全 文 ：川硬皮肿腿蜂毒液对寄主黄粉虫蛹的影响*
卓志航1 摇 杨摇 伟1**摇 覃摇 欢1 摇 杨春平1 摇 杨摇 桦1 摇 徐丹萍2
( 1四川农业大学林学院森林保护省级重点实验室, 四川雅安 625014; 2四川农业大学食品学院农产品加工及贮藏工程省级重
点实验室, 四川雅安 625014)
摘摇 要摇 为揭示川硬皮肿腿蜂寄生对寄主黄粉虫蛹的调控机制,本文通过自然寄生和毒液注
射等方法研究了寄生过程中蜂毒液的作用. 结果表明: 对人工注射的蛹,寄主被麻痹的程度
与毒液注入量呈正相关,恢复活动情况与毒液注入量呈负相关;当人工注射毒液浓度为
0. 01 VRE时,黄粉虫表现出可逆的轻微麻痹;当浓度提高到 0. 2 VRE 时,黄粉虫蛹表现出不
可逆的完全僵化.单独注射土壤菌液,导致蛹大量死亡并出现大范围的黑化现象,而注射毒液
和土壤菌液混合物,蛹的黑化作用发生延缓,且死亡率显著下降.对毒液的抑菌测试表明,毒
液对金黄葡萄球菌的抑菌作用显著高于大肠杆菌.在一定温度范围内,随着温度升高毒液麻
痹活性显著降低,对大肠杆菌抑菌性显著升高,对金黄葡萄球菌抑菌性显著降低.表明川硬皮
肿腿蜂毒液对寄主黄粉虫蛹具有麻痹、抑菌、抑制蜕皮和延缓黑化的作用.
关键词摇 川硬皮肿腿蜂摇 麻痹摇 抑菌摇 抑制黑化
文章编号摇 1001-9332(2013)11-3273-07摇 中图分类号摇 S718. 7摇 文献标识码摇 A
Effects of venom from Sclerodermus sichuanensis Xiao on pupa of Tenebrio molitor. ZHUO
Zhi鄄hang1, YANG Wei1, QIN Huan1, YANG Chun鄄ping1, YANG Hua1, XU Dan鄄ping2 ( 1Sichuan
Provincial Key Laboratory of Forest Protection, College of Forestry, Sichuan Agricultural University,
Ya爷an 625014, Sichuan, China; 2Sichuan Provincial Key Laboratory of Agricultural Products Pro鄄
cessing and Preservative, College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya爷an 625014,
Sichuan, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2013,24(11): 3273-3279.
Abstract: To explore the regulatory mechanisms of parasitism of Sclerodermus sichuanensis on
Tenebrio molitor, the methods of natural parasitism and venom injection were adopted to investigate
the effects of the venom from S. sichuanensis on the pupa of T. molitor in the parasitic process. Un鄄
der venom injection, the paralytic degree of the pupa had a positive correlation with the concentra鄄
tion of injected venom, and the number of recovered pupa had a negative correlation with the injec鄄
ted venom concentration. The T. molitor pupa was in slight and reversible paralysis when injected
with 0. 01 VRE (venom reservoir equivalent) of venom, and in non鄄reversible and complete paraly鄄
sis when 0. 2 VRE was injected. The pupa died massively and appeared a wide range of melaniza鄄
tion when injected with soil bacterial suspension alone, but the melanization delayed and the mortal鄄
ity declined significantly when the mixed liquor of bacterium and venom was injected. The bacterio鄄
stasis of the venom on Staphylococcus aureus was significantly stronger than that on Escherichia coli.
Within a definite range of temperature, the paralytic activity decreased significantly with increasing
temperature, the bacteriostasis on S. aureus increased significantly, while that on E. coli was oppo鄄
site. This study showed that the venom from S. sichuanensis had the effects of paralysis, bacterio鄄
stasis, inhibiting exuviations, and delaying melanization.
Key words: Sclerodermus sichuanensis Xiao; paralysis; bacteriostasis; melanization.
*四川省教育厅重点实验室专项(2006ZD011)、四川农业大学“211冶
工程双支计划项目(00370101)和四川农业大学长江上游生态林业
工程建设项目资助.
