全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第1期，2006年2月 155
拟南芥CBF冷反应通路
杨家森1,2 张洪涛1,2 李新国2,* 毕玉平2,**
1山东师范大学生命科学学院，济南250014；2山东省农业科学院高新技术研究中心，济南250100
The CBF Cold Response Pathway in Arabidopsis
YANG Jia-Sen1,2, ZHANG Hong-Tao1,2, LI Xin-Guo2,*, BI Yu-Ping2,**
1College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014, China; 2High-Technology Research Center, Shandong
Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China
提要 就植物在遭受冷胁迫时被激活的应对冷胁迫伤害的两种反应通路中的CBF冷反应通路，从CBF的发现到调控机制
以及通路组成的研究进展作了介绍。
关键词 CBF；冷反应通路；冷胁迫；抗逆性
收稿 2005-07-22修定 2005-11-21
资助 国家自然科学基金项目(30571126)、山东省优秀中青
年科学家科研奖励基金(2005BS06003)和山东省作物生
物学重点实验室项目。
*通讯作者(E-mail: lixinguo@tom.com, Tel: 0531-83179047)。
** 通讯作者(E-mail: yupingbi@vip.sina.com, Tel: 0531-83179842)。
在自然界中，植物不可避免地遭受各种环境
因子的胁迫，其中低温是影响植物生存的主要环
境胁迫因子之一(李新国等2005)。在冷胁迫时，
植物不仅能够进行相应的形态改变，而且还会通
过一定的生理变化来抵御胁迫(Joglo-ottoson等
1998；Gilmour等2000；McKown等1996；Wanner
和Junttila 1999)。据统计，世界上每年因冷害造
成的农业损失高达数千亿美元(利容千和王建波
2002)，植物抗冷性研究一直是植物抗逆性研究中
的热点之一(Li等2003，2004)。人们很早就发
现，许多植物在遭受严寒前，若经过一个缓慢的
降温过程，其抗冷性会逐渐提高，这一过程称为
冷驯化或冷锻炼(Guy 1990；Hughes和Dunn
1996)。在此过程中，主要有两种反应通路被激
活(Chinnusamy等2003b；Kanaya等1999): 一是
依赖于ABA的通路，在这个通路中包括ABA应答
元件和ABA应答结合蛋白；另一个是独立于ABA
的通路，CRT/DRE (C repeat/dehydration respon-
sive element)和CBF (CRT/DRE-binding factor)认为
是这一通路的主要元件。在这些反应通路被激活
的过程中涉及许多基因的调控表达，这些基因直
接或间接地参与反应通路。正是这些基因对植物
的抗冷起一定作用，才引起研究者致力于分离鉴
定此类基因的兴趣。但研究发现此类基因中大部
分对植物抗冷性的影响并不明显，直至发现CBF
后，植物抗冷性研究才有了很大进展(Storckinger
等1997)。CBF是一类反式作用因子，它能调控
一大类与抗冷相关基因的表达，从而较大地提高
植物的抗冷性。因而CBF通路成为抗冷性研究的
热点问题，其通路成分也日渐明晰。
1 CBF因子的发现
冷驯化过程涉及多种基因的调控表达，包括
COR (cold-regulated)基因(Hajela等1990)。而许多
COR基因的协同诱导表达则表明可能存在调节
COR基因表达的调控因子(Joglo-ottoson等1998；
Hajela等1990)。人们进一步研究发现，这些COR
基因的启动子中存在一个共同序列CCGAC，称为
CRT或DRE序列，Liu等(1998)推测可能是反式
作用因子的结合部位。随后，Stockinger等(1997)
