 DZA51 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 法国 French
14 W5136 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 南京 Nan jing
15 TM 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 法国 French
16 GN10 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 甘肃 Gansu
17 W5145 蜗牛苜蓿 M. scutel lata ( L. ) M il l. 甘肃 Gansu
18 W5160 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 甘肃 Gansu
19 W5003 蒺藜苜蓿 M. tr uncatula Gaertn. 甘肃 Gansu
1. 4 PCR扩增体系的正交设计
本实验采用 L 9 ( 34 ) 正交表[ 14] , 进行 4 因素
( TaqDNA聚合酶、dN TP、引物、Mg2+ ) 3水平的正
交试验,共 9 个组合(表 2)。每个优化组合均采用
10 L 反应体系, 其中 DNA 模板 3 L, 10 buffer
1. 5 L 及各组合用量, 最后以 ddH 2O 补足 10 L。
依据条带的强弱和杂带的多少作直观性分析,确定
430
第 5期 张丽芳等:蒺藜苜蓿 SSR 反应体系优化及在一年生苜蓿种质鉴定中的应用
影响 PCR反应的关键因素[ 15, 16]。参照李银霞等 [ 17]
SSR优化方法再设计二组 2因素 4水平完全随机试
验(见表 3) , 逐个优化其它反应成分以确定最佳的
反应组合。
表 2 PCR 正交试验设计[L9 ( 34) ]
Table 2 Table of o rthogonal design o f PCR[ L 9 ( 34 ) ]
组合号
No.
PCR反应组 Cross of PCR reaction
T aq酶 (L/ 5U) dNT P ( mmol/ L) 引物 Primer ( mol/ L) Mg2+ ( mmol/ L)
1 0. 5 0. 16 0. 5 1. 0
2 0. 5 0. 20 1. 0 2. 0
3 0. 5 0. 24 1. 5 3. 0
4 1. 0 0. 16 1. 0 3. 0
5 1. 0 0. 20 1. 5 1. 0
6 1. 0 0. 24 0. 5 2. 0
7 1. 5 0. 16 1. 5 2. 0
8 1. 5 0. 20 0. 5 3. 0
9 1. 5 0. 24 1. 0 1. 0
表 3 引物和 DNA浓度, dNTP和Mg2+ 浓度 2因素 4水平完全随机试验设计
T able 3 2- facto r and 4- level completely r andomized design of primer and DNA , dNTP and M g2+
组合号 No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
引物 Primer(mol/ L) 0. 5 0. 5 0. 5 0. 5 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 5 1. 5 1. 5 1. 5 2. 0 2. 0 2. 0 2. 0
DNA( ng/ L) 20 40 60 80 20 40 60 80 20 40 60 80 20 40 60 80
dNTP( mmol/ L) 0. 16 0. 16 0. 16 0. 16 0. 20 0. 20 0. 20 0. 20 0. 24 0. 24 0. 24 0. 24 0. 28 0. 28 0. 28 0. 28
M g2+ ( m mol/ L) 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0
1. 5 蒺藜苜蓿杂交组合及其鉴定
根据一年生苜蓿遗传多样性分析结果确定亲本
组配, 于 2005年 10月- 2006 年 4月进行杂交, F 1
代杂交种种植于温室,并进行形态鉴别和分子鉴定。
1. 6 PCR扩增反应
PCR反应程序为: 94 预变性 3 min, 95 变性
1 m in, 52 退火 1. 5 min, 72 延伸 60 s,共循环 35
次,最后72 保温8 min, 4 保存。扩增产物用8%
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2. 1 DNA提取和质量检测
用改良 CT AB 法提取一年生苜蓿 DNA, 提取
的 DNA 纯度和产量均较高,检测结果显示 DNA 质
量浓度在 430 g / mL~ 540 g / mL 之间,模板 DNA
OD 260 / OD280值在 3. 1~ 3. 4之间,琼脂糖检测 DNA
条带清晰且没有降解,适于 SSR分析。
2. 2 蒺藜苜蓿 SSR反应体系的优化
2. 2. 1 正交设计筛选反应的主要影响因素 SSR
基本反应体系采用 Cr egan 等的方法 [ 18] , 利用正交
设计筛选反应的主要影响因素。试验中依据聚丙烯
酰胺凝胶电泳条带的强弱和杂带的多少作直观分
析。在优化的 9个组合中, 多数都无扩增产物, 只有
组合 3、4、7有条带出现(图 1)。T aq酶为 SSR-PCR
反应的关键因素之一。当其用量为 1 U 时, SSR的
扩增效果较好。组合 4为最佳组合, 其次是组合 7。
