全 文 ：枯草芽孢杆菌菌剂对烟草根际土壤细菌群落的影响*
游摇 偲1 摇 张立猛2 摇 计思贵2 摇 高加明3 摇 张成省1**摇 孔凡玉1
( 1中国农业科学院烟草研究所 /烟草行业烟草病虫害监测与综合治理重点实验室, 山东青岛 266101; 2云南省烟草公司玉溪
市公司, 云南玉溪 653100; 3湖北省烟草公司, 武汉 430000)
摘摇 要摇 通过构建 16S rRNA克隆文库及采用核糖体 DNA扩增片段酶切分析(ARDRA)的方
法,研究施用生物防治剂枯草芽孢杆菌菌剂对烟草根际土壤细菌群落结构以及多样性的影
响.采用文库库容值(C)、Shannon多样性指数(H)、Pielou 均匀度指数(E)和 Margalef 丰富度
指数(R)对细菌多样性进行评价.系统发育分析表明: 对照及处理样品均检测到 12 个细菌类
群:酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(琢鄄、茁鄄、啄鄄、酌鄄Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomyce鄄
tes)、厚壁菌门(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、放
线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和拟杆菌门(Bacteroidetes);但各细菌类群的结
构组成及所占比例在不同样品间有较大差别.对照土壤中优势菌群为 Acidobacteria(27. 1% )
和 Proteobacteria(26. 5% );处理土壤中则为 Proteobacteria(38. 0% )和 Acidobacteria(29. 6% );
菌剂处理后土壤中,酌鄄Proteobacteria 和 琢鄄Proteobacteria 所占比例明显提高,而 茁鄄Proteobacte鄄
ria、Planctomycetes和 Firmicutes等菌群的数量则相对降低.多样性分析表明,土壤样品均具有
丰富的细菌多样性,经枯草芽孢杆菌菌剂处理后,土壤细菌多样性指数和丰富度指数均提高.
关键词摇 枯草芽孢杆菌摇 群落结构摇 16S rRNA基因摇 核糖体 DNA扩增片段酶切分析(ARDRA)
*中国烟草总公司重点项目(2012YN42)和湖北省烟草公司重点项目(027Y2012鄄083)资助.
**通讯作者. E鄄mail: zhangchengsheng@ caas. cn
2014鄄03鄄28 收稿,2014鄄07鄄24 接受.
文章编号摇 1001-9332(2014)11-3323-08摇 中图分类号摇 S476摇 文献标识码摇 A
Impact of biocontrol agent Bacillus subtilis on bacterial communities in tobacco rhizospheric
soil. YOU Cai1, ZHANG Li鄄meng2, JI Si鄄gui2, GAO Jia鄄ming3, ZHANG Cheng鄄sheng1, KONG
Fan鄄yu1 ( 1Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of
Tobacco Pest Monitoring & Integrated Management, Qingdao 266101, Shandong, China; 2Yunnan
Tobacco Company in Yuxi, Yuxi 653100, Yunnan, China; 3Hubei Tobacco Company, Wuhan
430000, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(11): 3323-3330.
Abstract: The impact of inoculation with the biocontrol agent Bacillus subtilis on bacterial commu鄄
nities and bacterial diversity in rhizospheric soil of Nicotiana tabacum was assessed by constructing a
16S rRNA gene clone library and conducting amplified ribosomal DNA restriction analysis
(ARDRA). The bacterial diversity was evaluated by coverage value (C), Shannon index (H),
Pielou evenness index (E) and Margalef richness index (R). Phylogenetic analysis revealed that
the inoculation significantly affected the composition of bacterial communities in tobacco rhizospheric
soil. A total of twelve bacterial groups including Acidobacteria, Proteobacteria (including 琢鄄, 茁鄄,
啄鄄, 酌鄄Proteobacteria), Planctomycetes, Firmicutes, Nitrospirae, Gemmatimonadetes, Actinobacte鄄
ria, Chloroflexi and Bacteroidetes were detected to be shared by inoculated soil and control soil.
