全 文 ：书干旱胁迫下黄花苜蓿与蒺藜苜蓿两个抑制性
差减杂交文库的构建及分析
王天佐，赵敏桂，张文浩
（中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室，北京１０００９３）
摘要：水分胁迫是植物面临的最主要的非生物胁迫之一，研究植物的抗旱机理以提高植物的抗旱能力具有重大的
意义。抑制性差减杂交是一种筛选特异表达基因的良好手段，使用该方法成功构建了豆科植物黄花苜蓿和蒺藜苜
蓿２个差减文库并进行测序。通过ＧＯ分类和ＫＥＧＧ分析等手段对文库中序列进行分类，并分析表达序列的差
异，发现黄花苜蓿文库中对抵抗水分胁迫起积极作用的基因表达序列明显多于蒺藜苜蓿。此外，还对筛选到的２
个基因在２种苜蓿中的干旱响应表达模式进行了分析，结果表明，在黄花苜蓿中这２个基因的表达更加有利于响
应和抵抗干旱。这些结果在分子层面上一定程度的解释了黄花苜蓿较蒺藜苜蓿更加抗旱的原因。
关键词：黄花苜蓿；蒺藜苜蓿；干旱；抑制性差减杂交（ＳＳＨ）
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５５１＋．７０３．４；Ｑ９４５．７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０６０１７５０７
水资源缺乏是一个全球性的问题，地球上有１／３以上的陆地是干旱和半干旱地区，而中国是主要的干旱国家
之一，干旱半干旱土地面积占国土面积的５０％以上。水分是植物生存所必需的，干旱胁迫会严重地影响植物的
生长发育，造成作物大面积减产［１］。干旱对农业和社会造成的损失相当于其他各类自然灾害造成的损失之和［２］。
日益加剧的水资源短缺与植物的正常生长之间形成了激烈的矛盾，因此，通过揭示抗旱植物抵抗胁迫的机理，以
寻找提高植物抗旱能力的途径势在必行。
黄花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅犳犪犾犮犪狋犪）是一种具有突出经济价值和生态功能的多年生优质豆科牧草，在我国分布广
泛，内蒙古、新疆分布较多［３］。黄花苜蓿属于耐寒的旱中生植物，抗旱、耐寒、耐盐碱、耐风沙、耐贫瘠、抗病虫害。
由于黄花苜蓿具有优异的抗逆性，所以在苜蓿的育种实践中，黄花苜蓿常常作为父本与高产的紫花苜蓿杂交，来
培育苜蓿新品种［４６］。Ｐｅｎｎｙｃｏｏｋｅ等［７］对黄花苜蓿和蒺藜苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪）冷响应基因的结构进行了
分析，发现黄花苜蓿基因组中编码诸如胚胎发育晚期丰富蛋白的同源基因较多，并且其上游具有多个识别低温信
号的ＣＲＴ／ＤＲＥ元件 （Ｃｒｅｐｅａｔｅｄ／ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｍｏｔｉｆｓ），这是黄花苜蓿较蒺藜苜蓿抗冷的分
子机理之一。另外，在低温胁迫下，黄花苜蓿体内积累的脯氨酸和可溶性糖比蒺藜苜蓿占优势［８］。黄花苜蓿在低
磷胁迫下能通过大量合成植物激素乙烯，调控其根系的水分运输和酸性磷酸酶的活性［９，１０］，黄花苜蓿还能通过
根系大量分泌柠檬酸，活化根际难溶态磷来提高在磷胁迫条件下对磷的吸收［１１］。在水分胁迫下，黄花苜蓿具有
形态学上的优势：根系发达，入土深度达２ｍ，侧根沿水平方向扩展；上表皮气孔小，下表皮气孔多［３］。干旱胁迫
下，黄花苜蓿较其他品种能够积累更多的可溶性糖，保持较高的光合速率，拥有较强的抗氧化系统［１２］。虽然国内
外对黄花苜蓿抗旱的生理机理研究已取得一定的成果，但对其抗旱的分子机理研究尚未见报道。因此，对黄花苜
蓿抗旱分子调控机制的研究是极其有意义和亟待进行的。但由于黄花苜蓿遗传背景比较复杂，分子生物学研究
稀少，直接对其进行抗旱分子机理研究存在一定的困难。由于黄花苜蓿与豆科模式植物蒺藜苜蓿有着紧密的亲
缘关系，蒺藜苜蓿基因组小、自花授粉、丰富的基因组信息、完善的转化体系［１３］以及现有的对蒺藜苜蓿抗旱的研
究［１４１６］为研究黄花苜蓿抵抗水分胁迫的机理提供了便利。
抑制性扣除杂交 （ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）是一种比较和分离不同细胞系、不同组织间
第２１卷 第６期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１７５－１８１
２０１２年１２月
收稿日期：２０１１１２０６；改回日期：２０１１１２２７
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）项目（２００７ＣＢ１０６８００）资助。
作者简介：王天佐（１９８５），男，山东潍坊人，助理研究员，博士。Ｅｍａｉｌ：ｔｚｗａｎｇ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｍｉｎｇｕｉ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ
或同一细胞系、同一组织在不同条件下有差别表达基因的方法。抑制性消减杂交法是寻找重要功能基因的新方
法，它通过单链ＴｅｓｔｅｒｃＤＮＡ的消减均等化，以及两轮抑制性ＰＣＲ使高低丰度的差异表达基因均能有效地进行
分离，并可同时得到多条片段［１７］。ＳＳＨ技术已经成功的用于苜蓿差减文库的构建［１８，１９］，并广泛的运用于筛选干