**通讯作者. E鄄mail: ywei0218@ yahoo. com. cn
2013鄄05鄄02 收稿,2013鄄08鄄29 接受.
摇 摇 寄生蜂毒液具有调控寄主体液免疫、细胞免疫、
生长发育、内分泌激素和营养代谢等功能[1-5] . Barat
等[6]研究发现,草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)
被注射双斑镶颚姬蜂(Hyposoter didymator)的 PDV
应 用 生 态 学 报摇 2013 年 11 月摇 第 24 卷摇 第 11 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Nov. 2013,24(11): 3273-3279
(polydnavirus)后,酚氧化酶、酚氧化酶激活酶、丝氨
酸蛋白酶等基因产生了差异表达;沙草粘虫(裹尸)
薄茧小蜂(Euplectrus sp. near plathypenae)和粘虫盘
绒茧蜂(Cotesia kariyai)毒液能减缓寄主的生长或抑
制寄主化蛹[7],但棉大卷螟甲腹茧蜂 ( Chelonus
inanitus)毒液却能使寄主提前早熟变态[8] . 另外,
Tanaka等[9]研究发现,寄生蜂能通过破坏寄主前胸
腺激素的释放来抑制寄主的化蛹;毒液不仅能抑制
促前胸腺激素 PTTH 的分泌和合成,也能通过将蜕
皮激素保持在较低水平来延缓寄主幼虫鄄蛹中间态
的蜕皮[10];Guerra 等[11]研究发现,墨西哥棉铃象
(Anthonmus grandis)的 3 龄幼虫被蜜茧蜂(Bracon
mellitor)寄生后,体内自由氨基酸发生变化,出现 2
个自由氨基酸峰,而且自由氨基酸的上升总是与整
体可溶蛋白的下降同步.对绝大多数不具多分 DNA
病毒和畸形细胞的寄生蜂而言,毒液是调控寄主生
理最关键的因子[12-13];内寄生蜂和外寄生蜂毒液对
寄主免疫、营养、内分泌等方面都有调控作用,但大
量研究发现外寄生蜂对毒液的依赖性高于内寄生
蜂[1,5,14-15] .
川硬皮肿腿蜂( Sclerodermus sichuanensis)隶属
于膜翅目(Hymenoptera)肿腿蜂科(Bethylidae),是
松墨天牛(Monochamus alternatus)和杉棕天牛(Cal鄄
lidium villosulum)等钻蛀性害虫的抑性外寄生蜂,能
在寄生过程中永久性麻痹寄主[16] .川硬皮肿腿蜂雌
蜂生殖系统较简单,毒囊体积所占比例大,无明显萼
区,可见毒液在川硬皮肿腿蜂和寄主昆虫相互关系
中起重要作用[17] . 目前,对川硬皮肿腿蜂毒液的研
究主要围绕在对寄主生理生化的影响等方面,而对
蜂毒的麻痹作用、抑菌作用以及延缓黑化作用的报
道相对较少,本文将从这些方面对川硬皮肿腿蜂毒
液作用进行研究.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
供试川硬皮肿腿蜂为四川农业大学森林保护省
级重点实验室用黄粉虫(Tenebrio molitor)蛹繁殖的
成年雌蜂,其子代雌蜂羽化 6 d 后(已完成交配)用
于试验.供试寄主黄粉虫用麦麸和无污染蔬菜饲养,
试验前已在实验室繁殖多年,选择体质量在 0. 1 ~
0. 15 g的蛹用于试验.供试大肠杆菌(Escherichia co鄄
li)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和枯草
芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株由四川农业大学森
林保护省级重点实验室提供.
1郾 2摇 供试材料前处理
雌蜂驯化:试验前将已交配雌蜂和黄粉虫蛹以
1 颐 1比例放入玻璃指形管(6 cm伊1 cm)中让其熟悉
向寄主注入毒液麻痹寄主的过程,若能在 3 h 内麻
痹寄主,视为成功.此过程是为了避免雌蜂初次麻痹
寄主所花时间过长,不能保持处理和对照组寄主蛹
龄的一致性.