通过酵母单杂交从拟南芥cDNA文库中分离出
CBF1。CBF1在拟南芥中过量表达，在非寒冷情
况下可诱导COR基因的表达，并能提高拟南芥的
抗冷性、抗旱性和抗盐性，但CBF1基因的表达
只受低温诱导，并不受干旱和高盐的调控(Joglo-
ottoson等1998)。Medina等(1999)的研究也表明，
提高ABA水平并不能提高CBF基因的表达量，表
植物生理与分子生物学 Plant Physiology and Molecular Biology
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2006.01.052
植物生理学通讯 第42卷 第1期，2006年2月156
明此通路为独立于ABA的途径。拟南芥CBF1在
酵母中表达，可诱导带有CRT/DRE序列报告基因
的表达(Storckinger等1997)。以上这些研究表
明，CBF1可能是调控植物抗冷基因(主要是COR
基因)表达的“总开关”，在拟南芥CBF冷反应
通路中起作用。
后来又陆续发现了CBF2、CBF3。与CBF1
基因包含642个核苷酸相比，CBF2和CBF3基因
各含有651个核苷酸，与CBF1基因的核苷酸同
源性分别达81%和84%，高度同源。这3个CBF
基因的可读框中都没有内含子(Medina 等1999；
Shinwari等1998)。进一步研究表明，CBF2、
CBF3与CBF1基因具有相似的功能，3个基因串
联排列在拟南芥第四染色体上，其中CBF3位于
CBF1下游3 kb处，CBF2位于CBF1下游7 kb处
(Medina 等1999)。尽管CBF基因的启动子并不含
有CRT/DRE序列，但它仍然能被低温诱导，并
先于COR基因表达，因此推测可能还有其他因子
调控CBF基因的表达。基因表达分析表明，CBF
基因表达并无组织特异性(Medina等1999；Shinwari
等1998)，且呈瞬时表达，当植株处于4℃条件
下，40 min内即可检测到CBF基因的表达，2 h
达到最大，其后逐渐减弱，5 h内含量仍然较高
(Shinwari等1998)。这也充分说明，CBF只起反
式作用因子功能，而无直接改善植物抗冷性的作
用。
2 CBF因子的结构特点
自从发现CBF1具有反式作用因子功能后，
人们就致力于CBF的序列分析。通过CBF家族内
3个基因的比较，发现了许多序列信息。
2.1 CBF基因序列的结构特点 CBF基因能被低温
诱导，说明其启动子中必然存在被调控的位点。
所以，对CBF基因序列的研究主要集中于启动子
部分。CBF虽然也能被低温诱导，但其启动子中
并不含有CRT/DRE序列，即CCGAC，而是含有
其相反序列CAGCC；另外，与CRT/DRE只有1
个碱基差别的序列CCGTC则存在于CBF1基因启
动子中(Medina等1999；Gilmour等1998)。进一
步分析表明，Myc蛋白的识别序列CANNTG也存
在于CBF基因启动子中(Gilmour等1998；
Blackwell等1993)。值得注意的是，一个重复序
列ACAATTANNNACAATTT存在于CBF基因启动
子中，每个基因只有1个，并且位置大体一致，
这意味着它是极有可能起作用的(Gilmour等1998)。
但以上这些潜在的识别序列基本上是通过序列比较
得出的，很少有实验验证，因此它们是否真正起
作用以及起多大作用，还需进一步研究。
2.2 CBF蛋白序列的结构特点 CBF作为反式作用
因子，起调控作用的主要是蛋白质，因此对CBF
蛋白一级序列结构以及其空间结构的研究也比较
多，其中对CBF1的研究尤其深入。CBF1由213
个氨基酸组成，分为4个区域(Kanaya等1999；
Storckinger等1997): 氨基末端区域(氨基酸1~
132)、潜在核酸定位信号区(氨基酸33~47)、AP2
区域(氨基酸48~106)和酸性区(氨基酸107~213)。
研究表明，CBF因子的AP2区域能与COR基因启
动子的CRT/DRE序列结合，刺激COR基因的表
达(Kanaya等1999；Gilmour等1998)。将缺失部