The community composition and proportions of different bacteria in the communities showed signifi鄄
cant variations between the two samples. The dominant bacteria were Acidobacteria (27. 1% ) and
Proteobacteria (26. 5% ) in control soil, while in the inoculated soil Proteobacteria (38. 0% ) and
Acidobacteria (29. 6% ) were dominant. B. subtilis inoculation increased the numbers of 酌鄄Pro鄄
teobacteria and 琢鄄Proteobacteria but reduced the numbers of bacterial groups such as 茁鄄Proteobacte鄄
ria, Planctomycetes, Firmicutes. Diversity analysis showed that bacterial diversity was rich for both
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 11 月摇 第 25 卷摇 第 11 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Nov. 2014, 25(11): 3323-3330
soil samples, and soil bacterial Shannon index and Margalef richness index were promoted after in鄄
oculation.
Key words: Bacillus subtilis; community composition; 16S rRNA gene; amplified ribosomal DNA
restriction analysis (ARDRA).
摇 摇 土壤环境是一个复杂的动态生态系统,其中生
存的生物包括大型生物、中型动物、微动物区系和微
生物区系.土壤微生物是其重要的组成部分,土壤生
态系统中 80% ~ 90%的代谢过程均有土壤微生物
的调节[1] . 土壤微生物中以细菌的种类和数量最
多[2],其在土壤养分循环、有机质形成和分解、肥力
保持和提高、生态环境改善、植物生长发育以及作物
病虫害防治等方面发挥着关键的作用[3-4] . 施用化
肥农药以及在土壤中接种拮抗微生物等将对土壤化
学性质、土壤微生物活性和微生物群落结构造成直
接或间接的影响[5],从而影响土壤生态系统的功能
发挥和结构稳定[6-7] .
植物促生微生物(plant growth鄄promoting micro鄄
organisms, PGPMs)在农业系统中发挥着重要的作
用,主要通过作为生物肥料、产生植物刺激剂以及作
为生物防治因子等方式对植物生长产生有益作用.
PGPMs具有较好的应用前景,在土壤中接种 PGPMs
可大量减少化学肥料和农药的应用.关于 PGPMs对
植物促生作用方面的报道较多[8],而对于微生物接
种引起的潜在环境影响则受到忽视. 在土壤中接种
大量微生物后,其在土壤中的定殖,将至少会在短期
内对土壤原著菌群造成一定扰动,从而影响微生物
群落的结构和功能.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
是目前研究较多的生物防治细菌之一,诸多报道表
明其对多种植物病原菌具有抑制作用[9],关于其对
土壤根际微生物群落结构造成的影响则少见报道.
研究表明,传统培养技术所获得的可培养微生
物只占土壤微生物总数的 1%左右[10],且传统培养
技术将微生物置于游离于原来环境的人为条件下,
造成原来群落结构的改变[11] . 因此,传统的培养方
法难以全面了解微生物群落结构. 随着微生物分子
生态学技术的发展,基于 PCR技术的研究方法直接
提取土壤微生物总 DNA,从分子水平上研究微生物
群落结构和功能变化,克服了传统培养方法的弊端.
基于 16S rRNA扩增性 rRNA 限制性酶切片段分析
方法 ( amplified ribosomal DNA restriction analysis,
ARDRA)是近年来发展起来的一项现代生物技术,
具有特异性强、不受宿主干扰、效率高等特点,目前
已被广泛用于微生物群落结构研究[12] .
此前研究中,笔者所在的实验室从烟草根际土
壤中分离获得 1 株具有防病促生效应的枯草芽孢杆
菌[13-14],并制成菌粉用于烟草病害防治,前期大田
试验数据表明其对烟草黑胫病菌 (Phytophthora par鄄
asitica var. nicotianae)具有良好的防效. 本文采用
ARDRA方法研究生物防治菌株枯草芽孢杆菌对烟
草根际土壤细菌群落结构和细菌多样性的影响,以
期为生物防治剂的环境安全性评价提供基础数据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
烟草品种为小黄金 1025,枯草芽孢杆菌 Tpb55
菌株由中国农业科学院烟草研究所提供.