寄生试验:将成功驯化的雌蜂和黄粉虫蛹以
1 颐 1比例放入玻璃指形管(6 cm伊1 cm)中,以脱脂
棉封口,自然光培养,成功麻痹寄主 24 h 后记为第
1 天.
消毒灭菌:对解剖器械(镊子、解剖针等)、注射
器械(微量进样器 20 mL)、PBS(0. 80% NaCl, 0. 01
mol·L-1磷酸盐,pH 7. 0 ~ 7. 2)、蒸馏水、去离子水
等进行灭菌(115 Pa, 20 min);用棉球蘸 75%酒精
对黄粉虫腹部消毒.
1郾 3摇 毒液制备及单个毒囊蛋白含量测定
在解剖镜下用镊子拉出雌蜂产卵鞘,取毒囊并
释放毒液至盛有 PBS溶液、0 益冰水浴的 Eppendorf
管中, 10000 r · min-1 4 益 离心 10 min ( Allegra
TM 64R Centrifuge),除去空毒囊和组织碎片,取上清
液用于试验.
取 20 头蜂毒液对单个毒囊蛋白含量进行测定,
测定方法为 Bradford法[18],标准曲线用牛血清蛋白
进行测定,曲线范围 0 ~ 100 mg,试验重复 5 次.
1郾 4摇 毒液麻痹作用试验
1郾 4郾 1 自然蛰刺摇 在指形管中,按 1 颐 1、2 颐 1、3 颐 1、
4 颐 1 和 5 颐 1(成年雌蜂 颐 黄粉虫蛹)分别接入 40
头黄粉虫蛹和雌蜂(每根指形管接入一头黄粉虫),
脱脂棉封口,待寄主被雌蜂蛰刺麻痹后取出,置于
(27依1) 益、85% RH 培养,12 h 后统计麻痹情况,
24 h后统计恢复活动蛹的数量,试验重复 3 次.
1郾 4郾 2 注射毒液 摇 取制备好的毒液用 PBS 稀释成
0郾 01、0. 02、0. 05、0. 1、0. 2 和 0. 3 VRE(1 个毒囊中
的毒液溶入 1 mL PBS 认定为 1 VRE),将稀释好的
毒液对黄粉虫蛹进行腹部注射(1 mL·头-1),每个
浓度注射蛹 40 头,以注射 PBS 为对照,注射后置于
(27依1) 益、85% RH 培养,12 h 后统计麻痹情况,
24 h后统计恢复活动蛹的数量,试验重复 3 次.
1郾 4郾 3 麻痹标准 摇 麻痹程度分为轻微麻痹、完全麻
痹和致死麻痹,其中轻微麻痹是指黄粉虫蛹受刺激
后没有完全丧失活动能力,躯体尚能摆动,但是活动
速度较缓慢,幅度较小、不灵活,并且这种麻痹作用
是可逆的,24 h 后恢复活动与对照无差异;完全麻
4723 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
痹是指对刺激完全没有反应,完全僵化,没有任何动
作;致死麻痹是指注射毒液后黄粉虫蛹不产生与轻
微麻痹与完全麻痹相似的效果,直接死亡.
1郾 4郾 4 毒液麻痹蛋白探索摇 取制备好的毒液加入蛋
白酶 K,使之终浓度为 1 mg·mL-1,37 益水浴 2 h,
检测麻痹活性 (参照 1. 4. 2 ). 以不含毒液 1
mg·mL-1的蛋白酶 K为阴性对照,以未处理的毒液
(0郾 01 和 0. 3 VRE)为阳性对照,分别检测毒液麻痹
活性(参照 1. 4. 2),试验重复 3 次.
1郾 5摇 毒液抑菌作用试验
1郾 5郾 1 菌液、毒液及混合液制备摇 菌液:称取 10 g 泥
土于 100 mL灭菌蒸馏水中,充分混匀,静置至澄清,
再用灭菌水稀释浓度至 10-10 mL·mL-1 . 选择菌液
试验目的在于探讨毒液对细菌的抑制作用,从而揭
示黄粉虫蛹被寄生蜂麻痹取食时难以被细菌侵蚀腐
坏的原因;选择土壤菌液则是由于土壤中含有细菌
种类繁多,且符合黄粉虫蛹被麻痹取食时所处的细
菌环境条件.毒液制备:参照 1. 3、1. 4. 2,毒液制备
浓度为 0. 3 和 0. 5 VRE.毒液、菌液混合液:解剖镜
下取出毒囊溶于混合菌液中,使其浓度为 0. 3 VRE.