分氨基酸的CBF1导入大肠杆菌中，并进行下游
报告基因检测时发现，AP2区和酸性区对CBF执
行功能来说都至关重要，而氨基末端区域则不是
必需的(Kanaya等1999)。CBF蛋白中还存在蛋白
激酶C和酪蛋白激酶Ⅱ的潜在识别位点，据此，
Medina等(1999)推测这些潜在识别位点对CBF执
行反式作用因子功能可能起作用。
二级结构预测表明，CBF1蛋白有2个a螺
旋，一个a螺旋位于氨基末端，另一个位于AP2
域内(Kanaya等1999)。AP2域内的a螺旋已通过
CD光谱分析得到证实，它对于AP2域结合CRT/
DRE序列来说至关重要。还有6个 b 折叠，其中
3个位于CBF1蛋白的AP2域内，另外3个位于Ｃ
末端酸性区域，推测其对CBF因子结合顺式作用
元件可能起作用(Kanaya等1999)。
通过CD光谱对CBF1完整和截短的蛋白进行
二级结构分析表明，CBF1蛋白在-5~30℃范围内
表现出可逆的冷变性，在40~60℃范围内表现为
热变性(Kanaya等1999)。冷变性主要存在于氨基
末端区和酸性区，而热变性存在于AP2域。冷变
性是CBF蛋白的一个重要特征(Kanaya等1999)，
它是由水与暴露于溶液中的蛋白质非极性基团相互
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作用产生的。在常温下，非极性基团通过氢键相
互作用存在于蛋白质分子内部；温度降低时，氢
键作用力减小导致低温下CBF蛋白分子延伸。
AP2区在-5~30℃范围内稳定性很强，这就保证
了其在低温下与CRT/DRE序列结合，实现CBF1
蛋白低温下的调控功能。
CBF2、CBF3与CBF1蛋白具有相似的结构
和功能(Medina等1999；Shinwari等1998；Gilmour
等2004)，它们调控的机制也大体相同。
3 CBF通路及其调控因子
自从发现冷调控反式作用因子CBF后，人们
就开始致力于对其通路的研究，并分离鉴定该通
路的作用因子。CBF通路非常复杂，涉及的因子
很多。Vogel等(2005)通过基因芯片杂交发现，至
少有85个冷诱导基因和8个冷抑制基因与CBF2有
关；Maruyama等(2004)也用类似的方法鉴定了38
个CBF3的下游基因，其中20个为尚未报道的基
因，这些基因都参与CBF通路，但对其研究相当
肤浅。就目前研究情况来看，CBF通路主要包括
两步级联放大步骤(Thomashow等2001): 第一步，
CBF基因的诱导表达，即正常生长温度下存在的
一些未知激活因子(如：ICE)能在低温下诱导CBF
基因家族的表达；第二步，COR基因的诱导表
达，即CBF诱导下游逆境基因的表达。这种级联
放大能使植物迅速启动多种生理变化，以应对低
温对植物造成的伤害。另外，抗冷植物CBF通路
与非抗冷植物的CBF通路可能并不相同，Zhang
等(2004)的实验表明，将番茄CBF1基因导入抗冷
植物拟南芥中，拟南芥的抗冷性可提高；但在番
茄中过量表达自身的CBF1则不能提高其抗冷性。
此现象可能是由于两类植物的CBF通路不同所
致。以下重点介绍拟南芥CBF通路中几种研究得
比较清楚的调控因子。
3.1 CBF上游调控因子 CBF基因本身是冷诱导的，
CBF通路的上游调控对CBF基因的表达及其抗冷
性至关重要，相关作用因子较多，如：HOS1 (high
expression of osmotic stress-regulated gene expres-
sion 1)、ICE1 (inducer of CBF expression 1)和
CAX1 (cation exchanger 1)等均能调控CBF基因的
表达。这些调控因子既有正调控也有负调控，相
互协调共同维持CBF通路的畅通。
ICE1是一个上游调控因子，早在1998年，
Gilmour等(1998)就预测到它的存在，并认为CBF
基因启动子中存在ICE结合位点(ICE盒)。ICE在
常温下处于非激活状态，当有冷信号存在时，可
能在某个(或某些)未知因子介导下，ICE由非活化
状态转变为活化状态，并结合于CBF基因启动子
的ICE盒处，从而激活CBF基因的转录。后来，