1郾 2摇 试验处理
试验于中国农业科学院烟草研究所即墨试验基
地进行,供试土壤类型为棕壤,有机质含量为 12
g·kg-1,速效磷为 3. 52 mg·kg-1,速效钾为 62郾 35
mg·kg-1,碱解氮为 103. 56 mg·kg-1,土壤 pH 5. 8.
2012 年 3 月 8 日播种,5 月 17 日移栽,行距 100 cm,
株距 30 cm,所有试验小区的栽培条件一致.试验设
2 个处理:T为枯草芽孢杆菌 Tpb55 菌粉(活芽孢约
3伊1010 cfu·g-1),400 倍液灌根,每株 50 mL; CK为
空白对照.每个处理 3 次重复,每个小区试验面积
30 m2 .试验共施药 3 次,移栽时第一次施药,移栽后
10 d(5 月 27 日)第二次施药,移栽后 30 d(6 月 16
日)第三次施药.移栽后第 50 天(7 月 6 日)取土,此
时烟草处于旺长期. 按 5 点取样法在每个处理中选
取 5 株烟草植株,先去掉 0 ~ 5 cm的表土,轻轻抖掉
根系外围土,用毛刷轻轻刷粘附在根表面的土壤作
为根际土,用无菌的封口袋包扎密封,置于冰盒中带
回实验室,置于-80 益冰箱中储存备用.
1郾 3摇 主要试剂和仪器
PCR 试剂、pEASY鄄T1 载体、RsaI 和 MspI 限制
性内切酶以及 DNA 纯化试剂盒购自北京康为世纪
生物科技有限公司和北京全式金生物技术有限
公司.
1郾 4摇 研究方法
1郾 4郾 1 土壤细菌总 DNA 的提取与纯化 摇 用土壤
DNA提取试剂盒(UltraClean襆 DNA Isolation kit,MO
4233 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
BIO)提取土壤细菌总 DNA,提取的粗 DNA 用 DNA
纯化试剂盒进行纯化,提取和纯化方法均按照操作
说明进行.
1郾 4郾 2 16S rRNA 的 PCR 扩增摇 选用细菌通用引物
27 F和 1492 R扩增样品总 DNA的 16S rRNA片段.
50 滋L PCR 反应体系为: 2 伊Taq PCR MasterMix 25
滋L,引物 27 F和 1492 R各 2 滋L,DNA模板 2 滋L,用
无菌双蒸水补足 50 滋L体系.
16S rRNA扩增条件采用 touch鄄down PCR程序:
95 益 5 min;95 益 1 min,65 益 1 min (每 1 个循环
降低 0. 5 益,降到 55 益),72 益 1 min,20 个循环;
95 益 1 min,55 益 1 min,72 益 1 min,10 个循环;
72 益 10 min.对 PCR产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳
检测,并用 DNA凝胶回收试剂盒回收纯化.
1郾 4郾 3 细菌 16S rRNA 克隆文库的构建及阳性克隆
筛选 摇 将回收获得的 16S rRNA 基因片段通过
pEASY鄄T1 Cloning Kit 试剂盒连接到 pEASY鄄T1 载
体上,转化进入大肠杆菌 DH5琢高感受态细胞,将转
化产物涂布到含有氨苄青霉素(Ampicillin) / IPTG /
X鄄Gal的 LB培养基上,37 益培养 16 ~ 24 h,每个样
品挑取 200 个白色克隆子,采用菌落 PCR 的方法,
用引物 M13F和 M13R扩增外源插入片段,1%琼脂
糖凝胶电泳检测筛选阳性克隆,构建基因克隆文库.
1郾 4郾 4 ARDRA分析摇 将鉴定为阳性的 PCR 产物用
限制性内切酶 RsaI 和 MspI 进行双酶切. 反应体系
为:PCR 反应产物 5 滋L,10伊NE 缓冲液 1 滋L,RsaI
0. 25 滋L,MspI 0. 25 滋L,双蒸水补足至 10 滋L. 37 益
温育 0. 5 ~ 1 h. 3%琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段,
凝胶成像系统拍照并分析酶切图谱.