1郾 5郾 2 菌液、毒液及混合液注射 摇 试验组取 160 头
蛹,分别用微量进样器在腹部注射 1 mL 毒液(0. 01
和 0. 3 VRE)、菌液和混合液,对照组注射 1 mL灭菌
蒸馏水和灭菌 PBS,置于(27依1) 益、85% RH 培养
48 h后观察,试验重复 3 次.
1郾 5郾 3 供试菌种活化摇 将用 EP 管于-20 益保存的
菌种取出,放置于 4 益冰箱融化.用移液枪将融化后
的 1 mL菌液加入盛有 100 mL灭菌牛肉膏蛋白胨液
体培养基的锥形瓶中,并放入恒温振荡培养箱内
37 益、100 r·min-1进行光照震荡培养,24 h 后取出
备用.
1郾 5郾 4 菌悬液配制及平板抑菌试验 摇 菌悬液配置:
菌种活化后以无菌液体培养基为空白于 420 nm 测
OD值.大肠杆菌 OD 值约为 5. 5 ~ 6. 0,用灭菌蒸馏
水稀释 5000 倍;金黄葡萄球菌 OD 值约为 4. 0 ~
4郾 6,稀释 3000 倍;枯草芽孢杆菌 OD 值约为 4郾 2 ~
4郾 8,稀释 8000 倍.
平板抑菌试验:取配置好的菌悬液 0. 3 mL均匀
涂布于固体牛肉膏蛋白胨平板培养基表面,静置在
无菌超净工作台中 30 min.取制备好的 0. 5 VRE 毒
液 10 滋L 滴入已灭菌的直径为 6 mm 的圆形滤纸
片,贴在已接种的平板内,并以灭菌 PBS 和灭菌水
为对照.将贴好纸片的培养皿,于 37 益培养箱中光
照倒置培养 24 h,观察有无抑菌圈并用直尺测量各
抑菌圈的直径大小,试验重复 3 次.
1郾 6摇 温度对毒液麻痹及抑菌作用的影响试验
取 0. 3 VRE 毒液 (参照 1. 3 )、菌液 (参照
1郾 5郾 4),分别于 30、40、50、60、80 和 100 益下处理
5 min,用于检测麻痹活性(参照 1. 4. 2)和抑菌活性
(参照 1. 5. 4),以不含毒液的不同温度处理的灭菌
PBS和灭菌水为对照,试验重复 3 次.
1郾 7摇 数据处理
试验数据均运用 SPSS 18. 0 软件进行 t检验、单
因素方差(ANOVA)和 Duncan系列分析.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 单个毒囊蛋白含量
川硬皮肿腿蜂每个毒囊蛋白含量约为(3. 078依
0. 351) mg,浓度 0. 3 VRE 蛋白含量约为(0. 923 依
0郾 105) mg·uL-1 .
2郾 2摇 毒液麻痹作用
2郾 2郾 1 自然蛰刺麻痹效果摇 寄主蛹被驯化后的雌蜂
自然麻痹所需要的时间约为 0. 5 ~ 3 h,麻痹后继续
培养发现,因接种成年雌蜂比例不同黄粉虫蛹麻痹
程度不同,接种比例越大,蛹被蛰刺的次数与毒液的
注入量越大.自然蛰刺的蛹,寄主被麻痹的程度与接
种比例呈正相关,恢复活动情况与毒液注入量呈负
相关.接种比例为 1 颐 1 时,蛹表现出轻微的麻痹,且
部分能显著恢复活动;接种比例为 1 颐 2 时,完全麻
痹状态显著升高,轻微麻痹状态、恢复能力显著下降
表 1摇 不同比例(成年雌蜂比黄粉虫蛹)与麻痹状况的关系
Table 1摇 Relationships between different proportions (adult wasp to Tenebrio molitor pupa) and paralytic degree (mean依
SD)
麻痹状况
Paralytic degree
成年雌蜂 颐 黄粉虫蛹 Adult wasp:T. molitor pupa
1 颐 1 2 颐 1 3 颐 1 4 颐 1 5 颐 1
轻微麻痹 Slight paralysis (heads) 22. 8依0. 9Aa 13. 7依0. 3Ab 3. 7依0. 7Cc 3. 0依0. 6Cc 2. 7依0. 9Ac
完全麻痹 Complete paralysis (heads) 17. 3依0. 9Ba 26. 3依0. 3Bb 36. 3依0. 7Bc 37. 0依0. 6Bc 37. 3依0. 9Bc
恢复活动 Recovered pupa (heads) 14. 3依0. 7Ca 7. 3依0. 3Cb 1. 0依0. 6Ac 0. 3依0. 3Ac 0. 7依0. 7Ac
同列不同大写字母表示差异显著(P<0. 05) Different capital letters in the same column meant significant difference at 0. 05 level. 同行不同小写字母
表示差异显著(P<0. 05) Different small letters in the same row meant significant difference at 0. 05 level. 下同 The same below.
