全 文 ：解磷菌株 B25 的筛选、鉴定及其解磷能力*
贺梦醒摇 高摇 毅摇 胡正雪摇 徐摇 瑶摇 龙摇 瑞摇 孙庆业**
(安徽大学资源与环境工程学院, 合肥 230601)
摘摇 要摇 从安徽省铜陵市铜官山尾矿库木贼根际分离筛选出多株解磷细菌,经过多次筛选纯
化获得一株解磷能力较好的菌株 B25.采用透射电镜观察和 DNA分子技术,确定此菌株属于
芽孢杆菌属.研究了解磷菌株 B25 在培养 168 h内的解磷能力、溶液 pH值以及菌株生长量的
变化情况,并比较了 B25 在不同条件下的解磷能力.结果表明:解磷菌株 B25 的解磷能力与溶
液 pH值之间存在微弱的相关性,在碳源为葡萄糖、初始 pH 值为 7. 0、培养温度为 30 益时解
磷效果较好.
关键词摇 解磷菌摇 解磷能力摇 16S rRNA
文章编号摇 1001-9332(2012)01-0235-05摇 中图分类号摇 Q939. 96摇 文献标识码摇 A
Screening, identification, and phosphate鄄solubilizing capability of phosphate鄄solubilizing
bacterial strain B25. HE Meng鄄xing, GAO Yi,HU Zheng鄄xue, XU Yao, LONG Rui, SUN Qing鄄
ye (School of Resources and Environmental Engineering, Anhui University, Hefei 230601, Chi鄄
na) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23(1): 235-239.
Abstract: Various phosphate鄄solubilizing bacterial strains were isolated from the Hippochaete ramo鄄
sissimum rhizosphere in Tongguanshan copper tailings in Tongling of Anhui Province, East China.
After many times of screening and purification, a strain B25 with stronger phosphate鄄solubilizing ca鄄
pability was obtained, which belonged to Bacillus genus, as identified by transmission electron mi鄄
croscope and DNA molecular approaches. A culture experiment was conducted to study the phos鄄
phate鄄solubilizing capability of the B25 within 168 h and the variations of the medium pH and B25
growth as well as the phosphate鄄solubilizing capability of B25 under different culture conditions. A
weak correlation was observed between the phosphate鄄solubilizing capability of B25 and the medium
pH. The B25 displayed a better phosphate鄄solubilizing capability when the carbon source was glu鄄
cose, medium initial pH was 7. 0, and culture temperature was 30 益 .
Key words: phosphate鄄solubilizing bacteria; phosphate鄄solubilizing capability; 16S rRNA.
*国家高技术研究发展计划项目(2006AA06Z359)和安徽省自然科
学基金项目(070415208)资助.
**通讯作者. E鄄mail: sunqingye@ ahu. edu. cn
2011鄄04鄄01 收稿,2011鄄11鄄08 接受.
摇 摇 磷素是植物生长所必需的三大营养要素之一.
我国有 74%的耕地土壤缺磷,土壤中 95%磷为无效
形式,为了获得高产每年都向土壤反复施加大量可
溶性磷肥,然而由于土壤的固定等作用,作物对施入
的磷肥当季节利用效率只有 5% ~ 10% ,大部分与
土壤中的 Ca2+、Fe2+、Fe3+、A13+结合形成难溶性磷酸
盐[1] .土壤中存在大量的具有解磷能力的微生物,
能够将难溶性的磷酸盐如磷矿粉转化为水溶性磷,
提高土壤中的可溶性磷含量,从而改善植物磷素营
养,提高作物产量[2-4] .
目前已报道的具有解磷能力的微生物包括细
菌、真菌和放线菌[5-9]等,其中溶磷细菌的数量和种
类较多,解磷真菌在数量上远不如解磷细菌多,其种
类也少, 主要局限于青霉 ( Penicillium )、 曲霉
( spergillus)、镰刀菌(Fusarium)、小丝核菌(Scleroti鄄
um)等几个属种. 林启美等[5]发现真菌的解磷能力
比细菌强,有的可以达到 10 倍以上,并且许多细菌
在进一步的纯化过程中容易失去解磷能力,而真菌
则可以始终保持其解磷活力.
不同种类的微生物,不仅解磷能力存在着巨大
的差异,而且解磷机理也可能不一样. 林启美等[5]
发现,具有解磷能力的细菌,在培养期间,培养介质
的酸度一般都降低;不具有解磷能力的微生物,其培
养介质的 pH 不仅不降低,反而升高. 但是,培养介
质的 pH与解磷能力之间并不存在显著的相关性.
