全 文 ：红姬凤梨离体培养植株再生关键技术研究
孟艳琼1 , 张志平2 , 何琬璐1 , 傅松玲1＊
　(1.安徽农业大学林学与园林学院 ,安徽合肥 230036;2.安徽农业大学园艺学院 ,安徽合肥 230036)
摘要　[目的] 建立红姬凤梨组织培养快繁体系。[ 方法] 以MS培养基为基本培养基添加植物生长调节剂 ,对红姬凤梨叶片进行愈伤组
织诱导 ,并进行芽分化、芽的继代增殖和生根培养。[结果]叶鞘愈伤组织诱导以MS+2 , 4-D 0.5 mg/L+BA 3.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培养
基最好、愈伤组织诱导率和分化率分别达 82.4%和 40.2%;丛生芽诱导以MS+2 ,4-D 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L+BA 3.0 mg/L+KT 2.0
mg/L培养基增殖效果最佳 ,增殖倍数达 9.72;生根诱导以 1/2 MS +NAA 3.0 mg/ L培养基诱导生根效果最好 ,平均每株生根 12.12条。
[结论]采用组织培养可有效去除病毒 ,增加繁殖系数。
关键词　红姬凤梨;叶片培养;诱导;植株再生
中图分类号　S682.39　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)12-05364-03
Key Technologies in vitro Plant Regeneration of Tissue Culture of Cryptanthus bromelioides
MENGYan-qiong et al　(College of Forestry and Gardening , Anhui Agricultural University ,Hefei , Anhui 230036)
Abstract　[ Objective] The research aimed to establish rapid propagation system of Cryptanthus bromelioides`Tricolor .[Method] The leaves of Cryptan-
thus bromelioides` Tricolor were carried on callus induction , bud differentiation, bud subculture proliferation and rooting culture with theMS culturemedi-
um added hormones.[ Result] The results showed that MS medium supplemented with 2 , 4-D 0.5 mg/L, BA 3.0 mg/L ,KT 2.0 mg/L was best for callus
induction in which the induction rate and differentiation rate of callus were 82.4% and 40.2% respectively.MS medium supplemented with 2, 4-D 0.2
mg/L ,NAA 0.05 mg/L, BA 3.0 mg/L ,KT 2.0 mg/Lwas best for clump shoots induction in which proliferation times was 9.72.1/2 MS medium supple-
mented withNAA 3.0mg/ Lwas best for root induction in which themean number of roots was 12.12.[ Conclusion] Tissue culture could effectively remove
the virus and increase propagation cofficient.
Key words　Cryptanthus bromelioides `Tricolor ;Leaf culture;Induction;Plant regeneration