572311 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 卓志航等: 川硬皮肿腿蜂毒液对寄主黄粉虫蛹的影响摇 摇 摇 摇
图 1摇 黄粉虫蛹鄄成虫中间体
Fig. 1摇 Pupa鄄imago transition state of Tenebrio molitor.
a)侧面 Profile; b)腹面 Ventral side.
(P<0. 05);当接种比例达到 1 颐 3 时,大量蛹被完全
麻痹(P<0. 05)(表 1).部分被注入毒液量较少的蛹
麻痹后可恢复活动,继续发育,至羽化时形成头部、
翅和足部分发育,成为蜕皮障碍的蛹鄄成虫中间体
(图 1);而被注入毒液量较大的蛹持续保持麻痹状
态,至麻痹后 8 ~ 14 d死亡(相同培养条件下正常蛹
期为 7 ~ 10 d).
2郾 2郾 2 毒液注射麻痹效果 摇 人工注射的蛹,寄主被
麻痹的程度与毒液注入量呈正相关,恢复活动情况
与毒液注入量呈负相关. 注入 0. 01 VRE 毒液的蛹
表现出轻微的麻痹,且大部分能显著恢复活动,但随
着毒液浓度增加,黄粉虫蛹逐渐表现出对刺激无反
应的完全僵化迹象,且恢复活动能力随之减弱;当浓
度达到 0. 03 VRE时,完全麻痹状态显著升高,轻微
麻痹状态、恢复能力显著下降;当浓度达到 0. 05
VRE时,大量蛹显著开始被完全麻痹;当浓度达到
0. 2 VRE 时,麻痹状态开始不可恢复(P<0. 05),使
蛹表现完全僵化状态至死.人工注射的蛹在 4 ~ 5 d
后大量死亡(表 2).
2郾 2郾 3 毒液麻痹蛋白探索 摇 蛋白酶 K 水解毒液后,
黄粉虫蛹并没有表现出被麻痹的情况,与阴性对照
(注射蛋白酶 K)差异不显著,但与阳性对照(注射
不同浓度毒液)差异显著(P<0. 05) (表 3),证明毒
液中具有麻痹活性的物质是蛋白质.
2郾 3摇 毒液抑菌作用
2郾 3郾 1 菌液、毒液及混合液注射摇 由表 4 可知,单独
注射菌液后,大多数黄粉虫蛹 24 h 内出现死亡,且
伴随着整个躯体泛黑,死亡率显著升高;注射 0. 3
VRE混合液后,黄粉虫蛹出现死亡并伴随整个躯体
泛黑数目及死亡率显著下降;单独注射毒液的蛹48 h
内陷入麻痹状态,只有少数出现死亡且不泛黑,但在
注射后第 4天缓慢泛黑并死亡.证明川硬皮肿腿蜂毒
液具有抑菌活性,且能够抑制或延缓黑化作用.
