全 文 ：收稿日期:2005-10-26
作者简介:周建中(1979-), 男 ,河北人 。专业:食品科学。
文章编号:1002-8110(2006)01-0062-03
采用基因敲除手段降低啤酒酵母
蛋白酶A表达的研究
周建中1 ,王德良2 , 3 ,王忠民1 ,赵丽娟4 ,葛邦国1
(1.新疆农业大学食品学院 ,乌鲁木齐　830052;2.中国农业大学食品学院 ,北京 , 10009;
3.中国食品发酵工业研究院酿酒工程部 ,北京　100027;4.沈阳农业大学食品学院 ,沈阳　110161)
摘　要:采用醋酸锂转化法 ,将一段目的基因转入到酵母体内 , 破坏酵母 PEP4 基因的表达。通过对目的基因
的扩增和羧肽酶 Y酶活检测验证基因敲除情况 , 并通过传代抗性试验与传代发酵稳定性实验验证突变株遗
传稳定性良好。
关键词:酿酒酵母;基因敲除;羧肽酶 Y酶活性检测
中图分类号:TS261.11;TS262.5;Q789　　　　文献标识码:B
　　啤酒与其它饮料的最大区别就是倒入杯中后具有长久
不消的 、洁白细腻的泡沫。质量优异的啤酒起泡能力优良 ,
形成的泡沫细腻 , 泡沫色泽洁白 ,泡沫高度可达酒液量的三
分之一甚至二分之一 ,泡沫消失很慢 , 持久时间 4min 以上 ,
挂杯泡沫较多[ 1] 。啤酒中有大量有助于啤酒泡沫与提高泡
沫泡持性的组分 ,包括金属离子 、类黑精 、异-α-酸 、蛋白多
肽;多年来啤酒研究人员一直检测 、研究来源于啤酒的多肽 ,
研究发现有几种蛋白质与啤酒泡沫之间有很大的相关性;与
此同时大量研究结果表明 ,来自酵母细胞的蛋白酶 A可能消
化有助于啤酒泡沫稳定性的蛋白质 , 同时产生没有起泡性能
的多肽或者导致泡沫蛋白质分子分解 , 导致最终成品啤酒中
泡沫稳定性变弱[ 2] 。
在啤酒的发酵和成熟阶段 ,蛋白酶 A会从酵母细胞中释
放出来。为了控制蛋白酶的含量 , 目前可以采用的方法有:
⑴添加对蛋白酶 A 的抑制剂;⑵选择合适的发酵和贮酒工
艺 ,防止酵母衰老 ,死亡和自溶;⑶利用基因工程的手段改良
酵母 ,筛选出合适的菌株。前两种方法国内研究的较多 , 而
利用基因工程手段改良酵母菌株的方法在国内还是空白。
图 1　酵母细胞分泌蛋白酶A 到胞外和
降解泡沫活性蛋白的模式图
酵母蛋白酶 A 由位于酵母染色体 XVI 上的 YPL154C/
PEP4基因编码 , 碱基从 259713b 到 260930b , 共 1218 个碱基
对[ 3] 。本研究通过 PCR技术获得一段带有筛选标识和酵母
PEP4基因同源区域的目的基因 , 通过醋酸锂转化法 , 使目的
基因与酵母 PEP4基因发生同源重组 , 得到一株蛋白酶 A 失
活且遗传性能稳定的工业酿酒酵母。
1　材料与方法
1.1　菌种及质粒
C-0011酵母:中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心
保藏 ,是一株工业酵母 , 用于酿酒。
pFA6a-kanMX4 质粒:清华大学陈国强教授馈赠 , 是一
种穿梭质粒 ,在大肠杆菌中对氨苄青霉素有抗性 , 在酵母菌
中对遗传霉素G418有抗性。
1.2　培养基及试剂
1.2.1　培养基
HYLB 培养基:4.3%HYLB , 2%(V/V)三糖葡萄糖溶液 ,
10%(V/V)0.17moL/L KH2PO4 和 0.72moL/L K2HPO4 磷酸盐
缓冲液 ,用于培养大肠杆菌。
YPD培养基:1%酵母提取物 , 2%蛋白胨 , 2%葡萄糖 , 用
于培养酵母菌。
1.2.2　主要试剂
Taq , pfu酶由上海生工提供 , AMP、G418 由鼎国生物公司
提供 ,用于羧肽酶 Y酶活鉴定的试剂由SIGMA公司提供。
1.3　引物
引物由上海生工合成 ,引物序列见表1。
为了敲除 PEP4 基因 ,设计了一对引物 A、B ,此对引物是
依酿酒酵母 PEP4基因和 pFA6a-kanMX4 质粒中 kanMX基因
而设计的 ,酿酒酵母 PEP4 基因的序列可以通过网站 http://
www.yeastgenome.org/查询 ,该引物是用来扩增转入目的基因