　　红姬凤梨(Cryptanthus bromelioides T`ricolor )属凤梨科姬
凤梨属 ,原产于南美热带地区 ,主要分布在巴西的原始森林
中 ,我国南方有盆栽种植。由于其株形规则 ,色彩绚丽 ,观赏
性强 ,花期长 ,易管理 ,是优良的室内观叶植物 ,具有较好的
发展前景。红姬凤梨属多年生单子叶植物 ,叶片呈莲座状密
集丛生 ,几乎无茎 ,主要靠蘖芽扦插繁殖 ,但繁殖系数较低 ,
造成苗木供不应求[ 1] 。笔者旨在通过叶鞘直接诱导产生不
定芽或诱导愈伤组织产生不定芽 ,并在此基础上探索最佳培
养程序 ,以期短期内快速繁殖优质苗木 ,大大加快育苗进程。
1　材料与方法
1.1　材料　试验材料为红姬凤梨幼嫩叶片 ,购自安徽省合
肥市裕丰花市。
1.2　方法
1.2.1　材料处理。挑选生长健壮 、无病虫害幼叶 ,自基部剥
下 ,用自来水冲洗 ,再用 5%洗洁精溶液浸泡 20 min ,然后用
自来水冲洗 30 min。沥干水后 ,将材料切成约 3 cm×3 cm的
小块 ,在超净工作台上进行表面灭菌处理 ,其处理方法为:
75%酒精漂洗 30 s ,无菌水漂洗 1次 ,0.1%HgCl2 消毒液浸泡
10 min ,无菌水漂洗 5 ～ 6次。沥干水 ,切割成 0.5 cm ×0.5
cm的小块备用。
1.2.2　诱导分化。采用 4因素 3水平的正交设计 L9(34)(表
1)。诱导培养以MS为基本培养基 ,添加不同浓度的植物生
长调节剂 ,琼脂 0.7% ,蔗糖 3%。培养温度为(25±2)℃,暗
培养 6 d后转入光周期 12 h/d的光培养 ,光照强度 1 500 ～
2 000 lx。每处理接种 50个外植体 ,培养 30 d后统计外植体
愈伤组织的诱导率和分化率。
基金项目　安徽省教育厅青年教师基金项目(2004JQ153);安徽农业大学
校长青年基金(校科字[ 2005] 9号)。
作者简介　孟艳琼(1973-),女 ,安徽萧县人 ,在读博士 ,讲师,从事观赏
植物学研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　2009-02-14
1.2.3　继代培养 。采用 4因素 3水平的正交设计 L9(34)(表
2)。将获得的愈伤组织块和不定芽接种于继代增殖培养基
上培养 ,继代培养以MS为基本培养基 ,培养基中均添加蔗糖
30 g/L 、琼脂 6 g/L , pH 值 5.8。每个处理接种 40个外植体 ,
30 d后调查增殖情况 ,找出影响增殖的显著因子及各因素的
适用量和配比 。
1.2.4　生根培养与移栽。将 2 cm以上的芽苗切割接入生根
培养基 ,以 1/2 MS为基本培养基 ,添加不同含量的 NAA 、
IAA 、IBA(表 3),每处理接种 40个无根单苗 , 30 d后统计生根
情况 。
1.2.5　培养条件。光照强度约为 2 000 lx ,温度控制在(25±
2)℃,光照 12 h/d(8:00～ 20:00)。
图 1　红姬凤梨叶鞘外植体产生的愈伤组织
Fig.1　The bud body from callus of sheath explants
2　结果与分析
2.1　植物生长调节剂对红姬凤梨愈伤组织和不定芽的诱导
　将消毒好的外植体接种于诱导培养基中 , 7 d后部分外植
体基部开始膨大 ,随后逐渐形成黄绿色颗粒状的愈伤组织 ,
20 d后部分早期形成的愈伤组织开始分化出小丛芽 ,而未分
化出小丛芽的外植体基部愈伤组织生长较迅速 ,部分愈伤组
织变成黄褐色(图 1)。从表 1可以看出 ,愈伤组织的形成和
分化受生长调节剂种类及浓度的影响 ,其植物生长调节剂的
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2009 , 37(12):5364-5366 , 5425　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　李占东　责任校对　况玲玲
最佳组合为 A7 ,愈伤组织诱导率和分化率分别达 82.4%和
40.2%。因此 ,红姬凤梨愈伤组织诱导和分化的最佳培养基
为A7 ,即MS+2 ,4-D 0.5 mg/L+BA 3.0 mg/L+KT 2.0 mg/L ,
其次是A3和A5培养基。
表 1　不同植物生长调节剂配比对红姬凤梨叶片诱导分化的影响