2郾 3郾 2 平板抑菌试验摇 毒液对大肠杆菌和金黄葡萄
球菌都有显著抑菌作用,且对金黄葡萄球菌抑菌作
用显著高于大肠杆菌(P<0. 05) (表5) ;由于灭菌
表 2摇 注射不同浓度毒液后寄主麻痹状况
Table 2摇 Paralytic degree of host injected with different concentrations venom (mean依SD)
麻痹状况
Paralytic degree
PBS 0. 01 VRE 0. 03 VRE 0. 05 VRE 0. 1 VRE 0. 2 VRE 0. 3 VRE
轻微麻痹 Slight paralysis (heads) 0Ad 33. 7依0. 6Aa 18. 7依0. 3Ab 7. 7依0. 3Ac 7. 3依0. 7Ac 7. 3依0. 3Cc 7. 3依0. 7Cc
完全麻痹 Complete paralysis (heads) 0Ad 6. 3依0. 6Ba 21. 3依0. 3Ab 32. 3依0. 3Bc 32. 7依0. 7Bc 32. 7依0. 3Bc 32. 7依0. 7Bc
恢复活动 Recovered pupa (heads) 0Ad 29. 0依1. 2Ca 15. 3依0. 3Bb 9. 3依0. 3Cc 4. 7依0. 7Cb 0Ad 0Ad
表 3摇 毒液麻痹蛋白探索
Table 3摇 Exploring paralytic protein in venom (mean依SD)
麻痹状况
Paralytic degree
阴性对照
Negative control
试验组
Experimental sample
阳性对照 Positive control
0. 01 VRE 0. 3 VRE
轻微麻痹 Slight paralysis (heads) 0Ab 0Ab 33. 0依0. 6Aa 7. 3依0. 7Cc
完全麻痹 Complete paralysis (heads) 0Ab 0Ab 4. 3依0. 9Ba 30. 0依1. 2Bc
恢复活动 Recovered pupa (heads) 0Ab 0Ab 29. 0依1. 2Ca 0Ab
表 4摇 注射不同成分后黄粉虫蛹的反应
Table 4摇 Reaction of pupa after injected with different reagents (mean依SD)
死亡状况
Death status
菌液
Soil bacteria
suspension
毒液 Venom
0. 01 VRE 0. 3 VRE
混合液
Miscible liquid
(0. 3 VRE)
灭菌蒸馏水
Sterile purified
water
灭菌 PBS
Sterile
PBS
死亡且躯体泛黑数
Dead and melanized (heads)
34. 7依0. 3b 0c 0c 5. 7依0. 3a 0c 0c
死亡率
Death rate (% )
90. 8依2. 2a 5. 8依0. 8d 20. 8依1. 7b 19. 2依0. 8b 0c 0c
6723 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
表 5摇 平板试验抑菌圈直径
Table 5 摇 Diameters of inhibition zone of treadmill experi鄄
ment (mm, mean依SD)
菌种
Bacterium
毒液
Venom
(0. 5 VRE)
灭菌 PBS
Sterile
PBS
灭菌蒸馏水
Sterile purified
water
大肠杆菌
Escherichia coli
7. 7依0. 3Bb 0Aa 0Aa
金黄葡糖球菌
Staphyloccocus aureus
9. 7依0. 3Ab 0Aa 0Aa
枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis
8. 7依0. 3ABbc 8. 3依0. 7Bb 0Aa
PBS对枯草芽孢杆菌存在抑菌作用,不能证明毒液
对枯草芽孢杆菌是否存在抑菌作用.
2郾 4摇 温度对毒液麻痹及抑菌作用的影响
毒液的麻痹及抑菌活性在 30 和 40 益差异不显
著,40 益以后,随着温度升高毒液麻痹活性显著降
低,直至 60 益麻痹活性消失;对大肠杆菌的抑菌活
性在 40 益后显著升高,50 益以后没有显著变化;对
金黄葡萄球菌的抑菌活性在 60 益时显著降低,之后
随着温度升高抑菌活性消失(表 6).