1郾 4郾 5 16S rRNA 测序及系统发育分析 摇 根据酶切
谱型的不同将所有的阳性克隆分成若干个操作分类
单元(OTU),统计操作分类单元的种类和各操作分
类单元所含阳性克隆的数量,每个 OTU 类型挑选
1 ~ 2个代表克隆进行测序(由南京金斯瑞生物科技
有限公司完成). 测得的序列首先用 DNASTAR.
Lasergene. v7. 1 软件中 SeqMed 程序去除载体序列,
之后使用 CHIMERA鄄CHECK 在线分析去除所有含
嵌合体的序列.将最后所得序列与 GenBank 数据库
中已知的序列进行比对. 每条序列均选取与其相似
性最高的序列,使用 Clustal X 1. 83 软件进行多重比
对,最后用MEGA 4. 0 中的邻接法构建 16S rRNA 系
统进化树.
1郾 5摇 数据处理
以覆盖率(C)评价所构建克隆文库的库容,计
算公式为:C = [1-(n1 / N)] 伊100% . 其中:N 为 16S
rRNA克隆文库的总克隆数;n1 为在 16S rRNA 克隆
文库中仅出现 1 次的 OTU的数量.
以 Shannon多样性指数(H)、Pielou均匀度指数
(E)和 Margalef丰富度指数(R)分析比较土壤样品
细菌多样性. H = -移P i lnP i ( i = 1,2,…, n);E =
H / lnS;R = (S-1) / lnN. 式中:P i为每个物种样本数
量占总样本数量的比例,P i = ni / N,ni为第 i 种物种
个体数,N为总个体数;S为样本中物种的数量.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 土壤细菌总 DNA提取和 16S rRNA扩增结果
以直接提取的土壤样品(CK、T)的总 DNA为模
板,经降落(touch鄄down)PCR扩增获得约 1500 bp的
16S rRNA片段,片段条带专一,符合后续试验要求.
2郾 2摇 16S rRNA克隆文库的建立
样品 16S rRNA 扩增片段经纯化后,连接到
pEASY鄄T1 载体上并转化大肠杆菌感受态细胞,两
组样品共随机挑选 400 个克隆子,利用通用引物
M13R和 M13F 进行筛选后,样品 CK、T 分别获得
166 和 179 个阳性克隆子,其阳性克隆率分别为
83郾 0%和 89. 5% .
2郾 3摇 ARDRA分析及系统发育分析
获得的阳性克隆经两种限制性内切酶 RsaI 和
MspI酶切后,土壤样品 CK 和 T 分别获得 75 和 74
个 OTU 类型,其中仅出现 1 次的 OTU 数量分别是
36 和 35 个,因此其文库覆盖率 C 分别为 78. 3%和
80. 4% .两组样品的文库覆盖率均>70% ,说明文库
库容已足够,能够较全面反映土壤样品中细菌群落
多样性.