Table 1　Effects of different growth regulator ratio on callus induction and buds differentiation of Cryptanthus bromelioides`Tricolor leaf
试验号
Test number
浓度∥mg/ L Concentration
2.4-D NAA BA KT
存活叶鞘数
Number of survived sheath
诱导率∥%
Induction rate
分化率∥%
Differentiation rate
A1 　　0 　　0 　　1.0 1.0 36 38.9 　　　　　　　8.3
A2 0 0.5 2.0 2.0 39 51.3 25.6
A3 0 1.0 3.0 3.0 47 76.6 38.3
A4 0.2 0 2.0 3.0 42 61.9 31.0
A5 0.2 0.5 3.0 1.0 49 75.5 38.6
A6 0.2 1.0 1.0 2.0 48 56.3 10.8
A7 0.5 0 3.0 2.0 50 82.4 40.2
A8 0.5 0.5 1.0 3.0 47 68.1 34.0
A9 0.5 1.0 2.0 1.0 45 68.9 8.9
2.2　植物生长调节剂浓度对红姬凤梨丛生芽增殖的影响　
将诱导出的芽转入继代培养基中进行丛生苗诱导 。培养中
发现由叶基部直接分化的小丛芽增殖率和变异率均较低 ,仅
个别出现黄色变异 ,而以愈伤组织分化出的丛生芽增殖培养
分化率和变异率均较高。从表 2可以看出 ,9种培养基上诱
导出的丛生苗均存在芽苗的不同变异现象 ,其中C7 培养基
增殖倍数较高 ,达 9.72 ,增殖芽的变异率也较高 ,达 45.6%;
其次是C3 培养基也有较高的增殖倍数和变异率 。因此 ,红
姬凤梨增殖培养的最佳培养基为 C7 ,即 MS+2 , 4-D 0.20
mg/L+NAA 0.05 mg/L+BA 3.0 mg/L+KT 2.0 mg/L 。经增
殖培养基诱导后多数叶片边缘平滑 ,叶色变异出现红色(图
2)、黄色(图 3)、绿色(图 4)和彩色(图 5)4种趋向。
表 2　不同植物生长调节剂对红姬凤梨丛生芽增殖的影响
Table 2　Effects of different growth regulator on the proliferation of Cryptanthus bromelioides `Tricolor
试验号
Test number
浓度∥mg/ L Concentration
2 ,4-D NAA BA KT
新增芽数
Buds number
平均增殖倍数
Average propagation multiple
芽变异率∥%
Mutational rate of bud
C1 0.05 0.05 1.0 1.0 210 5.25±0.70 31.9
C2 0.05 0.10 2.0 2.0 294 7.33±1.15 31.7
C3 0.05 0.20 3.0 3.0 352 8.80±0.56 44.5
C4 0.10 0.05 2.0 3.0 296 7.40±0.60 40.3
C5 0.10 0.10 3.0 1.0 254 6.33±0.58 40.2
C6 0.10 0.20 1.0 2.0 232 5.78±0.64 36.8
C7 0.20 0.05 3.0 2.0 388 9.72±1.84 45.6
C8 0.20 0.10 1.0 3.0 152 3.78±0.63 39.4
C9 0.20 0.20 2.0 1.0 286 7.17±0.35 51.3
图2　紫色变异芽体在1/ 2 MS+NAA3.0mg/L培养基上培养30 d
Fig.2　Purplish variation bud cultured on 1/ 2MS +NAA 3.0 mg/L
medium for 30 d
2.3　试管苗生根诱导　切取继代培养中高 2 cm的壮苗接种
到生根培养基上进行生根诱导 , 4 d后芽苗基部切口处开始
突起 ,7 d后开始形成白色的小根。从表 3可以看出 ,添加不
同浓度的NAA 、IAA或 IBA对红姬凤梨不定根的诱导具有较
好的促进作用 ,30 d后 9种培养基上平均生根数 、平均根长
及茎平均高度均明显高于对照组。其中 D3 和 D6 培养基上