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 1 月摇 第 23 卷摇 第 1 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jan. 2012,23(1): 235-239
有学者认为[10-11],微生物的解磷能力可能与微生物
分泌有机酸类物质有关,也可能存在多个解磷机理.
解磷细菌中芽孢杆菌属的筛选以及解磷效果的研究
在国内外已多有报道[11-15],但对解磷能力的理解均
存在一定差异.本文从安徽省铜陵市铜官山尾矿库
木贼根际土壤中分离筛选出具有解磷能力的多株细
菌,其中以细菌 B25 解磷效果最佳,对其进行了菌
种的鉴定,并对其解磷能力、解磷过程中菌体生长
量、pH值变化情况以及不同条件下解磷能力情况进
行了初步研究,以期为利用解磷菌提高尾矿磷素利
用效率提供理论依据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试样品与培养基
采集安徽省铜陵市铜官山尾矿库木贼(Hipp鄄
ochaete ramosissimum)根际土壤. 采用抖土法将收集
的土样放入密封袋内立刻带回实验室冷藏,备用.
分离培养基[16]:葡萄糖 10 g,磷矿粉 5 g,
( NH4 ) 2 SO4 0郾 1 g, KCl 0郾 2 g, MgSO4 · 7H2O
0郾 25 g, MgCl2 · 6H2O 5 g, 琼脂 20 g, 定容至
1000 mL,pH 7郾 0 ~ 7郾 5.
种子培养基( LB):蛋白胨 10 g,酵母提取物
5 g,NaCl 10 g,琼脂 18 g(固体),定容至 1000 mL,
pH 7郾 0 ~ 7郾 5.
1郾 2摇 解磷菌的分离、筛选与纯化
取 10 g 木贼根际土加入 100 mL 无菌水震荡
5 min,将土壤悬浊液倒入 250 mL 无菌三角瓶中,
25 益摇床振荡 30 min,取上清液逐级稀释至 10-1、
10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和 10-8,各取 0郾 1 mL
涂布于平板培养基上,每个浓度重复 3 次,30 益培
养 168 h,挑取有明显溶磷圈的菌落纯化 5 次以上,
将单菌落转至斜面培养基,直至菌落长起,置于 4 益
冰箱保存,备用.
1郾 3摇 解磷菌株的鉴定
通过 透 视 电 镜 观 察 其 细 胞 形 态, 并 以
16S rRNA[17](27F: 5忆鄄AGAGTTTGATCCTGGCTCAG鄄
3忆 和 1492R: 5忆鄄TGACTGACTGAGGYTACCTTGT鄄
TACGACTT鄄3忆)的保守型序列为引物进行 PCR 扩
增,扩增产物回收、克隆、测序后,将所得序列与
BLAST数据库进行同源性分析,进行菌株鉴定.
1郾 4摇 培养 168 h内解磷菌解磷能力、pH 值、菌体生
长量测定
将分离得到的单株纯菌株在种子培养基中活
化,按照 1%的接种量接入上述分离培养基中(不含
琼脂),并设置对照 ( CK),每个处理重复 3 次,
30 益、150 r·min-1培养 168 h. 每天取样检测培养
液 pH 值(用 pH 计直接测定)、细菌生长量(OD600
值).将培养液 4 益 6000 r·min-1离心 10 min 取上
清液测磷含量,菌体 1伊105 Pa 灭菌 30 min,H2 SO4 鄄
H2O2消煮后,均用钼锑抗比色法[18]测定发酵液以及
菌体中可溶性磷含量.
1郾 5摇 不同条件对解磷菌解磷能力的影响试验
1郾 5郾 1 碳源对菌株解磷能力的影响试验摇 分别用淀
粉、蔗糖以及葡萄糖作为分离培养基中碳源,每个处
理 3 个重复,以接灭活菌为对照. 相同条件培养
168 h,每天取样检测有效磷含量.
1郾 5郾 2 培养基初始 pH 值对菌株解磷能力的影响试
验摇 灭菌前分别将分离培养基初始 pH值调至 6郾 0、
7郾 0、8郾 0,每个处理 3 个重复,以接灭活菌为对照.相
同条件培养 168 h,每天取样检测有效磷含量.
1郾 5郾 3 温度对菌株解磷能力的影响试验摇 将接种后
摇瓶培养的分离培养基分别置于 20、30、40 益温度
下,每个处理 3 个重复,以接灭活菌为对照. 相同条
件培养 168 h,每天取样检测有效磷含量.
