全 文 ：中国农学通报 第22卷 第 8期 2006年 8月
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维生素E是一类人体所必需的脂溶性的维生素,
具有重要的生理功能。它能够清除脂质过氧化所产生
的自由基而稳定保护生物膜的脂双层,使细胞免受过
氧化物的伤害[1]。因而被作为一种有效的抗氧化剂广
泛地应用在医药、食品、饲料等行业中。
维生素 E的生产主要通过化学合成和天然提取
获得。化学方法合成的产品主要以醋酸酯的形式存
在,副产物多且生物活性低。天然提取的维生素 E在
生理活性和安全性上均明显优于合成维生素 E,活性
效力约为合成维生素 E的 1.3~1.4倍,因而正逐渐代
替合成产品成为主流,成为世界上发展速度最快的维
生素产品之一[2]。
维生素E是一组生育酚不同异构体的总称。其基
本结构是由一个疏水侧链和一个芳香环的极性头部
组成。根据侧链饱和度可分为生育酚(tocopherol)和三
烯生育酚(tocotrienol)两大类。每类依芳香环上甲基数
目和位置的不同又分别分为 α、β、γ、δ 生育酚和
α、β、γ、δ 三烯生育酚[3]。α 型有 3个甲基,β 和
γ 型有2个甲基,而 δ 型仅有1个甲基。α、β、γ、
δ-生育酚相对活性分别为100%、50%、10%和 3%[4],
α-三烯生育酚约为 30%,其他三烯生育酚为 10%左
右,其中 α-生育酚的活性最高[5],可被人体优先吸收
拟南芥γ-生育酚甲基转移酶启动子
在转基因烟草中的表达特性分析
朱永兴 1,2,周 建 2,王 磊 2
(1西北农林科技大学植物保护学院植保资源与病虫害治理教育部重点实验室,陕西杨凌 712100;
2中国农业科学院生物技术所,北京 100081)
摘 要:γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素 E生物合成途径中的关键酶之一,催化 γ、δ-生育酚甲
基化,生成活性较高的 α、β-生育酚。研究构建了含有 γ-TMT启动子和GUS报告基因的植物表达载
体,通过农杆菌介导转化烟草,筛选出 PCR阳性植株,进行 GUS组织化学染色,结果表明,在 γ-TMT
启动子的驱动下,报告基因GUS在烟草的根、茎、叶中均有表达。
关键词:烟草;维生素E;γ-生育酚甲基转移酶;启动子;GUS染色
中图分类号:Q786 文献标识码:A
CharacterizationofArabidopsisthalianaγ-TMTPromoterinTransgenicTobacoo
ZhuYongxing1,2,ZhouJian2,WangLei2
(1KeyLaboratoryofPlantProtectionResourcesandPestManagement,MinistryofEducation,
ColegeofPlantProtection,NorthwestA&FUniversity,YanglingShaanxi712100;
2BiotechnolgyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing100081)
Abstract:Gamma-tocopherolmethyltransferase(γ-TMT)playedasignificantroleinvitaminEpathway,
whichcatalyzeγ、δ-tocopherolintoα、β-tocopherol.Toanalyzethefunctionofγ-TMTpromoter,itwas
insertedintoaplantexpressionvectorcontainingGUSreportgenes.Theexpressionvectorwastransfered
towildTobacoobyAgrobacterium-mediatedtransformation.GUShistochemicalassayshowedthat
transgenictobaccoexpressedGUSinroot,stemandleafunderγ-TMTpromoter.