旱相关基因的研究［２０，２１］。本研究利用ＳＳＨ技术构建了黄花苜蓿和蒺藜苜蓿的２个差减文库并进行测序，通过比
较２个文库序列的差异来分析黄花苜蓿抗旱的原因。
１ 材料与方法
１．１ 材料
蒺藜苜蓿使用测序种ＪｅｍａｌｏｎｇＡ１７，黄花苜蓿使用呼伦贝尔野生黄花苜蓿。试验于２００８年１１月—２００９年
５月在中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室进行。
１．２ 方法
１．２．１ 材料栽培 选取均匀一致的黄花苜蓿和蒺藜苜蓿种子，用浓硫酸处理，春化后生根。待根长到１ｃｍ左右
时种到直径１０ｃｍ的小盆中。每盆４株，为求条件一致，２个品种的苜蓿种于同一盆中，相同品种对角种植。培
养土为蛭石∶泥炭土＝２∶１，各盆中培养土量一致。控制条件（光照１４ｈ／２６℃，黑暗１０ｈ／１８℃，相对湿度均为
５０％），使之正常生长。
１．２．２ 干旱处理 当苜蓿在适宜条件下长至４周时开始处理。先将数盆苜蓿浇透水开始干旱处理，以后每隔数
天依次进行干旱处理，最后同时取样，干旱处理天数为４，６，８和１０ｄ。收样时，正常生长的为对照，将不同干旱时
间地上部样品等量混合为干旱处理，液氮速冻后存放于－７０℃超低温冰箱。
１．２．３ 差减文库构建 使用ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（ＴａＫａＲａ）进行总ＲＮＡ的提取，总ＲＮＡ经检验没有降解后，再使用
ＰｏｌｙＴｒａｃｔｍＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｏｒｍｅｇａ）对其中的ｍＲＮＡ进行磁珠法分离。
然后使用ＰＣＲＳｅｌｅｃｔＴＭｃＤＮＡＳｕｂｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），参照其说明书进行操作获得干旱诱导基因的表
达序列标签 （ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）。ｃＤＮＡ的合成：提取干旱处理和正常材料的ｍＲＮＡ分别作为检测
样本（ｔｅｓｔｅｒ）和参照样本（ｄｒｉｖｅｒ），在反转录酶的作用下将它们的ｍＲＮＡ转录为ｃＤＮＡ；ｃＤＮＡ的酶切：将ｔｅｓｔｅｒ、
ｄｒｉｖｅｒ的双链ｃＤＮＡ分别用ＲｃａⅠ酶切，产生较短的平头末端；接头连接：将ｔｅｓｔｅｒ样本经酶切后的ｃＤＮＡ片段
分为２份，分别接上接头１（Ａｄａｐｔｅｒ１）和接头２Ｒ （Ａｄａｐｔｅｒ２Ｒ），形成 Ａｄａｐｔｅｒ１ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ，Ａｄａｐｔｅｒ２Ｒ
ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ；扣除杂交：用过量的ｄｒｉｖｅｒ加入到 Ａｄａｐｔｅｒ１ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ 和 Ａｄａｐｔｅｒ２ＲｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ中加热变
性后分别退火杂交，再将第１次杂交后的产物混合，加入新制备的变性ｄｒｉｖｅ，再次退火杂交，得到干旱胁迫下特
异表达基因的片段；ＰＣＲ扩增：扣除杂交后的产物需２次ＰＣＲ才能有效地扩增有差别表达的片段。在ＰＣＲ反应
中，只有干旱诱导表达基因的ｃＤＮＡ片段能以指数级扩增。
最后将这些片段纯化后连接ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体（Ｐｏｒｍｅｇａ），转化大肠杆菌感受态，菌液ＰＣＲ鉴定后进行测
序。
１．２．４ 生物信息学分析 将２个文库测序出的ＥＳＴ片段使用生物序列分析软件ＤＮＡＳｔａｒ进行去低质量片
段、去接头、去重复、并进行拼接。然后将这些序列使用碱基局部比对检索工具ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、基因语义分类ＧＯ（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙｃａｔｅｇｏｒｙ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）和京都基因与基因
组百科全书ＫＥＧＧ（ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）进行分析。
１．２．５ 基因表达模式分析 从筛选出的干旱响应基因中，选取了１个乙烯响应因子（ｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｆａｃｔｏｒ，
ＥＲＦ）家族的转录因子基因 犈犚犖１（ＥＵ０３８８０２）以及１对同源的胚胎发育晚期丰富蛋白基因 犕犳犆犃犛３０
（ＥＵ１３９８６５）和犕狋犆犃犛３１（ＥＵ１３９８７１），进行干旱处理下基因表达的半定量分析，犈犚犖１半定量引物为５′ＧＴ
ＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧ３′和５′ＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣ３′，黄花苜蓿 犕犳犆犃犛３０的半定量引物