的一对引物。A 和B 各有 39个碱基与酵母染色体 PEP4 基因
相同 ,用来进行同源重组。同时 A 和 B 还各有 20 个碱基与
质粒 pFA6a-kanMX4 中 kanMX基因相同 , 用来扩增kanMX 基
因 ,以筛选转化菌株。
·62·
第 33卷　第 1期
2 0 0 6 年 1 月　　　　　　　　　　　　　　　　　　
酿　　酒
LIQUORMAKING
　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.33 , No.1
Jan., 　2006
　　表 1 引物序列表
primer 　　　　　　Sequence5 to3
A GGTCAGCGCCAACCAAGTTGCTGCAAAAGTCCACAAGGCCGTTAGAACGCGGCTACAAT
B ATCGTAAATAGAATAGTATTTACGCAAGAAGGCATCACCGCCGATTCATTAATGCAGGT
1.4　方法
1.4.1　聚合酶链式反应[ 4]获得目的片段
1.4.2　醋酸锂转化法[ 5]转化酵母 DNA
1.4.3　菌种验证
通过抗性验证与羧肽酶 Y(CPY)酶活检测[ 6]验证。
羧肽酶 Y酶活检测:由于酵母液泡内的羧态酶 Y的活化
需要蛋白酶A , 如果蛋白酶 A失活 , 羧态酶 Y也就无法活化 ,
因此可用羧态酶 Y的平板检测法来间接的测出蛋白酶 A 是
否失活。
1.4.6　突变株抗性遗传稳定性实验
将突变株从保存的原始斜面开始 , 一代一代地传至新的
YPD斜面 , 共传 20 代 ,然后进行抗性验证。
1.4.5　突变株传代发酵稳定性试验
突变株从保存的原始斜面开始 , 一代一代地传至新的麦
芽汁斜面 , 共传 20 代 ,对这 20 代分别进行发酵实验 , 测定发
酵液中双乙酰的情况和发酵性能。
2　结果与讨论
2.1　转化目的片断的获得
以A、B为引物 , 以质粒 pFA6a-kanMX4 为模板进行 PCR
扩增 ,获得转化目的片段。
PCR 反应体系:10 ×Pfu DNA plo.buffer 2.5μL;20mM
dNTP S lμL;5U/μL Pfu polymerase 0.5μL;Template 2μL;10μMA、
B 各 1μL;ddwater加至 25ml , 液体石蜡密封。
PCR反应条件:94℃预变性 5min;35 cycles , 每个循环包
括:94℃变性 1min , 50℃退火 45s , 72℃延伸 2.5min;最后 72℃
延伸 10min。
图 2　PCR质粒DNA电泳结果
0.8%琼脂糖凝胶电泳结果如图 2 所示 , 转化目的片段
大小为 1783bp。
2.2　突变菌株的验证
2.2.1　抗性验证
将转化菌株 、原菌株 , 重新划含 G418 的抗性平板 , 转化
菌株仍能够长出如图 3所示 , 表明其体内含有 Kan r抗性 。而
原菌株在抗性平板上不长(未附)。
图 3　突变菌株生长于抗性平板
2.2.2　羧肽酶 Y酶活检测
1.在 YPD平板上培养菌落或菌苔(通常菌落长 3d , 菌苔
长 1d即可)。
2.小心把涂盖液加在平板表面使之完全覆盖细胞。
3.待琼脂凝固 5 ～ 10min后 , 小心用新鲜 Fast Gernet GBC
溶液冲刷表面。
4.显色 5min ,野生型菌株将变红 , 而羧肽酶 Y-菌株将
呈现黄色或粉红色。
图 4　羧肽酶 Y酶活检测结果
1 、2列 原菌株;3 、4列突变株
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第一期　　　　　　　　　　　逯家富 ,等:小麦啤酒的生产技术　　　　　　　　　　　　　　2006
5.倒出 Fast Gernet溶液以便更好的观察颜色的变化。
鉴定结果如图 4 所示 , 第一 、二列为原菌株显红色 , 第
二 、三列为突变菌株 , 显黄色。
经过如上验证可以判定突变菌株已经含有 Kanr 基因并
且蛋白酶已失活。
2.4　酵母突变株抗性遗传稳定性试验
原菌株在含有 20 μg/mLG418 的 YPD平板上不能生长 ,
而突变株在含有 200μg/ mLG418 的 YPD 平板上能够生长 , 那