的试管苗平均生根数量多且生根整齐 、健壮 、多呈辐射状伸
长 ,平均每株根数分别达 12.12和 11.08条 ,平均根长分别达
2.80和 2.94 cm ,平均茎高达 3.85和 3.94 cm 。因此 ,D3(1/2
MS+NAA 3.0 mg/L)和D6(1/2MS+IAA 3.0 mg/L)为生根诱
导最佳培养基 。
图3　黄色变异芽体在 1/ 2 MS+NAA3.0 mg/L培养基上培养 30 d
Fig.3　Yellow variation bud cultured on 1/2 MS +NAA 3.0 mg/L
medium for 30 d
2.4　生根苗移栽　将发育良好的生根苗移出培养室 ,在室
温散射光下培养 3 d ,打开瓶盖于温室中预培养 2 d(图 6),洗
去根部培养基 ,移栽于经高温消毒的泥炭和苔藓(1∶1)为基
质的营养钵中 ,3 cm以上小苗移栽 30 d后成活率达 95%以上
(移栽 320株 ,成活 304株)(图 7)。
536537卷 12期　　　　　　　　　　　　　　　　孟艳琼等　红姬凤梨离体培养植株再生关键技术研究
图4　绿色变异芽体在1/ 2 MS+NAA3.0 mg/L培养基上培养20 d
Fig.4　Variant green bud body cultured on 1/ 2 MS +NAA 3.0
mg/L medium for 20 d
图5　叶鞘外植体产生的不定芽在1/ 2 MS+NAA 3.0 mg/L培养
基上培养20 d
Fig.5　Adventitious buds from sheath explants cultured on 1/2 MS
+NAA3.0 mg/L medium for 20d
表3　不同激素浓度对红姬凤梨幼芽不定根的诱导
Table 3　Effects of different hormone concentrations on plumule adventitious rooting of Cryptanthus bromelioides` Tricolor
试验号
Test number
浓度∥mg/ L Concentration
NAA IAA IBA
平均根数∥条
Average number of root
平均根长∥cm
Average length of root
平均茎高∥cm
Average length of stem
叶色
Color of leaf
D1 　1.0 　0 　0 7.93±0.43 2.67±0.21 2.87±0.26 绿色 Green
D2 2.0 0 0 9.07±0.24 2.73±0.32 3.08±0.18 红绿彩纹 Red and green
D3 3.0 0 0 12.12±0.36 2.80±0.10 3.85±0.21 黄绿彩纹Yellow and green
D4 0 1.0 0 7.33±0.67 1.73±0.15 2.85±0.16 绿色 Green
D5 0 2.0 0 9.76±0.81 2.57±0.15 3.26±0.32 红绿彩纹 Red and green
D6 0 3.0 0 11.08±0.60 2.94±0.35 3.94±0.25 红绿彩纹 Red and green
D7 0 0 1.0 5.46±0.70 1.37±0.21 2.39±0.14 绿色 Green
D8 0 0 2.0 6.98±0.48 1.93±0.15 2.74±0.32 黄绿彩纹Yellow and green
D9 0 0 3.0 9.29±0.58 2.23±0.23 3.07±0.24 绿色 Green
CK 0 0 0 2.90±0.45 0.61±0.10 2.07±0.31 绿色 Green
图 6　生根苗预培养
Fig.6　Rooting seedlings pre-culture
图7　盆栽 30 d的再生植株
Fig.7　Pot culture regenerated plants for 30 days
3　讨论
在诱导培养试验中发现 ,红姬凤梨不定芽的发生有两种
类型:一是叶鞘基部直接分化出不定芽 ,且直接分化出的不
定芽呈红 、乳白 、绿 3种彩色条纹(图 8);二是叶鞘基部形成
图 8　红姬凤梨叶鞘外植体产生的不定芽