对 ARDRA分型获得的共 149 个 OTUs 中的代
表克隆子进行序列测定,所得序列在 GenBank 数据
库中作对比分析,比对结果如表 1 所示,构建两样品
的系统发育树如图 1 所示. CK、T 样品克隆序列与
基因文库中已知序列相似性分别介于 89% ~ 100%
和 91% ~ 100% . 两组样品中均出现一定量未知细
菌,在 GenBank数据库中未找到与之相似性较高的
已知序列.而样品中其余序列均分属于 12 个细菌类
群:酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomy鄄
cetes)、茁鄄变形菌纲 ( 茁鄄Proteobacteria )、厚壁菌门
(Firmicutes)、啄鄄变形菌纲(啄鄄Proteobacteria)、酌鄄变形
菌纲(酌鄄Proteobacteria)、琢鄄变形菌纲(琢鄄Proteobacte鄄
ria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、芽单胞菌门(Gem鄄
matimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门
523311 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 游摇 偲等: 枯草芽孢杆菌菌剂对烟草根际土壤细菌群落的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 1摇 样品土壤细菌 16S rRNA克隆文库分析结果
Table 1摇 Bacterial 16S rRNA clone library results of samples
克隆子门(纲)水平的鉴定
Phyla / Class identification of clones
百分比
Percentage
克隆子详细鉴定结果
Detailed identification of clones
酸杆菌门
Acidobacteria
CK 27. 1 未培养酸杆菌门 Uncultured Acidobacteria (21. 7% ),未培养酸杆菌科 Uncultured Acidobacte鄄
riaceae (4. 2% ),未培养酸杆菌目 Uncultured Acidobacteriales (0. 6% ), 未培养酸杆菌属
Uncultured Acidobacterium (0. 6% )
T 29. 6 未培养酸杆菌门 Uncultured Acidobacteria (24. 0% ), 酸杆菌门 Acidobacteria (3. 4% ), Un鄄
cultured Solibacter (1. 1% ), 酸杆菌属 Acidobacterium (0. 6% ), 未培养酸杆菌科 Uncultured
Acidobacteriaceae (0. 6% )
茁鄄变形菌纲
茁鄄Proteobacteria
CK 11. 4 未培养 茁鄄变形菌 Uncultured 茁鄄proteobacterium (7. 2% ), 未培养伯克氏菌属 Uncultured Burk鄄
holderia (3. 0% ), 未培养伯克氏菌目 Uncultured Burkholderiales (1. 2% )
T 7. 3 伯克氏菌属 Burkholderia ( 3. 9% ), Ramlibacter ( 2. 2% ), 未培养 茁鄄变形菌 Uncultured
茁鄄proteobacterium (1. 1% )
啄鄄变形菌纲
啄鄄Proteobacteria
CK 5. 4 未培养 Haliangium Uncultured Haliangium (4. 2% ), 未培养 啄鄄变形菌 Uncultured 啄鄄proteobac鄄
terium (1. 2% )
T 2. 2 未培养 啄鄄变形菌 Uncultured 啄鄄proteobacterium (1. 1% ), Uncultured Haliangium (1. 1% )
酌鄄变形菌纲 CK 5. 4 未培养 酌鄄变形菌 Uncultured 酌鄄proteobacterium (4. 8% ), 戴氏菌属 Dyella (0. 6% )
酌鄄Proteobacteria T 13. 4 未培养 酌鄄变形菌 Uncultured 酌鄄proteobacterium ( 5. 6% ), 罗河杆菌属 Rhodanobacter
(2. 2% ), 戴氏菌属 Dyella (5. 6% )
琢鄄变形菌纲
琢鄄Proteobacteria
CK 4. 2 未培养 琢鄄变形菌 Uncultured 琢鄄proteobacterium (1. 2% ), 未培养生丝微菌属 Uncultured
Hyphomicrobium (1. 2% ),未培养拜纳蒙纳斯属 Uncultured Balneimonas (1. 2% ), Bosea thio鄄
oxidans (0. 6% )
T 15. 1 慢生根瘤菌属 Bradyrhizobium (6. 1% ), 未培养 琢鄄变形菌 Uncultured 琢鄄proteobacterium
(5. 0% ), 热带根瘤菌 Rhizobium tropici (0. 6% ),未培养生丝微菌科 Uncultured Hyphomicro鄄