Chinnusamy等(2003a)分离并鉴定了ICE1基因。他
们将一个CBF3-LUC基因(一个含有CBF3基因启
动子与发光荧光素酶基因LUC的重组DNA分子)导
入到拟南芥的基因组中，目的是创造出能够在寒
冷环境下生物发光的植物。进而对这些低温应答
的生物发光植物进行诱变，筛选出低温条件下不
再发光的植株，从而得到了一个突变体ice1。结
果发现这个突变体阻止了CBF3的表达，CBF下
游基因的表达量也减少。生物芯片分析也表明，
在ice1拟南芥突变体中，超过70%的低温应答基
因被错误调控，以致植物的耐寒性和耐冻性大大
降低(Chinnusamy等2003a)。表达分析表明，ICE1
基因为组成型表达，并且过量表达ICE1基因的植
株与野生型植株相比较，在常温下并没有提高
CBF3基因的表达量，但在低温下却提高了CBF3
基因的表达量，符合Gilmour等(1998)的设想。
ICE1基因编码一个类似MYCbHLH (MYC-like ba-
sic helix-loop-helix)的蛋白，由494个氨基酸组
成，DNA结合实验表明它能与CBF基因启动子的
MYC识别序列CANNTG (即 ilmour预测的ICE盒)
结合(Chinnusamy等2003a)，而ICE盒正是激活CBF
基因转录的重要顺式作用元件(Zarka等2003)。
HOS1是另一个重要的上游调控因子，在拟
南芥中为组成型表达，常温下位于细胞质内，受
冷胁迫后迅速积累到细胞核内，这种质-核穿梭
在冷环境下可能介导一定的冷反应信息。Ishitani
等(1998)筛选分离了一个hos1-1突变体，此突变
体可提高C B F基因及下游冷应答基因的表达，
如：RD29A (responsiv to dehydration 29a)、
COR49、COR15、KIN1(cold induced 1)和ADH
(alcohol dehydrogenase)。正常植株的这些基因都
能被ABA、高盐和寒冷诱导，但该突变体只有寒
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冷条件下明显提高这些基因的诱导量，因此推测
HOS1是通过负向调控CBF从而调控COR基因表
达的。HOS1基因表达量在冷胁迫10 min内有所
下降，1 h后即恢复至原初水平(Ishitani等1998)，
即瞬时减少，与CBF基因表达量瞬时增加是相对
应的，这种变化在时间上也早于后者，从而更充
分地说明HOS1是处于CBF上游的。HOS1基因编
码一种环指蛋白。业已证实许多类似的环指蛋白
都具有泛素E3连接酶作用，也就是说，E3负责
将泛素连接到异源底物或/和环指蛋白本身上。E3
的这种介导非常重要，它还有辨认特定蛋白质的
功能，其作用关系到许多特定蛋白的降解。于
是，有人据此推测，低温下HOS1能介导某个(或
某些)未知CBF上游激活因子的降解(Lee等2001)。
在野生型拟南芥中异位表达HOS1基因可导致
HOS1共抑制现象的发生，出现与突变体hos1相
似的表型(Lee等2001)，这似乎表明HOS1具有泛
素E3连接酶的作用(即介导自身降解)。尽管有人
推测HOS1可能控制着ICE状态的转变(Lee等
2001；Thomashow 1999)，但HOS1是否具有泛
素E3连接酶作用以及对哪种(或哪些)蛋白的降解
起介导作用还不明确，尚有待进一步研究。综合
以上结果，可以认定HOS1通过降解某个(或某些)
未知CBF激活因子负向调控CBF基因的转录。除
此之外，HOS1基因似乎还调控其他基因，如hos1
突变体对乙醇脱氢酶基因的冷诱导有影响，而这
个基因并不在CBF因子的调控之下；HOS1也是
目前所发现的唯一的一个既调控抗冷性又调控春化
作用的基因(Ishitani等1998)。
另外，还有许多其他上游调控因子，如 LOS4
(low expression of osmotically responsive gene 4)
(Gong等2002)，它编码含DEAD结构域的RNA
解旋酶蛋白。功能研究的结果表明，此种RNA解
旋酶参与mRNA由核内向核外运输的过程，能正