为５′ＣＴＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴ３′和５′ＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＴＡＣＣＣ３′，蒺藜苜蓿 犕狋犆犃犛３１的半定量
引物为５′ＡＴＣＡＡＡＣＡＣＧＴＡＧＧＧＴＴＧ３′和５′ＧＧＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＡＧＴ３′。使用犃犮狋犻狀（引物为５′ＡＣ
ＧＡＧＣＧＴＴＴＣＡＧＡＴＧ３′和５′ＡＣＣＴＣＣＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡ３′）作为内标。
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２ 结果与分析
２．１ ２个文库的测序
分别从黄花苜蓿和蒺藜苜蓿差减文库中挑取了
６６７和５６５个单克隆进行测序，得到了５１５和５４７条
ＥＳＴ序列。经过 ＤＮＡＳｔａｒ的处理，黄花苜蓿得到
３９１条非冗余序列，包括７８条拼接序列和３１３条单序
列；蒺藜苜蓿得到３５３条非冗余序列，包括５７条拼接
序列和２９６条单序列（表１）。
表１ 对照和干旱文库的犈犛犜统计结果
犜犪犫犾犲１ 犛狋犪狋犻狊狋犻犮狊狅犳犈犛犜狊犳狅狉犕．犳犪犾犮犪狋犪犪狀犱
犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪犾犻犫狉犪狉犻犲狊
材料
Ｍａｔｅｒｉａｌ
表达序列
标签
ＥＳＴｓ
非冗余序列 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ
拼接序列
Ｃｏｎｔｉｇｓ
单序列
Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓ
总计
Ｔｏｔａｌ
黄花苜蓿犕．犳犪犾犮犪狋犪 ５１５ ７８ ３１３ ３９１
蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪 ５４７ ５７ ２９６ ３５３
２．２ 序列的生物信息学分析
ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ分类包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面信息。在基因表
达谱分析中，ＧＯ分类常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用ＧＯ数据库的知识体系
和结构特点，旨在发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能基因的组合［２２］。ＧＯ分
类将２个文库的ＥＳＴ序列分成细胞定位、分子功能和生物功能三大部分，每部分又有细化（图１）。
图１ 黄花苜蓿和蒺藜苜蓿犈犛犜序列的犌犗分类
犉犻犵．１ 犌犗犮犪狋犲犵狅狉狔狅犳犈犛犜狊犳狉狅犿犕．犳犪犾犮犪狋犪犪狀犱犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪犾犻犫狉犪狉犻犲狊
Ａ：黄花苜蓿 犕．犳犪犾犮犪狋犪；Ｂ：蒺藜苜蓿 犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪；ａ：细胞Ｃｅｌ；ｂ：细胞组成Ｃｅｌｐａｒｔ；ｃ：包膜Ｅｎｖｅｌｏｐｅ；ｄ：胞外区Ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｒｅｇｉｏｎ；ｅ：大分
子复合体 Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｏｍｐｌｅｘ；ｆ：膜／内膜 Ｍｅｍｂｒａｎｅ／ｅｎｃｌｏｓｅｄｌｕｍｅｎ；ｇ：细胞器 Ｏｒｇａｎｅｌｅ；ｈ：细胞器组成 Ｏｒｇａｎｅｌｅｐａｒｔ；ｉ：抗氧化活性 Ａｎ
ｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ；ｊ：连接Ｂｉｎｄｉｎｇ；ｋ：催化活性Ｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ；ｌ：酶调节活性Ｅｎｚｙｍｅｒｅｇｕｌａｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ；ｍ：分子传导活性 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ
ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｎ：动力活性 Ｍｏｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ；ｏ：结构分子活性Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｍｏｌｅｃｕｌｅａｃｔｉｖｉｔｙ；ｐ：转录调控活性Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ；ｑ：翻译调控活
性Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ；ｒ：转运活性Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ；ｓ：生物调节Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ；ｔ：细胞过程Ｃｅｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓ；ｕ：发育过程Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｒｏｃｅｓｓ；ｖ：定位建立Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ；ｗ：定位Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ；ｘ：大分子复合体亚基组成 Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｏｍｐｌｅｘｓｕｂｕｎｉｔ
ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；ｙ：代谢过程 Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ；ｚ：多细胞生物过程 Ｍｕｌｔｉｃｅｌｕｌａｒｏｒｇａｎｉｓｍａｌｐｒｏｃｅｓｓ；ａｂ：色素沉着Ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ａｃ：刺激响应 Ｒｅ
ｓｐｏｎｓｅｔｏｓｔｉｍｕｌｕｓ；ａｄ：电子运载活性Ｅｌｅｃｔｒｏｎｃａｒｒｉｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ．
７７１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
ＫＥＧＧ是系统分析基因功能、基因组信息的数据
图２ 黄花苜蓿和蒺藜苜蓿犈犛犜序列的犓犈犌犌分类
犉犻犵．２ 犓犈犌犌犮犪狋犲犵狅狉狔狅犳犈犛犜狊犳狉狅犿犕．犳犪犾犮犪狋犪
犪狀犱犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪犾犻犫狉犪狉犻犲狊
ＡＡＭ：氨基酸代谢 Ａｍｉｎｏａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ＢＰＮＰ：聚酮和非核糖
体肽 合 成 Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓａｎｄｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ；
ＢＳＭ：次生代谢产物的合成 Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ；
ＣＭ：碳水化合物代谢 Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ＥＭ：能量代谢 Ｅｎ
ｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ＧＢＭ：多糖合成及代谢 Ｇｌｙｃａｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄ
ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ＬＭ：脂类代谢Ｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ＭＣＶ：辅因子和维生
素代谢 ＭＣＶ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｃｏｆａｃｔｏｒｓａｎｄｖｉｔａｍｉｎｓ；ＭＯＡＡ：其他氨
基酸代谢 Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｏｔｈｅｒａｍｉｎｏａｃｉｄｓ；ＸＢＭ：生物异源物质降解
及代谢 Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ＧＩＰ：遗传信息处
理 Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ；ＥＩＰ：环境信息处理Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ；ＣＰ：细胞过程Ｃｅｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．
库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体
网络进行研究。基因组信息包括完整和部分测序的基
因组序列，图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信号
传递、细胞周期，同系保守的子通路以及关于化学物
质、酶分子、酶反应等信息。ＫＥＧＧ提供的整合代谢
途径查询十分出色，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等
的代谢及有机物的生物降解，不仅提供了所有可能的
代谢途径，而且对催化各步反应的酶进行了全面的注