biaceae (1. 1% ), Uncultured Pseudolabrys (1. 1% ),根瘤菌属 Rhizobium (0. 6% ), 未培养德
沃斯氏菌属 Uncultured Devosia (0. 6% )
浮霉菌门
Planctomycetes
CK 19. 9 未培养 Singulisphaera Uncultured Singulisphaera (9. 0% ), 未培养浮霉菌属 Uncultured Planc鄄
tomycetes (10. 2% ), 浮霉菌目 Planctomycetales (0. 6% )
T 8. 4 未培养 Singulisphaera Uncultured Singulisphaera (3. 9% ), 未培养浮霉菌科 Uncultured Planc鄄
tomycetaceae(1. 7% ),未培养浮霉菌属 Uncultured Planctomycetes (2. 2% ), Nostocoida limico鄄
la 芋 (0. 6% )
厚壁菌门
Firmicutes
CK 3. 0 未培养梭菌属 Uncultured Clostridium (1. 8% ),未培养芽孢八叠球菌属 Uncultured Sporosarci鄄
na (1. 2% )
T 2. 2 芽孢杆菌属 Bacillus (0. 6% ), 未培养毛螺旋菌科 Uncultured Lachnospiraceae (0. 6% ), 坚
强芽孢杆菌 Bacillus firmus (0. 6% ), 未培养厚壁菌门 Uncultured Firmicutes (0. 6% )
硝化螺旋菌门 CK 1. 2 未培养硝化螺菌属 Uncultured Nitrospira (1. 2% )
Nitrospirae T 0. 6 未培养硝化螺菌属 Uncultured Nitrospira (0. 6% )
芽单胞菌门
Gemmatimonadetes
CK 1. 2 未培养芽单胞菌科 Uncultured Gemmatimonadaceae (0. 6% ), 未培养芽单胞菌目 Uncultured
Gemmatimonadales (0. 6% )
T 3. 4 未培养芽单胞菌属 Uncultured Gemmatimonas (1. 1% ), 未培养芽单胞菌门 Uncultured Gem鄄
matimonadetes (2. 2% )
放线菌门 CK 1. 2 未培养放线菌 Uncultured actinobacterium (1. 2% )
Actinobacteria T 3. 4 未培养放线菌 Uncultured actinobacterium (2. 2% ), 未培养康奈斯氏杆菌科 Uncultured
Conexibacteraceae (0. 6% ), 放线菌 Actinobacterium (0. 6% )
拟杆菌门
Bacteroidetes
CK 2. 4 未培养 Mucilaginibacter Uncultured Mucilaginibacter (0. 6% ), 未培养拟杆菌门 Uncultured
Bacteroidetes (1. 8% )
T 1. 1 未培养拟杆菌门 Uncultured Bacteroidetes (1. 1% )
绿弯菌门
Chloroflexi
CK 3. 6 未培养绿弯菌门 Uncultured Chloroflexi (0. 6% ), 未培养纤线杆菌纲 Uncultured Ktedonobac鄄
teria (3. 0% )
T 0. 6 未培养纤线杆菌属 Uncultured Ktedonobacter (0. 6% )
未知细菌 CK 13. 9 未知细菌 Unclassified (13. 9% )
Unclassified T 12. 8 未知细菌 Unclassified (12. 8% )
CK: 对照 Control; T: 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis.
(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteria) .
摇 摇 不同细菌类群在两组样品中的数量也有较大差
别.对照样品中优势菌为酸杆菌门(27. 1% ),第二
优势菌为变形菌门(26. 5% ),而样品 T 优势菌则为
变形菌门(38. 0% )和酸杆菌门(29. 6% ).两组样品
的变形菌门均包含 琢鄄、茁鄄、酌鄄、啄鄄变形菌,但所占比例
有较大不同,CK 样品中 茁鄄Proteobacteria 含量最高
(11. 4% ),枯草芽孢杆菌处理样品中变形菌门主
要为 琢鄄Proteobacteria ( 15. 1% ) 和 酌鄄Proteobacteria
(13郾 4% )(表 1).对照样品中 琢鄄变形菌纲主要为生
丝微菌属 (Hyphomicrobium sp. )和拜纳蒙纳斯属
( Balneimonas sp. ),在枯草芽孢杆菌处理样品中则
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图 1摇 样品的 16S rRNA系统发育树
Fig. 1摇 16S rRNA phylogenetic tree of samples.