向调控CBF及其下游基因的表达。拟南芥的Ca2+/
H+ 反向共同运输蛋白CAX1对寒冷反应行负调控，
若破坏CAX1的功能，即可提高突变株的耐寒
性，CAX1可能通过调节CIPK3 (CBL-interacting
protein kinase 3)和CDPKs(calcium-dependent pro-
tein kinases)基因来开启低温反应基因CBF/DREB
及其下游应答基因的表达(Catala等2003)。
3.2 CBF自身调控 CBF基因家族中，各基因成员
之间的表达是否存在一定的相互调控作用，还存
在争论。Gilmour等(1998)认为CBF基因的冷诱导
表达并不涉及自身调节，其主要依据是：(1)过量
表达CBF1的拟南芥转基因植株中没有检测到
CBF3基因转录的改变；(2) 3个CBF基因的启动
子中都不含有CRT/DRE序列。而Novillo等(2004)
则认为CBF2能负调控CBF1和CBF3基因的表达。
他们通过T-DNA插入缺失突变的方法，获得了
cbf2缺失突变植株，分析cbf2突变体时发现T-
DNA插到了CBF2基因启动子的TATA框中，以
致CBF2基因转录的缺失。但拟南芥cbf2突变体
比野生型更具抗冷性，且突变体的CBF1和CBF3
基因表达量比野生型的更高，其下游冷应答基因
的表达量也是如此。因此推测，CBF2负调控
CBF1和CBF3基因，并先于CBF1和CBF3基因
的表达。进一步对低温条件下拟南芥CBF基因的
瞬时表达情况分析表明，CBF1和CBF3都比CBF2
基因表达得早，当CBF2基因表达量在低温处理
2.5 h达到最大时，CBF1和CBF3基因的表达量
已经降低了很多。这与CBF2负调控CBF1和CBF3
的推测相一致。微阵列实验也表明，在常温下，
CBF2基因的转录水平比CBF1和CBF3高5~8倍
(Chinnusamy等2003a；Fowler和Thomashow
2002；Chen等2002)。因此，这些研究者认为，
当植物处于常温下时，CBF2基因的表达水平足
以抑制CBF1和CBF3基因的表达；当植物遭受
寒冷时，某些特异的上游激活因子(如：ICE因子)
图1 CBF2负调控CBF1和CBF3机制示意(Novillo等2004)
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迅速激活CBF1和CBF3基因的表达而逃脱CBF2的
抑制，当CBF1和CBF3基因的表达量达到一定水
平时，CBF2基因被诱导表达，进而抑制CBF1和
CBF3基因的表达。据此，Novillo等(2004)还提
出如图1所示的CBF基因自身调控模式。此调控
模式结合CBF基因能调控下游应答基因的事实，
同时提出CBF1和CBF3能够正向调控CBF2基因表
达的假设，CBF1和CBF3基因的瞬时表达可以用
CBF2抑制来解释，而CBF2基因的瞬时表达可能
是某个(或某些)下游未知调控因子的反馈抑制，但
这还缺少足够的实验依据，尚待进一步探讨。
3.3 CBF下游调控因子 CBF的下游调控因子众多，
主要有COR、LOS2、SFR6 (sensitive to freezing
6)等，这些因子往往与植物的低温抗性直接相关，
如维持生物膜稳定性，消除活性氧等。
COR基因是一类在低温条件下高度表达(是正
常生长温度下的50~100倍)，并在抗冷中直接发
挥作用的基因。Thomashow实验室(Hajela等
1990；Lin和Thomashow 1992)分离了4个COR基
因，分别是COR6.6、COR15a、COR47和COR78；
另外，Yamaguchi-shinozaki和Shinozaki (1994)也
在拟南芥中发现一组抗旱基因RD。DNA序列分
析表明，COR78与RD29A、COR47与RD17分
别为同一基因。由DNA推导出的蛋白质序列表
明，COR6.6、COR15a和COR78编码亲水肽类，
而COR47则编码脱水肽类，这些蛋白可能在抗旱
及抗冷中起作用。启动子分析表明，这些COR基
因中含有共同的核心序列CCGAC，称为DRE或