Keywords:Tobacco,VitaminE,Gamma-Tocopherolmethyltransferase,Promoter,GUS-staining
基金项目:国家国家重点基础研究发展规划973项目资助(2004CB7200)。
第一作者简介:朱永兴,男,1979年出生,硕士。主要从事分子植物病理学研究。西北农林科技大学植物保护学院植保资源与病虫害治理教育部重点实
验室。通信地址:100081北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院生物技术所。E-mail:zyx7919@163.com。
通讯作者:王磊,男,博士,副研究员。E-mail:wanglei@caas.net.cn。
收稿日期:2006-04-14,修回日期:2006-04-20。
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和利用,这是由于在肝脏中的运送 α-生育酚的转移
蛋白优先结合 α-生育酚的特性决定的[6]。生育酚在
植物的不同部位含量也不尽相同。在叶子等绿色组织
中总生育酚的含量非常低,只有 10~50ug/g新鲜叶
子,但 α-生育酚的含量最高,可占总生育酚的 90%
以上;在植物种子中的总生育酚含量较高可达
500~2000ug/g鲜重,但高活性 α-生育酚的含量低,
只占总生育酚含量的 7%~10%,而其生物合成前体—
γ-生育酚的含量却高达67%~70%[7]。
γ-生育酚甲基转移酶,它是维生素 E代谢合成
中一个重要的酶。该酶的基因也已从拟南芥 [8]、蓝
藻[9]、甘蓝[10]等植物中克隆。该基因在拟南芥中的过量
表达并不能增加转基因植物中生育酚的总含量,而是
可以改变生育酚的组成,该酶以 γ-生育酚和 S-腺
苷甲硫氨酸为底物,生成 α-生育酚,使转基因拟南
芥种子中的 α-生育酚的含量由原来的 1%提高到
90%以上[9],提高植物中维生素E的有效成分.
尽管拟南芥 γ-TMT基因的催化功能已经有比较
充分的研究,但是对该基因在植物体内的表达特异性
还缺乏研究,至今尚未见到关于拟南芥 γ-TMT的启
动子的研究报道,对该启动子进行转基因分析不仅有
助于人们了解 γ-TMT基因的表达特性,加深人们对
该基因的理解,而且为该基因启动子的应用奠定基
础。笔者利用转基因烟草对该启动子进行了初步的研
究分析,表明该启动子在烟草的根茎叶中都有比较强
的表达。
1材料和实验方法
1.1材料
1.1.1菌种和质粒载体 γ-TMT基因的启动子、农杆
菌菌株 LBA4404、pENTR1A和 WLZ-1载体由中国农
科院生物技术研究所植物代谢工程实验室提供。
1.1.2植物实验材料 烟草(NC89)由中国农科院生物
技术研究所植物代谢工程实验室提供。
1.1.3工具酶和化学试剂 各种限制性内切酶、Taq
DNA聚合酶和连接酶购自 Promega公司,重组酶购
自Invitrogen公司;其他化学药品均为国产分析纯试
剂。
1.2实验方法
1.2.1植物表达载体的构建 将启动子片段入门载体
pENTR1A上,命名为 pENTR1A-TMTpromoter。将纯
化 的 pENTR1A-TMTpromoter和 植 物 表 达 载 体
WLZ-1重组,转化入E.coli菌株DH5α。在含有壮观
霉素的 LB培养基平板上筛选转化菌落提取质粒进
行酶切鉴定,获得重组后的植物表达载体,命名为
WLZ-TMTpromoter,测序。
1.2.2转化烟草获得阳性植株 挑取含有 WLZ-
promoter质粒的农杆菌的单菌落,接种于 5mlYEB
(Spec50mg/L,Rif50mg/L) 液体培养基中,28℃,
250rpm培养36h。按照1:300转接至用500ml三角瓶
装的 200mlYEB(Spec50mg/L,Rif50mg/L)液体培养
基中,28℃,250rpm培养约 8h,至 OD600=0.8~1.0之
间。5000rpm离心5-6min,所收集的菌体重悬于约2
倍体积的 1/2MS溶液中,至 OD600=0.4~0.5之间,将