Fig.8　Adventitious buds from Cryptanthus bromelioides` Tricolor
sheath explants
图 9　愈伤组织分化的芽体
Fig.9　Callus from Cryptanthus bromelioides`Tricolor sheath ex-
plants
的愈伤组织经较长时间才分化出不定芽 ,经愈伤组织分化出
的不定芽叶色有不同程度的变异 ,多为绿色或黄色(图 9)。
(下转第 5425页)
5366 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
麦叶片氮素在冠层内的垂直分布具有较清晰的层次性 ,叶片
含氮量随冠层层次降低而降低 ,垂直梯度分明 ,不同施氮处
理间 ,不同生育时期梯度大小不同 。秦晓东等[ 11] 的研究也
表明 ,各生育时期小麦叶片氮素含量随叶位降低而降低 ,但
各叶位氮素含量均随施氮水平的提高而提高。
4　施氮对氮素利用效率的影响
4.1　氮素利用率定义　Moll等[ 12]认为 ,氮素利用率是单位
有效氮所生成的籽粒产量 ,并进一步将氮效率分解为氮吸收
效率和生理利用效率 ,氮素吸收效率是作物成熟期地上部植
株氮积累量与土壤供氮量之比;氮素生理利用效率是作物籽
粒产量与成熟期地上部植株氮积累量之比。李韵珠等[ 13]提
出 ,氮素吸收利用效率是指消耗 1个单位土壤氮所生产的经
济产量。另外还有其他氮素利用效率评价指标 ,指标如N收
获指数 、N生产力 、氮流效率等。研究者可根据不同的研究
目的使用不同的评价指标。
4.2　氮肥运筹对氮素利用率的影响　提高肥料中养分利用
率是合理施肥的核心问题 ,肥料利用率的高低反映了施肥对
作物生长影响的大小。从环境角度来看 ,在某一特定农业生
产条件下 ,氮效率的高低主要受土壤供氮水平或施氮量及氮
肥施用方式的影响。
一般来说 ,随着施氮量的增加 ,小麦吸氮量和作物产量
明显增加 ,但氮素利用率显著降低。赵俊晔等[ 14]研究认为 ,
随施氮量的增加 ,小麦对氮素的吸收效率和利用效率降低 ,
氮素回收率也显著降低。氮肥利用率不仅与施氮量和施肥
时期有关 ,而且还受底追比例的影响。赵广才等[ 15] 利用15N
示踪技术研究不同施氮比例和时期对冬小麦氮素利用率的
影响 ,结果表明 ,增加底肥比例和分次追肥处理的植株氮素
利用率较高 。夏明等[ 16]研究淮北地区高产小麦氮肥最佳运
筹方式 ,认为最佳施氮方式为 50%～ 70%氮素基施 , 50%～
30%氮素拔节追施较好。马兴华等[ 4]研究表明 ,相同施氮量
条件下增加追肥氮的比例 ,可提高氮肥的农学效率和吸收利
用效率。
参考文献
[ 1] 赵俊晔 ,于振文,李延奇 ,等.施氮量对土壤无机氮分布和微生物量氮
含量及小麦产量的影响[ J] .植物营养与肥料学报 , 2006, 12(4):166-
472.
[ 2] 刘学军 ,巨晓棠 ,张福锁.基施尿素对土壤剖面中无机氮动态的影响
[ J] .中国农业大学学报, 2001,6(5):63-68.
[ 3] 巨晓棠 ,刘学军 ,张福锁.冬小麦/夏玉米轮作中NO3--N在土壤剖面的累积及移动[ J] .土壤学报 , 2003, 40(4):538-546.[ 4] 马兴华 ,于振文,梁晓芳,等.施氮量和底追比例对土壤硝态氮和铵态
氮含量时空变化的影响[ J] .应用生态学报 , 2006, 17(4):630-634.
[ 5] 杜金哲 ,李文雄,胡尚连,等.春小麦不同品质类型氮的吸收转化利用
及与籽粒产量和蛋白质含量的关系[ J] .作物学报 , 2001, 27(2):253-
260.
[ 6] 韩燕来 ,介晓磊,谭金芳 ,等.超高产冬小麦氮磷钾吸收、分配与转规律的研究[ J] .作物学报 ,1998, 24(6):908-915.
[ 7] 孙振元 ,韩碧文,刘书兰 ,等.小麦子粒充实期氮素的吸收和再分配及 6-苄氨基嘌呤的调节作用[ J] .植物生理学报 ,1996,22(3):258-264.
[ 8] 周春菊 ,张嵩午,王林权 ,等.冷型小麦氮素吸收积累特性的研究[ J] .植物营养与肥料学报, 2006,12(2):162-168.
[ 9] 潘庆民 ,于振文,王月福,等.公顷产 9000kg小麦氮素吸收分配的研究[ J] .作物学报, 1999 ,25(5):541-547.