1郾 6摇 数据处理
用 SPSS软件对试验数据进行相关分析,采用
Microsoft Excel 2003 软件作图.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 解磷菌的分离、筛选与鉴定
无机磷培养基平板初次筛选得到 22 株解磷细
菌,通过多次筛选和纯化使一部分菌株失去或降低
了解磷能力,最终筛选出一株解磷能力稳定且较好
的菌株,命名为 B25. 据 Kucey[19]报道,在菌株纯化
过程中有近 50%的解磷细菌会失去解磷能力,而大
部分解磷真菌则可始终保持解磷活性. 林启美等[5]
在测定磷细菌的解磷能力时也发现,59 株有机磷细
菌中仅有 6 株表现出较强的解磷能力,部分无机磷
菌株在分离纯化后失去解磷活力.
透射电镜观察 B25 发现(图 1),菌株 B25 菌体
细胞杆状、末端方;成短链、中生、孢囊无明显膨大;
革兰氏阳性、无荚膜、菌落大、扁平,初步认为是芽孢
类菌属.
摇 摇 采用分子生物学方法进一步对解磷细菌 B25
进行遗传学鉴定,即提取 B25 的基因组 DNA并对其
核糖体的 16S rRNA 保守型序列进行 PCR 扩增.
PCR扩增产物切胶回收、克隆、测序并用 DNAStar分
析软件将其序列与 GenBank 中近缘种序列进行同
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源性 比 对, 结 果 表 明 菌 株 B25 基 因 序 列 与
GU297610 (Bacillus anthracis strain U13)、EF062509
(Bacillus sp郾 MCCB 101 ) 和 AM778997 ( Bacillus
thuringiensis 16S rRNA gene and 16S鄄23S IGS)有较
高的同源性,相似度均为 99% ,因此可以确定菌株
B25 归属于芽孢杆菌属(Bacillus sp郾 )(图 2).
2郾 2摇 解磷细菌 B25 在培养 168 h 内解磷能力的变
化
培养168 h内,对照组CK的解磷能力变化很
图 1摇 解磷菌株 B25 的透射电镜图
Fig. 1摇 Transmission microscope of phosphate鄄solubilizing strain
B25.
图 2摇 解磷菌株 B25 的同源性分析
Fig. 2 摇 Homological analysis of phosphate鄄solubilizing strain
B25.
图 3摇 解磷细菌 B25 在 168 h内的溶磷量
Fig. 3 摇 Dissolution of phosphorous by phosphate鄄solubilizing
strain B25 in 168 hours (mean依SD).
小,维持在 0郾 81 ~ 0郾 84 mg·L-1,解磷细菌 B25 表现
出了较强的解磷能力. 在 168 h 内随着培养时间的
延长,解磷菌株 B25 的解磷能力表现出先增长,并
于第 96 小时达到最大值 75郾 23 mg·L-1,再下降而
后趋于稳定的趋势(图 3). 表明该菌株在培养的前
96 h内解磷能力较好,而后期可能由于碳源等营养
物质的耗竭、以及菌体生长繁殖受到抑制等,使解磷
能力有所降低.
2郾 3摇 解磷过程中溶液 pH值、菌体生长量变化
本研究中对照组(CK)培养液的 pH 值未发生
明显变化,维持在 7郾 5 左右,解磷细菌 B25 的培养液
pH值出现了明显的降低,第 168 小时降至 6郾 27,呈
酸性.将溶液 pH 值和解磷细菌 B25 解磷能力做相
关性分析,结果发现两者之间存在一定的相关性,但
没有达到显著水平(P>0郾 05). 在培养前 120 h 内,
解磷细菌 B25 生长量不断增加(图 4),并在第 120
小时达到最大值(OD600 = 0郾 536),而后开始下降并
趋于稳定.解磷细菌 B25 的生长量在第 120 小时出
现最大值,而磷的释放在第 96 小时达到最大值,表
明菌体的解磷能力与其生长状况并非一致,将菌体
生长量 OD600值和解磷细菌 B25 的解磷能力做相关
性分析,结果也表明两者之间无相关性(P>0郾 05).
摇 摇 前人研究表明,解磷菌解磷机理具有多样
性[20-23],现在还不完全清楚,其中解磷菌产生和释
放有机酸是最常见的一种机制,这些酸既能降低 pH
值,又可与铁、铝、钙等离子螯合,从而使难溶磷或不
溶性磷转化为有效磷.本研究发现,在培养的 168 h
内,B25 的解磷能力不同,而且解磷量与培养液 pH
值仅呈现出微弱的负相关性,这与 Asea 等[10]报道
pH值与解磷量之间缺乏相关性或仅有微弱的相关
性相一致.林启美等[5]发现培养介质酸度升高是溶
图 4摇 培养过程 pH值和光密度变化
Fig. 4摇 Changes of the culture pH and OD600 of phosphate鄄solu鄄
bilizing strain B25 (mean依SD).