从经济的角度考虑, T aq酶的用量为 1 U 较为合适。
图 1 蒺藜苜蓿正交试验设计[ L9 ( 34 ) ] PCR反应检测结果
Fig. 1 Electr opho resis r esult s o f PCR reaction components
by ort hogonal design [ L 9( 3
4 ) ] o f M. truncatula
2. 2. 2 完全随机试验筛选最适 dNT P 和 Mg2+ 浓
度 在最适 dNT P 和Mg2+ 浓度的筛选中, 将dNTP
和 Mg2+ 两个因素各设 4 个水平, 利用完全随机试
验设计了16个处理组合,具体的组合用量见表3。在
组合 1~ 16中, dNTP浓度从 0. 16~ 0. 28 mmol/ L 逐
渐增大, 在 4 个浓度水平上均有扩增产物, 浓度为
431
草 地 学 报 第 15卷
0. 16~ 0. 28 mmol/ L 时扩增带较弱, 浓度为 0. 20~
0. 24 mmol/ L 时, 扩增带较亮, 尤以 0. 20 mmol/ L
时扩增效果最好且稳定。在每个 dNTP 浓度水平
上, M g2+ 浓度都是从 1. 0~ 4. 0 mmol/ L 逐渐增大。
当 Mg 2+ 浓度为 1 mmol/ L 时,无扩增产物, 浓度为
2. 0~ 3. 0 mmo l/ L 时, 尤以浓度为 2. 0 mmo l/ L 时
条带最为清晰且稳定,效果较好。浓度为 4. 0 mmol/ L
时扩增的特异性降低, 条带产生弥散现象。试验结
果表明,组合 6的扩增效果较好(图 2) , dNT P 浓度
为 0. 20 mmol/ L, M g2+ 浓度为 2. 0 mmol/ L。
图 2 蒺藜苜蓿 dNTP和 Mg2+ 浓度筛选 SSR 反应检测结果
F ig. 2 Effects of different concentr ations of dNTP
and Mg2+ on SSR of M. truncatul a
图 3 蒺藜苜蓿引物浓度和模板 DNA用量
筛选 SSR反应检测结果
F ig. 3 Effects of different concentr ations of pr imer and
dosage o f DNA on SSR o f M. truncatula
2. 2. 3 完全随机试验筛选最适引物和模板 DNA
浓度 在 dNT P 和 Mg2+ 最适浓度筛选的基础上,
进一步利用 2因素 4水平完全随机试验筛选引物和
模板 DNA 在 SSR反应中的最适浓度和用量。在引
物浓度为 0. 5 mol/ L 时,模板 DNA 用量在 60 ng/
L 和 80 ng/L 均有扩增产物(见图 3)。引物浓度
在 1 mol/ L 水平时,模板用量在 40~ 80 ng /L 均
有扩增条带,但用量为80 ng /L 时扩增条带亮度较
高。引物浓度在 1. 5 mo l/ L 水平上, 模板用量在
20~ 60 ng/L 的扩增条带较亮, 特异性好。引物浓
度在 2. 0 mo l/ L 时,均有扩增条带, 但条带亮度低
于引物浓度在 1. 5 mol/ L下扩增的条带亮度。试验
结果表明,引物浓度为 1. 5 mol/ L,模板用量为20~
60 ng/L即组合 9、10、11时, SSR扩增较强,特异性
好。该反应体系适于其它一年生苜蓿 SSR扩增。
2. 3 利用 SSR反应进行蒺藜苜蓿杂交种鉴定
利用优化了的 SSR反应体系构建 SSR指纹图
谱并对一对亲本形态特征差异较小, 在 F1 代无法利
用形态进行鉴定的蒺藜苜蓿亲本材料及其 F1 杂交
种进行了早期鉴定。图 4所示, P1、P2 为一对形态
特征差异较小的亲本, 其中母本( P1 )为 W5160; 父
本( P2 )为 Jemalong。箭头所指向处为母本和父本
特征谱带的位置。如图所示, F 1 既具有母本特征条
带又具有父本特征条带,则 F1 为杂交种, 同时含有
父母本的基因型。在对其后的 F 2 分离群体的观测
也证明该杂交种为真杂交种。
图 4 蒺藜苜蓿杂交种鉴定
F ig . 4 I dentification of M. truncatula hybridization
P1 : 母本( mother) P2: 父本( father) F1 : 杂交种 ( hybridiz at ion)
2. 4 利用 SSR标记对一年生苜蓿种质的鉴定
本试验从法国、澳大利亚和中国搜集了 19份一
年生苜蓿种质, 进行遗传多样性评价。不同种质无
论在种内还是种间, 在形态上都存在较大差异(表
4)。在优化 SSR反应体系的基础上, 利用 SSR 分
子标记快速鉴定不同特性的种质, 并尝试在不同植
物间共用 SSR引物, 从已有的 800 多对大豆、苜蓿
和蒺藜苜蓿 SSR 引物中, 筛选出了 32 对多态性高
的 SSR引物,用于一年生苜蓿种质鉴定和遗传多样
性评价。图 5为利用优化了的 SSR体系对 19个一
年生苜蓿进行的 SSR扩增产物,扩增结果显示, 该
优化体系的各反应条件适合于一年生苜蓿不同种间
的 SSR扩增反应, 且一年生苜蓿的 SSR 反应扩增
强,条带清晰且特异性好, 较稳定。19 份一年生苜
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第 5期 张丽芳等:蒺藜苜蓿 SSR 反应体系优化及在一年生苜蓿种质鉴定中的应用
蓿种质在分子水平上表现出明显的多态性差异,
SSR标记可以有效地区别一年生苜蓿种质种间和
种内的差异。
表 4 19个一年生苜蓿种质特性
T able 4 Characterist ics o f 19 annual medics tested
种质编号
Germ plasm No.