烟草无菌苗叶片(烟草长到 7~8片叶片时取材)切成
0.5mm?0.5mm大小的方块(叶盘),浸于不同农杆菌
悬浮液中3~5min用镊子竟叶盘夹到无菌滤纸上吸去
残留的菌液,然后置于 MS平板(含 6-BA2mg/LIAA
0.2mg/L)上,同时将未经农杆菌菌液浸泡的部分叶盘
放到相同培养基上,作为对照。25℃暗培养 3d后,将
转化处理的叶盘浸于 MS液体培养基(含羧苄青霉素
CB500mg/L)中 3—5min后放无菌滤纸上吸去残留
液,转到 MS平板(含 Kan100mg/L,CB500mg/L,6BA
2mg/LIAA0.2mg/L)上,25℃光照培养,直至形成愈伤
并分化出芽。将分化的芽,切割移于盛 MS固体培养
基(含 CB500mg/L,Km100mg/L)的三角瓶中,同时将
对照分化芽切割移至不含 Km的同样培养基中,诱导
生根,待根系达 3cm时,移植于日光温室在自然条件
下生长。
1.2.3转基因烟草 DNA的提取 以叶片为材料,采用
SDS法提取烟草基因组 DNA。以转基因烟草的基因
组DNA为模板进行PCR检测,获得阳性植株。
1.2.4GUS染色 取阳性转基因烟草的不同组织,进
行 GUS染色(37℃,12h),95%乙醇脱色后,在体视镜
下(NikonDIGITALCAMERADxm1200F)观察。
2结果与讨论
2.1γ-TMT基因的启动子的植物表达载体的构建
将γ-TMT基因启动子克隆到载体pENTR1A上,
在重组酶的作用下,重组到植物表达载体 WLZ-1上,
最终获得的植物表达载体WLZ-TMTpromoter。启动
子序列后带有GUS报道基因(图1),便于通过观察荧
图 1植物表达载体 WLZ-TMTpromoter结构图
Promoter GUS
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2.2.2GUS组织化学染色观察启动子的时空表达 笔
者选取转基因烟草的当代植株中 PCR阳性植株(共9
株)作为观察对象,对其不同组织进行 GUS组织化学
染色(图3)。GUS染色实验表明,这9株的表达模式基
本一致,但不同的植物组织部位 GUS基因的表达活
性存在较大的差异。在转基因烟草的根部有 GUS基
因的较高表达 (图 3-A),且幼嫩的根尖表达比较高。
GUS组织化学染色结果也显示,在转基因烟草的叶片
中GUS基因有较高表达(图3-B),为了更为清晰的观
察 GUS基因在叶片中的表达情况,笔者撕取转基因
烟草的下表皮进行GUS组织化学染色(图3-D),笔者
从图中也很直观的观察到,在下表皮中主叶脉的 GUS
基因的表达比较高,这也说明启动子在主叶脉中的活
性较高,同时在叶毛和气孔中也有 GUS基因的表达。
在转基因植株的茎部启动子活性比较高(图 3-E),而
且在茎毛上也有较高表达。
文献报道[7],VE在植物的光合器官中合成,在植
物的各组织中VE的含量有极大差别,在光合组织中
α-生育酚含量高。通过GUS染色,发现在植物的地
上部分染色后非常明显,启动子的活性高,这与文献
报道相一致。
光蛋白或 GUS染色两种方法进行观察转基因植株中
启动子的表达情况。
2.2采用农杆菌介导技术获得转基因烟草植株
2.2.1转基因植株的抗性筛选和PCR检测:
CK 1 2 3 4 5 6 7 8 9
(CK:野生型烟草基因组为模板;1-9;转基因烟草植株)
图 2烟草转基因植株的 PCR检测
A B C
D E
图 3经过 GUS染色后的烟草(8#)的不同组织
A根(左边边为野生型烟草,右边是阳性植株);B阳性植株叶片;C野生烟草叶片;D烟草叶片的下表皮;E茎
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参考文献
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2003,13(7):709~715
(责任编辑:杜 宏)
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