A: 琢鄄变形菌纲 琢鄄Proteobacteria; B: 酌鄄变形菌纲 酌鄄Proteobacteria; C: 茁鄄变形菌纲 茁鄄Proteobacteria; D: 厚壁菌门 Firmicutes; E: 啄鄄变形菌纲
啄鄄Proteobacteria; F: 放线菌门 Actinobacteria; G: 芽单胞菌门 Gemmatimonadetes; H: 浮霉菌门 Planctomycetes; I: 酸杆菌门 Acidobacteria; J: 硝
化螺旋菌门 Nitrospirae; K: 拟杆菌门 Bacteroidetes; L: 绿弯菌门 Chloroflexi; M: 未知细菌 Unclassified bacteria.
包括慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp. )、根瘤菌属
(Rhizobium sp. )、 Pseudolabrys sp. 和生丝微菌科
(Hyphomicrobiaceae)等;酌鄄变形菌纲在对照样品中
含量较少,主要是戴氏菌属(Dyella sp. )和未培养
菌,在枯草芽孢杆菌处理样品中 Dyella 数量增多
(由 1 个克隆增加到 10 个),并且出现罗河杆菌属
(Rhodanobacter sp. );茁鄄变形菌纲在对照样品中主
要为伯克氏菌属(Burkholderia sp. )和未培养菌,在
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表 2摇 样品 CK、T烟草根际土壤细菌多样性
Table 2摇 Species diversity of sample CK and T in tobacco
rhizosphere soil
克隆文库
Clone
library
Shannon指数
Shannon
index
均匀度指数
Evenness
index
丰富度指数
Richness
index
CK 3. 1 0. 8 8. 0
T 3. 2 0. 8 9. 6
枯草芽孢杆菌处理样品中未培养菌数量降低,并出
现 Ramlibacter sp.两组样品中酸杆菌门、浮霉菌门、
厚壁菌门、硝化螺旋菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、绿
弯菌门、放线菌门和 啄鄄变形菌纲细菌多为未培养菌
(图 1).
2郾 4摇 细菌群落多样性分析
由表 2 可以看出,2 组样品细菌群落均具有较
丰富的多样性,且经枯草芽孢杆菌处理(T)的土壤
细菌群落多样性和丰富度均明显高于对照土壤
(CK).均匀度指数是指群落中各个种的多度或重要
值的均匀程度,T和 CK土壤细菌均匀度无差异.
3摇 讨摇 摇 论
本文采用 ARDRA 分析的方法,以普通种植土
壤为对照,研究环境友好型生物防治剂枯草芽孢杆
菌菌剂对烟草根际土壤细菌群落结构的影响,并对
其土壤细菌多样性进行分析,发现两组土壤样品细
菌群落均具有丰富的多样性. 除未在公共数据库中
找到相似序列的未知细菌外,两组样品均分为 12 个
细菌类群: Proteobacteria ( 琢鄄、 茁鄄、 啄鄄、 酌鄄Proteobacte鄄
ria)、Acidobacteria、Planctomycetes、Firmicutes、Nitro鄄
spirae、 Gemmatimonadetes、 Actinobacteria、 Bacte鄄
roidetes、Chloroflexi,但其比例有较大差异.其中,Pro鄄
teobacteria和 Acidobacteria 在两组样品中均占有较
大比例,为优势菌. Schloss 和 Handelsman[15] 利用
16S rRNA 基因序列研究农田土壤样品细菌的生态
学分类, 结果得到土壤样品细菌包括 7 个主要类
群:Proteobacteria (48. 6% )、Acidobacteria(15. 3% )
等,张建萍等[16]应用 16S rRNA鄄RFLP方法分析稻田
土壤细菌的多样性,发现测得序列涵盖 4 种变形杆
菌、酸杆菌、放线菌、绿屈挠菌、拟杆菌、浮游霉菌等
12 个类群,其中变形细菌所占比例最大(37. 8% ),
其次为酸杆菌(16. 2% ).本研究结果与以往研究利
用 16S rRNA基因克隆文库的方法对土壤样品进行
分析所获得的结果基本一致,变形菌门、酸杆菌门和
浮霉菌门等是土壤中常见的细菌类群[17-19] .