种名
Species nam e
叶形
Leaf sh ape
叶斑
Leaf spot
荚果形状
Pod shape
开花期( d)
Blos soming
生育期( d)
Growth period
ML 天蓝苜蓿
M. lup ul in
倒卵形
Obovate
无叶斑
No leaf spot
荚果黑色弯曲成肾形
Black an d cu rved reni form pods
90 125
GN14 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
无叶斑
No leaf spot
荚果桶状具有硬刺、顺时针螺旋
Pods b arr e-l shaped w ith hard spin es and clock-
w ise tw ist
95 125
J51 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
75 115
FE62 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
72 110
DZA 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
无叶斑
No leaf spot
荚果桶状具有硬刺、顺时针螺旋
Pods b arr e-l shaped w ith hard spin es and clock-
w ise tw ist
85 120
MS56 蜗牛苜蓿
M. scutel lata
倒卵形
Obovate
无叶斑
No leaf spot
蜗牛状荚果、逆时针螺旋
Pods snai-l shaped w ith ant-i clockwis e twist
65 104
MS54 蜗牛苜蓿
M. scutel lata
倒卵形
Obovate
无叶斑
No leaf spot
蜗牛状荚果、逆时针螺旋
Pods snai-l shaped w ith ant-i clockwis e twist
65 104
FE61 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
75 120
GN15 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
75 120
SA37 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
70 115
SA36 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
70 115
Cal iph 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
无叶斑
No leaf spot
荚果桶状具有硬刺、顺时针螺旋
Pods b arr e-l shaped w ith hard spin es and clock-
w ise tw ist
55 94
DZA51 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
无叶斑
No leaf spot
荚果桶状具有硬刺、顺时针螺旋
Pods b arr e-l shaped w ith hard spin es and clock-
w ise tw ist
90 120
W5136 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
75 110
T M 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
80 115
GN10 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
95 125
W5145 蜗牛苜蓿
M. scutel lata
倒卵形
Obovate
无叶斑
No leaf spot
蜗牛状荚果、逆时针螺旋
Pods snai-l shaped w ith ant-i clockwis e twist
65 104
W5160 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
78 120
W5003 蒺藜苜蓿
M. tru ncatu la
菱形
Rhombus
褐色叶斑
Brow n leaf spot
荚果桶状具有硬刺、逆时针螺旋
Pods barre-l shaped w ith h ard spines an d ant-i
clockw ise tw ist
70 120
433
草 地 学 报 第 15卷
图 5 19 个一年生苜蓿种质 SSR扩增产物
Fig . 5 DNA bands o f 19 annual medics fr om SSR analy sis system
一年生苜蓿种质为: 1.天蓝苜蓿( M L) ; 2. 蒺藜苜蓿 ( GN14 ) ; 3. 蒺藜苜蓿( J 51) ; 4. 蒺藜苜蓿( FE62) ; 5. 蒺藜苜蓿 ( DZA) ; 6. 蜗牛苜蓿
( M S56) ; 7. 蜗牛苜蓿( MS54) ; 8. 蒺藜苜蓿( DZA51) ; 9. 蒺藜苜蓿( GN15) ; 10. 蒺藜苜蓿( SA37 ) ; 11. 蒺藜苜蓿 ( SA36) ; 12. 蒺藜苜蓿( Cal-
ip h) ; 13. 蒺藜苜蓿( FE61) ; 14. 蒺藜苜蓿( W5136 ) ; 15. 蒺藜苜蓿 ( T M ) ; 16. 蒺藜苜蓿 ( GN10 ) ; 17. 蜗牛苜蓿( W5145 ) ; 18. 蒺藜苜蓿
( W5160) ; 19. 蒺藜苜蓿( W5003)
Germplasm of the an nual medic: 1. M. lup ul in ( ML) ; 2. M. t runcatula ( GN14) ; 3. M. t runcatula( J51) ; 4. M . tr uncatula ( FE 62) ; 5.