CRT，并认为此序列为寒冷和干旱的顺式调控元
件，随后CBF/DREB1基因得到分离。这些COR
基因中，以COR15a研究得最为清楚(Artus等
1996)，它编码一个分子量为15 kDa的多肽，在
其转运到叶绿体时，COR15a被加工为9.4 kDa的
多肽，命名为COR15am，定位在叶绿体的基质
中。为了确定COR15a是否在抗冷过程中起作
用，Artus等(1996)获得了一个组成型表达
COR15a基因的拟南芥转基因植株，通过比较发
现转基因植株叶绿体在1~2℃时比野生型更具有抗
冷性。他们进一步研究表明，未经冷驯化的拟南
芥转基因植株中COR15a的过量表达可减少冷诱导
的叶绿体膜双分子层结构向六角形Ⅱ相结构的转
变，从而避免膜伤害(Artus等1996；Steponkus
等1998)。COR15a通过阻止冷害时膜系统向内弯
曲和稳定膜的脂双层结构来提高植物的抗冷性。
但单个COR基因的过量表达似乎并不能提高植株
的整体抗冷能力，必须联合其他COR基因共同作
用，这也许是通路末端基因的普遍特征之一。
Boyce等(2003)用化学诱变法获得一个拟南芥
冷驯化不敏感型突变体sfr6。在sfr6突变体中，
CBF1、CBF2、CBF3在低温下的积累均达到正常水
平，而COR基因却没有受诱导表达。显然，sfr6
对冷驯化的不敏感不是由于CBF基因对低温的不
响应，而是由于COR基因没有被有效激活所致。
所以，他们推测SFR基因编码的蛋白介导了CBF
蛋白与COR基因顺式作用元件CRT/DRE的结合。
Lee等(2002)通过对RD29A-LUC (RD29A启动
子与发光荧光素酶LUC的重组DNA分子)植株进行
甲烷乙磺酸盐(ethyl methane sulphonate，EMS)诱
变，获得了一个los2突变体。通常情况下，RD29A-
LUC转基因植株在寒冷、渗透胁迫和ABA诱导下
都有较强的荧光，与 A B A、高盐和 P E G
(polyethylene glycol)等胁迫条件相比，突变体los2
只在冷胁迫条件下荧光较弱，表明它只阻断低温
对RD29A-LUC基因的诱导。他们深入研究的结
果表明，低温胁迫条件下，突变体los2与正常植
株中CBF基因的表达量变化没有区别，这意味着
LOS2为CBF下游功能因子，直接或间接介导CBF
对COR/RD基因的激活。他们进一步研究发现，
LOS2基因编码一种烯醇酶(Lee等2002)，常温下
也有表达，但低温条件下大量积累，其启动子中
也含有CRT序列，这进一步表明LOS2基因可能
受CBF因子的直接调控。相关实验表明，烯醇酶
定位于细胞核，并与C-Myc启动子结合，反向
调控C-Myc的表达(Feo等2000)，这一结果有助
于LOS2功能的研究。
下游基因受CBF调控的同时也能对CBF基因
表达起反馈抑制。Guo等(2002)筛选出一个突变
体los1，此突变体中的CBF基因表达量增加，但
其下游基因表达量却减少，表明下游基因能够反
馈抑制CBF基因的表达。在LOS1基因缺失的条
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件下，下游基因的反馈抑制作用丧失，从而出现
CBF基因超表达的情况。
4 结语
低温是影响温带地区作物产量的一个主要因
素，大多数研究都致力于寻找提高作物耐低温的
方法，以期能提高产量和扩大种植的地理范围。
但植物抗冷性属于复杂的数量性状，靠单个基因
很难彻底改善植物抗冷性(Thomashow 1990)。CBF
通路的发现和研究已经取得可喜进展，从而为人
们改善植物的抗冷性提供了可能。通过过量表达
通路中的某些基因，尤其是关键基因，能在很大
程度上提高植物抗冷性。但对植物细胞如何感受
低温胁迫，又如何将这些胁迫信号传递到细胞核
中诱导转录因子CBF的表达，并调控下游的各种
功能基因的表达等一系列的分子机制迄今知之甚
少，有待探讨。
参考文献
李新国, 毕玉平, 赵世杰, 孟庆伟, 何启伟, 邹琦(2005). 短时低温
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