枯草芽孢杆菌是目前研究较多的植物促生微生
物之一,关于其促生及生防效果研究较多[20-22],而
关于其对根际土壤细菌群落多样性特征影响的研究
尚不多见.本试验采用间隔施药的方法,在其他外在
环境条件基本一致的前提下,研究枯草芽孢杆菌菌
剂在烟草根际土壤施用 50 d 后土壤中细菌多样性
和群落结构的变化. 用 Shannon 多样性指数、Mar鄄
galef丰富度指数等分析细菌多样性发现,接种生防
菌剂后细菌多样性和丰富度均有所提高,与以往研
究结果相似.如 Sang 和 Kim[5]研究根际促生细菌对
微生物活性和群落结构影响发现,无论是否接种植
物病原菌土壤微生物多样性指数均提高. 刘方春
等[23]研究表明,在干旱生境下接种蜡样芽孢杆菌
(B. cereus)90 d 后,核桃根际土壤细菌群落的 Mar鄄
galef指数和 Shannon指数均显著提高.
ARDRA分析表明,施用菌剂 50 d 后土壤中优
势菌群仍为变形菌门和酸杆菌门,但各门所占比例
发生较大变化, 酌鄄Proteobacteria 和 琢鄄Proteobacteria
所占比例明显提高,而 茁鄄Proteobacteria、Planctomyce鄄
tes 和 Firmicutes 等 3 个菌群的数量则相对降低.
Schwieger和 Tebbe[24]研究田间施用中华根瘤菌 L33
对苜蓿根际细菌多样性的影响发现,琢鄄Proteobacteria
的数量提高而 酌鄄Proteobacteria 种群的数量降低;而
Trabelsi 等[25]用 T鄄RFLP 方法研究在 Phaseolus vul鄄
garis田间接种 2 种本地固氮菌株对细菌群落结构
和多样性影响,发现 琢鄄Proteobacteria、酌鄄Proteobacte鄄
ria、Firmicutes和 Actinobacteria 的数量均有所提高.
刘方春等[23]用 T鄄RFLP 方法研究表明,接种植物根
际促生细菌(PGPR)对核桃根际土壤细菌群落结构
有较大影响,接种蜡样芽孢杆菌后 Actinobacteria(66
bp)和 琢鄄Proteobacteria / Firmicutes(151 bp)成为优势
菌群. Zhang等[26]研究发现,接种生防菌剂苏云金芽
孢杆菌(B. thuringiensis)能明显改变胡椒(Capsicum
annuum)叶际细菌群落结构,DGGE 分析表明,接种
前主要为 Firmicutes,而接种后 酌鄄Proteobacteria 占主
导地位.
施用生防菌剂后,不同细菌类群除数量发生变
化外,其结构组成也存在一定差异. T 样品 琢鄄
Proteobacteria检测到一定量慢生根瘤菌属和根瘤菌
属(分别占 6. 2%和 1. 1% ),这两属细菌均能与豆
科植物共生固氮促进植物生长,研究发现其对非豆
科植物也具有促生作用,是 PGPR 的重要组成种
类[27-28] . 酌鄄Proteobacteria有很强的适应性,在不同环
境中均有广泛分布,存在很多能够抑制植物致病菌
的有益菌.接种后,酌鄄Proteobacteria 中 Dyella 数量升
8233 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
高,并出现 Rhodanobacter. Palaniappan 等[29]研究发
现 Dyella 具有多种植物促生特性,且 Rhodanobacter
细菌具有生物防治活性[30] . 接种生防菌剂后,土壤
中植物促生微生物的数量和种类均有所提高,推测
其促生作用可能与其造成的植物根际细菌群落结构
的改变有关.而对于生物防治剂与土著微生物相互
作用的深入研究可能有利于提高生防效率以及农作
物产量.
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作者简介摇 游摇 偲,女,1987 年生,硕士研究生.主要从事微
生物生态学研究. E鄄mail: ycst. 1987@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
0333 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