M . t runcatula ( DZA) ; 6. M. scutel la ta ( MS56) ; 7. M. scu te llata ( MS54) ; 8. M . tr uncatula ( DZA51) ; 9. M. tru ncatu la ( GN15) ; 10. M.
tr uncatu la ( SA37) ; 11. M. t runcatula ( SA36) ; 12. M. tru ncatu la ( Cal iph) ; 13. M. t runcatula ( FE61) ; 14. M. tr uncatula ( W5136) ; 15.
M . t runcatula ( Caliph) ; 13. M. tr uncatula ( FE61) ; 14. M. t runcatu la ( W5136) ; 15. M. tr uncatula ( TM) ; 16. M. t runcatula ( GN10 ) ;
17. M. scutel lata ( W5145) ; 18. M. tr uncatula ( W5160) ; 19. M. t runcatu la ( W5003)
图 6 基于 SSR标记的 19份一年生苜蓿种质间聚类分析
Fig . 6 Germplasm cluster dendrog ram o f 19 annual
medics based on SSR marker
对 11对引物的扩增结果进行统计,采用 UPG-
MA 法进行聚类, 聚类结果见图 6。以 0. 62 为阈
值,可以将 19个一年生苜蓿种质划分为 3 个类群,
参试的大部分蒺藜苜蓿聚为第一类, 且包括 3 个亚
类: DZA、DZA51、GN14 相似系数为 0. 87, 聚为一
亚类,叶形、叶斑、荚果形状及螺旋方向等形态特征
基本一致, 亲缘关系较近。而 Jemalong 和种质
W5160等 11个种质在相似系数为 0. 9 处聚为另一
亚类, 其中 J51、FE62、GN15、SA36、SA37、W5136
的遗传相似系数为 1. 0,其亲缘关系极高。W5160、
W5003被聚在一起,相似系数为 0. 98。Caliph 为第
三亚类,相似系数为 0. 71。在相似系数 0. 62处将
蜗牛苜蓿W5145、MS54、MS56聚为第二类, 与蒺藜
苜蓿的亲缘关系较近。天蓝苜蓿( Med icago lup u-
lin L. ) ( M L)在相似系数 0. 32 处被单独聚为第三
类。SSR分析结果表明, 天蓝苜蓿( M L)与其它蒺
藜苜蓿和蜗牛苜蓿 ( Medicago scutel lata ( L . )
M ill. )的遗传差异较大, 聚类时遗传距离远。因此
SSR标记可有效区分 19份一年生苜蓿种质资源。
3 讨 论
3. 1 本实验利用正交试验设计,初步建立并优化了
蒺藜苜蓿 SSR标记的 PCR反应体系。这一反应受
诸多因素的影响,包括 T aq 酶、Mg 2+ 浓度、dNT Ps、
引物和 DNA 模板等各反应成分都会影响 PCR 产
物的生成和质量, 因此本试验首先利用正交设计识
别了 SSR反应体系中的关键影响因素并确定其最
适用量,再结合较少因素的完全随机试验逐步筛选
其他成分的最佳终浓度水平。不同的引物有其特异
的退火温度。本体系中引物退火温度为 52 ,若选
用不同的引物还需通过实验优化。
434
第 5期 张丽芳等:蒺藜苜蓿 SSR 反应体系优化及在一年生苜蓿种质鉴定中的应用
3. 2 蒺藜苜蓿作为豆科模式植物越来越受到重视,
在遗传研究中需要对其杂交种进行鉴定。利用形态
鉴定是常用的方法, 但需在 F2 代进行分离时才能鉴
定。利用 SSR 分子标记可以在 F1 代进行早期鉴
定。共显性 SSR标记可以根据带型将父母本及 F 1
杂种区分开, 同时, 同一 SSR 标记在不同杂交种亲
本中扩增的带型往往并不相同, 其相应杂交种的带
型也不同。据此,利用一条或多条 SSR引物产生的