7321 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 贺梦醒等: 解磷菌株 B25 的筛选、鉴定及其解磷能力摇 摇 摇 摇 摇
解磷矿粉的重要条件,但不是必要条件. Illmer 和
Schitnner[11]认为,产有机酸只是解磷的一个方面,
而伴随着呼吸或同化 NH4 +时 H+的释放是解磷的另
一个重要机制. 杨慧等[24]研究表明,溶磷草生欧文
氏菌的溶磷量与培养液 pH 下降无直接关系,可能
在培养过程中溶磷菌除有机酸外还分泌一些非有机
酸物质,也许还存在其他的解磷机理,甚至微生物在
不同的生长时期,其解磷机理可能发生转变. 可见,
关于微生物的解磷机理还有待进一步研究.
2郾 4摇 不同培养条件下解磷菌株 B25 解磷效果
2郾 4郾 1 碳源摇 由图 5 可知,解磷菌株 B25 在不同碳
源条件下解磷效果存在细微差别,3 种碳源培养基
的解磷效果依次为淀粉>葡萄糖>蔗糖,尽管三者的
解磷趋势基本一致,但从图 5 可明显地看出,前期
(24 ~ 120 h)的增长以及后期(120 ~ 168 h)的下降.
以淀粉为碳源的解磷菌株B25的解磷能力均表现
图 5摇 解磷菌株 B25 在不同碳源(a)、pH 值(b)和温度(c)
下的溶磷量
Fig. 5摇 Phosphate solubilization capacity of phosphate鄄solubiliz鄄
ing strain B25 under different carbon sources ( a), pH values
(b) and temperatures (c) (mean依SD).
G: 葡萄糖 Glucose; Z: 蔗糖 Sucrose; D: 淀粉 Starch.
出较大增幅.葡萄糖为碳源条件下的 B25 解磷能力
前期增长幅度较慢,第 96 小时开始跃增并于第 120
小时达最大值,后期解磷能力虽在下降但均大于淀
粉和蔗糖,对于 168 h 的培养周期,以选择葡萄糖作
为碳源为佳.
2郾 4郾 2 初始 pH 值 摇 解磷菌株 B25 在不同 pH 值条
件下解磷效果存在显著差异(图 5). 初始 pH 值为
7郾 0 时解磷菌株 B25 的解磷效果最好,在 24 ~ 96 h
的前期培养中,其解磷能力的增长幅度低于 pH 8郾 0
和 6郾 0,第 120 小时跃增至最大值,第 144、168 小时
虽有所下降,但也维持相对较好的解磷能力.在整个
培养过程中,初始 pH值为 8郾 0 和 6郾 0 的解磷效果变
化较小,一直处于较低状态,解磷菌株 B25 的最适
初始 pH值为 7郾 0.
2郾 4郾 3 温度摇 解磷菌株 B25 在不同温度条件下解磷
效果存在一定差异,其中 20、30 益条件下解磷菌株
B25 的解磷效果明显高于 40 益 .在前期(24 ~ 96 h)
的培养过程中,30 益条件下解磷效果的增长幅度大
于 20 益,第 120 小时跃增至最大值,而后开始降低.
20 益条件下解磷菌株 B25 的解磷效果处于中间水
平,解磷趋势与 30 益相一致(图 5). 40 益条件下解
磷菌株 B25 的解磷效果一直处于较低状态,且变化
情况不明显.可知该菌株的最适宜温度为 30 益 .
3摇 结摇 摇 论
采用以磷矿粉为唯一磷源的选择性培养基,从
木贼根际分离筛选出多株解磷细菌,大多数菌体在
不断地纯化过程中解磷能力失去或降低,而菌株
B25 的解磷能力较强.经过透射电镜和分子鉴定,确
定此菌株为出芽孢杆菌属细菌;解磷菌株 B25 的解
磷能力与溶液 pH 值之间存在微弱的相关性、与菌
株生长量无相关性;菌株表现最佳解磷效果时的最
佳碳源是葡萄糖、最适初始 pH 值是 7郾 0、最适培养
温度是 30 益 .
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nese)
作者简介摇 贺梦醒,女,1985 年生,硕士研究生.主要从事环
境微生物学研究. E鄄mail: mengxing198520@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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