[ 10] HIROSET ,WERGERM JA.Maximinsing daily canopy photosynthesis with re-
spect to the leaf nitrogen allocation pattern in a canopy[ J] .Oecologic , 1987 ,
72:520-526.[ 11] 秦晓东,戴廷波,荆奇,等.冬小麦叶片氮含量时空分布及其与植株氮
营养状况的关系[ J] .作物学报, 2006,32(11):1717-1722[ 12] MOLL RH ,KAMPRATH E J , JACKSON W A.Analysis and interpretation of
factorswhich contribute to efficiency of nitrogen utilization[ J] .Agron J , 1982 ,
74:562-568.
[ 13] 李韵珠,黄元仿.冬小麦的氮素利用率和供水关系[M] //李韵珠,陆锦文,罗远培.土壤水和养分的有效利用.北京:北京农业大学出版社 ,
1994:139-148.[ 14] 赵俊晔,于振文.不同土壤肥力条件下施氮量对小麦氮肥利用和土壤
硝态氮含量的影响[ J] .生态学报 ,2006, 26(3):815-822.[ 15] 赵广才,李春喜,张保明 ,等.不同施氮比例和时期对冬小麦氮素利用
的影响[ J] .华北农学报 ,2000, 15(3):99-102.[ 16] 夏明 ,张建勋.淮北地区高产小麦氮肥最佳运筹方式研究[ J] .安徽农
学通报, 2001 ,7(3):36-37.
(上接第 5366页)
有研究表明 ,组织培养中某些再生植株变异叶的出现与其培
养基中较高浓度的生长素有关[ 2] ,而且含有多种生长调节剂
的诱变率大于单一生长调节剂诱变率 ,复合生长调节剂
诱变率又大于其单一生长调节剂的诱变率[ 3] 。Zhu 等报道 ,
五彩芋属 Caladium `Pink Cloud的叶片在同时添加 NAA 5
μmol/L和 BA 4.5 μmol/L的MS培养基上能产生叶色变异的
再生植株[ 4] 。该研究表明 ,通过愈伤组织途径产生的再生植
株出现高频变异芽 ,可能与培养基中所使用的植物生长调节
剂有关 ,至于其变异机理及变异性状稳定性 ,尚待进一步研
究。栽培中还发现红姬凤梨的彩色条纹与施肥种类有关 ,当
N肥充足时 ,绿色占优势;当 N肥含量低时 ,彩色条纹明显 ,
因此在不影响正常生长时可适当降低N肥含量。
参考文献
[ 1] 王玉国.观叶植物的栽培与装饰[M] .北京:科学技术文献出版社 ,
2002:148-149.
[ 2] AHMED EU ,HAYASHI T ,YAZAWA S.Auxins increase the occurrence of leaf-
color variants in Caladium regenerated from leaf explants[ J] .Scientia Horticul-
turae , 2004 ,100:153-159.
[ 3] 曾少玲 ,容世清,梁庆华,等.香蕉组织培养中变异的发生与控制的途径[ J] .云南热作科技 ,2001,24(4):36-37.
[ 4] ZHU Y ,YAZAWA S ,ASAHIRA T.Varietal differences in leaf color variation of
plants regenerated from in vitro culture of leaf blade inCaladium cultivars[ J] .
Jpn Soc Hort Sci ,1993,62:431-435.
[ 5] 桂意云 ,林纬 ,陶劲,等.擎天凤梨离体培养快繁试验[ J] .广西农业科
学 ,2005,36(6):509-510.
[ 6] CAO Y L , LUO Q ,ZHANG X Y, et al.Effects of different culture conditions on
vitrification of Lyciumbarbarum L.plantlets in tissue culture[ J] .Agricultural
Science&Technology ,2008, 9(2):30-32, 115.
[ 7] 刘松涛 ,郭军战,白睿.凤梨组织培养研究[ J] .西北林学院学报 , 2007 ,
22(4):95-98.
[ 8] JIANG Q , DONG L ,NING Z Y , et al.Establishment of somatic cell clones in
Thesium chinense Turcz and its in vitro rooting technique[ J] .Agricultural Sci-
ence &Technology ,2008, 9(5):47-49, 52.
542537卷 12期　　　　　　　　　　李向楠等　氮肥运筹对土壤—小麦系统氮素行为及氮素利用效率影响的研究进展