标记可将不同杂交种亲本以及各杂交种亲本相应的
杂交种区别开[ 19] 。本试验利用优化了的 SSR 反应
体系对组合 W5160 Jemalong 在 F1 代进行快速、
准确的早期杂交种鉴定, 结果显示为真杂交种,并在
后期 F 2分离群体的观测中得到了证实。另外利用
分子标记不受季节地区限制, 省去了种植工序,因而
应用 SSR标记可快捷有效的鉴别杂交种的真伪, 同
时也为种子检验、品种选育等提供了有力的工具。
3. 3 采用传统的农艺性状鉴定牧草种质遗传资源
是常用的鉴定方法。对于本试验的 19个一年生苜
蓿种质资源,在形态上也存在着较大的差异, 从荚果
螺旋区分,蒺藜苜蓿荚果螺旋紧密具有硬刺, 蜗牛苜
蓿荚果呈蜗牛状, 天蓝苜蓿的荚果黑色、弯曲成肾
形;从叶斑和荚果螺旋方向区分,天蓝苜蓿和蜗牛苜
蓿的叶片都无叶斑, 蒺藜苜蓿种内有较大差异:
GN14、DZA、Caliph 和 DZA 的叶片无褐色斑点且
荚果顺时针螺旋, J51、FE62、SA36、SA37、GN15 等
叶片带有褐色叶斑且荚果逆时针螺旋。在开花期和
生育期方面, Caliph 花期和生育期最短, 分别为55 d
和94 d。因此通过农艺性状可以鉴定不同的一年生
苜蓿种质。随着分子生物学的快速发展, 分子标记
已经在牧草遗传资源鉴定和遗传多样性研究中发挥
着重要作用。通过对 11对引物的 SSR扩增结果的
聚类分析显示, 在相似系数 0. 62处可明显区分种间
差异,在相似系数 0. 71处可区分种内差异。蜗牛苜
蓿与蒺藜苜蓿的亲缘关系较近,其相似系数为0. 62,
而与天蓝苜蓿的亲缘关系较远,其相似系数为0. 32。
不同来源的蒺藜苜蓿种质遗传差异显著, 种质 Je-
malong、DZA、Caliph和选系 W5160 等种质间有较
大差异。其中 DZA、DZA51、GN14为种质 DZA 的
不同品系,遗传背景相似,在相似系数为 0. 87 处聚
为一类; J51、FE62、GN15、SA36、SA37、W5136 等
为种质 Jemalong 的不同品系, 其亲缘关系非常接
近,相似系数为 1. 0。SSR 标记聚类的结果与农艺
性状具有很高的相似性, 且分子标记鉴定种质资源
时不受生长环境影响, 避免了农艺性状鉴定中人为
因素带来的误差。因此 SSR标记能够更加准确的
揭示材料间的遗传差异, 为种质资源的鉴定提供了
保障。
4 结 论
4. 1 采用正交设计和完全随机试验优化了一年生
苜蓿 SSR-PCR反应体系。适宜于模式植物蒺藜苜
蓿及一年生苜蓿种质鉴定的 SSR最适反应体系为
( 10 L) : T aq 酶用量为 1 U , dNTP 浓度 0. 20
mmol/ L , M g
2+ 浓度 2. 0 mmol/ L, 引物浓度 1. 5
mo l/ L ,模板 DNA用量为 20 ng/L。该反应体系
适于一年生苜蓿遗传分析、遗传图谱构建、品种鉴别
和亲缘关系鉴定等的研究。
4. 2 利用 SSR 分子标记对蒺藜苜蓿杂交组合
W5160 Jemalong 所得的 F 1 杂交种进行了鉴定,
结果表明, F 1 杂交种既含有父本的基因型, 又含有
母本的基因型,则此 F 1 的基因型是杂合的,为真杂
交种。可应用于作图群体构建及遗传分析研究中。
4. 3 本实验搜集了 19个一年生苜蓿种质,利用最
优 SSR反应体系对来源不同的 19个一年生苜蓿种
质的遗传差异在分子水平进行了鉴定, 结果表明不
同来源的一年生苜蓿的 SSR多态性差异明显,遗传
多样性丰富,利用 SSR标记可以鉴别不同种质。
4. 4 采用 U PGMA 法对一年生苜蓿的 SSR 标记
多样性进行遗传相似性聚类,结果表明,不同来源的
蒺藜苜蓿种质遗传差异显著, 品种 Jemalong、DZA、
Caliph等种质间有较大差异。选系 W5160与其它
蒺藜苜蓿的遗传关系较远。蜗牛苜蓿与蒺藜苜蓿的
亲缘关系较近,而与天蓝苜蓿的亲缘关系较远。
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