么突变株的遗传稳定性可以通过是否对 200μg/mLG418 有抗
性来判定。
将传代的每一代酵母 , 共 20 代重新涂布含 200μg/
mLG418 的 YPD平板 , 抗性传代稳定性试验结果见表 2。
表 2 突变株抗性传代稳定性试验
菌株代数 原菌株 突变株
1 -- +++
2 -- +++
3 -- +++
4 -- +++
5 -- +++
6 -- +++
7 -- +++
8 -- +++
9 -- +++
10 -- +++
11 -- +++
12 -- +++
13 -- +++
14 -- +++
15 -- +++
16 -- +++
17 -- +++
18 -- +++
19 -- +++
20 -- +++
注:--表示不长;+++表示生长。
2.5　酵母突变株传代发酵稳定性试验
酵母突变株从保存的原始斜面开始 , 一代一代的传至新
的麦芽汁斜面 ,共传 8 代 , 对这 8 代工程菌分别进行发酵实
验 ,测定发酵液中双乙酰和发酵性状 , 结果见表 3。
　　表 3 突变株传代发酵稳定性试验
代数 双乙酰(mg/ L)突变株 原菌株
突变株发酵度
(%)
1 0.201 0.396 67.81
2 0.122 0.429 65.95
3 0.250 0.391 63.41
4 0.274 0.411 68.96
5 0.237 0.269 68.31
6 0.259 0.281 70.17
7 0.127 0.288 65.71
8 0.114 0.271 64.86
3　结论
3.1　通过基因敲除技术我们获得了一株 PEP4 基因突变的
工业酿酒酵母 ,这使得有目的改造工业酵母菌株成为可能。
3.2　通过对这株突变株进行初步的酶活测定 , 显示酵母蛋
白酶A 已失活。
3.3　突变株传代发酵稳定性及传代抗性良好 , 发酵指标较
稳定 ,没有发生随着传代基因丢失。
有关这株突变株的其他性能指标及发酵液中蛋白酶 A
的精确测量分析还有待做进一步研究。
[ 参考文献]
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Study on Disruption of Saccharomyces cerevisiae PEP4 Gene
ZHOU Jian-zhong1 ,WANG De-liang2 ,3 ,WANG Zhong-min1 ,ZHAO Li-juan4 ,GE Bang-guo1
(1.Xinjiang Agricultural University ,Wulumuqi ,830052 , China;2.College of Food Science , China Agricultural University , Bei jing ,100094 , China
3.China National Research Instintue of Food and Fermentation Industries , Beijing , 100027, China;
4.Shenyang Agricultural University ,Shenyang , 110034, China)
ABSTRACT:In this paper , we transform a gene into yeast genome so as to disrupt PEP4 gene by LiAc method.The mutant gene can be iden-
tified by PCR and testing enzyme activity of CPY.The mutant strain inheritance and ferment stability is well.
KEY WORDS:Saccharomyces cerevisiae , gene knock-out , CPY activity test
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第一期　　　　　　　　　 　　　　　　　酿　酒　　　　　　　　　　2006