解。ＫＥＧＧ是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究
的强有力工具［２３］。使用ＫＥＧＧ对干旱胁迫下２种苜
蓿的ＥＳＴ进行了分析，ＫＥＧＧ将其分成１３个代谢过
程（图２）。
２．３ 犈犚犖１和犕犳犆犃犛３０／犕狋犆犃犛３１干旱胁迫下的表
达
黄花苜蓿和蒺藜苜蓿具有很近的亲缘关系，两者
之间的基因具有很高的相似性［２４］。基于此点，分析了
２种苜蓿同源基因在干旱胁迫下的表达差异。
犈犚犖１是ＥＲＦ家族的转录因子，通过分析其在２
种苜蓿中的表达（图３），表明随着干旱胁迫程度的增
加该基因在黄花苜蓿中的表达量逐渐增加，而在蒺藜
苜蓿中干旱响应上调后第６天表达量开始下降。
黄花苜蓿的 犕犳犆犃犛３０和蒺藜苜蓿的 犕狋犆犃犛３１
均在各自的差减文库中被发现，半定量试验表明
犕犳犆犃犛３０和犕狋犆犃犛３１均受干旱诱导上调表达，但是犕犳犆犃犛３０响应干旱比犕狋犆犃犛３１早，并且表达量高（图３）。
图３ 犈犚犖１和犕犳犆犃犛３０／犕狋犆犃犛３１在干旱胁迫下的表达水平
犉犻犵．３ 犜犺犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犾犲狏犲犾狅犳犈犚犖１犪狀犱犕犳犆犃犛３０／犕狋犆犃犛３１狌狀犱犲狉犱狉狅狌犵犺狋狊狋狉犲狊狊
３ 讨论
３．１ 差减文库的构建
抑制性差减杂交技术已广泛应用于筛选抗性基因的研究中，例如干旱［２０，２１］，低温［２５］，盐［２６］，高温［１９］以及低
磷［２７］等。但是这些研究都是就１个物种进行差减文库的构建，而本研究平行构建黄花苜蓿和蒺藜苜蓿２个干旱
相关的差减文库，不仅得到了各自干旱响应的基因，而且还可以通过２个文库的比较发现更加抵抗干旱胁迫的黄
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花苜蓿中的特异基因。
３．２ 差异基因的分析
通过比较黄花苜蓿和蒺藜苜蓿ＥＳＴ的ＧＯ分类，发现在细胞定位大类中的胞外区（ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｒｅｇｉｏｎ）和
膜／内膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ／ｅｎｃｌｏｓｅｄｌｕｍｅｎ）是黄花苜蓿所特有的，这些基因编码的是细胞的组成部分，可能在干旱胁迫
下对于稳定细胞结构起到了重要作用。在分子功能大类中黄花苜蓿的抗氧化活性（０．３６％／０．１７％）、分子传导活
性（０．３６％／０．１７％）和转录调控活性（１．２８％／０．７１％）都比蒺藜苜蓿占的比例高，这可能有利于黄花苜蓿在干旱
胁迫下感受信号，激活抗氧化系统，并且在基因转录水平上进行调控以应对干旱胁迫。生物功能大类中黄花苜蓿
刺激响应（１．８２％／１．０６％）较蒺藜苜蓿高，表明黄花苜蓿受到胁迫后更易表达相应的基因以应对干旱。
ＫＥＧＧ分析表明，干旱胁迫下黄花苜蓿的氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢都比蒺藜苜蓿快速。黄
花苜蓿氨基酸代谢加速也许是由于脯氨酸对干旱的响应造成的，而更加活跃的碳水化合物和能量的代谢不仅可
以为黄花苜蓿在干旱胁迫下提供足够的能量，还可以提供植物其他代谢过程所必需的底物。这些变化都有利于
黄花苜蓿可以在适度干旱的情况下保持正常的生长状态。
ＥＲＦ家族基因在植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫过程中起到重要的作用，如调节与植物生物胁迫有关的
犘犚基因和狉犱２９犃，狉犱１７等植物的非生物胁迫有关的基因表达［２８３０］。超表达苜蓿ＥＲＦ家族的犠犡犘１基因可以
增强植物对干旱的抗性［１７］。犕狋犈犚犖１最早被发现对苜蓿根瘤的发育具有重要作用［３１］，本研究发现该基因也响
应干旱胁迫，预测对抵抗干旱胁迫也具有一定的作用。但是２种苜蓿的表达模式不尽相同（图３），蒺藜苜蓿在受
到较轻的干旱胁迫时便已经大量表达，黄花苜蓿此时也开始上调表达，但是上调倍数较蒺藜苜蓿小，可能是因为
蒺藜苜蓿对干旱胁迫更加敏感。随着干旱的加剧，黄花苜蓿该基因表达量不断上调，而蒺藜苜蓿却出现下降的趋
势。黄花苜蓿该基因在较强干旱胁迫的条件下仍能保持较高的表达量，这可能有助于增强其对干旱的抵抗能力。
脱水素属于胚胎发育晚期丰富蛋白的ＤＩＩ家族，在植物中普遍存在，其表达受到干旱、低温、盐和外源ＡＢＡ
等的诱导［３２］。黄花苜蓿中的犕犳犆犃犛３０和蒺藜苜蓿中的犕狋犆犃犛３１是一对同源脱水素蛋白，最早发现受低温诱
导，并且犕犳犆犃犛３０在黄花苜蓿中为多拷贝，而犕狋犆犃犛３１在蒺藜苜蓿中为单拷贝，再加之犕犳犆犃犛３０上游存在多
个识别低温信号的ＣＲＴ／ＤＲＥ元件，使得犕犳犆犃犛３０在受到低温胁迫时能够更快更多的表达［７］。这２个基因都
能受水分胁迫的诱导而大量表达，而且趋势与低温胁迫下相似，都是犕犳犆犃犛３０受胁迫诱导早且表达量高。已将
该基因进行拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）和苜蓿的遗传转化，以进一步研究其在非生物胁迫下的功能。
参考文献：
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（ＳＳＨ）
１８１第２１卷第６期 草业学报２０１２年