表 6摇 温度对毒液麻痹与抑菌活性的影响
Table 6摇 Effects of temperature on venom paralysis and bacteriostasis (mean依SD)
温度
Temperature
(益)
麻痹数量
Paralytic number (heads)
毒液
Venom (0. 3 VRE)
灭菌 PBS
Sterile PBS
抑菌圈直径
Diameter of inhibition zone (mm)
大肠杆菌
Escherichia coli
金黄葡萄球菌
Staphyloccocus aureus
灭菌 PBS
Sterile PBS
30 36. 0依3. 0Ab 0Aa 7. 7依0. 3Aa 8. 7依0. 3Ac 0Ab
40 39. 3依0. 7Ab 0Aa 7. 7依0. 3Aa 8. 7依0. 3Ac 0Ab
50 19. 0依0. 6Bb 0Aa 9. 7依0. 3Ba 8. 7依0. 3Ac 0Ab
60 0. 7依0. 3Ca 0Aa 9. 7依0. 9Ba 6. 7依0. 3Bc 0Ab
80 0 Ca 0Aa 9. 7依0. 9Ba 0Cb 0Ab
100 0 Ca 0Aa 9. 7依0. 7Ba 0Cb 0Ab
3摇 讨摇 摇 论
3郾 1摇 毒液的麻痹与抑制蜕皮作用
外寄生蜂毒液最为常见的功能有麻痹和抑制寄
主蜕皮变态[19-20],Kilincer[21]早在 1975 年就发现黄
痣黑瘤姬蜂(Pimpla turionellae)对大蜡螟(Galleria
mellonella)蛹具有麻痹、抑制黑化及致死作用,而
Parkinson和 Weaver[22]对瘤姬蜂(P. hypochondria鄄
ca)毒液的研究也得到相似结果.川硬皮肿腿蜂是典
型的抑性外寄生蜂,其毒液的麻痹作用是寄生行为
十分重要的一步,只有使寄主活动能力减弱或丧失
才能进行取食和体外消化,为子代发育做准备,而过
早致死会导致寄主腐烂,不利于寄生蜂寄生[23];另
外,毒液的致死作用可能是对寄主免疫的一种调控
方式,因为死亡寄主的免疫应答将变得更少[22] .
自然蛰刺和人工注射毒液试验显示:寄主黄粉
虫蛹对川硬皮肿腿蜂毒液有一定的抵抗力,在低浓
度(0. 01 VRE)注入和自然蛰刺时,麻痹作用是可逆
的;注入 0. 01 VRE毒液的寄主大部分可恢复活动,
但是在 3 ~ 8 d内陆续死亡,可能是注射处理对虫体
伤害较大,刺入时破坏了脂肪体组织.随着毒液注入
浓度的升高轻微麻痹和恢复活动效果显著下降,而
完全麻痹效果显著升高,说明寄主的麻痹程度与恢
复状况与毒液浓度相关,毒液浓度能够在不同水平
上调控和影响寄主免疫、内分泌、营养代谢等生理功
能.部分自然蛰刺的寄主恢复活动后可以继续蛹期
发育,但是不能成功羽化,蜕皮被抑制了,可见川硬
皮肿腿蜂毒液也有抑制寄主蜕皮的作用. 对外寄生
蜂毒液而言,抑制寄主蜕皮变态是十分重要的,因为
其子代是依附于寄主体表生存,寄主蜕皮受到抑制
将有利于寄生蜂子代的生长发育[9-10] .毒液抑制黄
粉虫蛹蜕皮的机理尚不明确. 但蜕皮激素作用的靶
标是超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP),可能与
寄主血淋巴蛋白减少有关.另外,这种寄生导致的蜕
皮抑制也可能与蛰刺的物理伤害有关;昆虫受到物
理伤害时海藻糖浓度升高或糖降解速度变慢,从而
保持高血糖应对短时间内突然发生的意外,进而为
逃避或进攻行为的内环境保持最佳的活化状态,这
类情况被定义为海藻糖亢奋金属免疫( hypertreha鄄
losemia),这时蛹期营养代谢的改变也可能造成羽化
蜕皮失败.贺张等[24]研究发现,外界温度和寄主温
度均能影响寄生蜂生长发育,而 Parkinson 和 Weav鄄
er[22]研究了温度对毒液麻痹活性的影响,结果表
明,毒液在 50 益也存在麻痹活性.本试验中毒液麻
痹活性在 50 益以后显著降低,当温度达到 60 益时
活性丧失,表明温度对毒液麻痹活性是有影响的,且
毒液的麻痹活性在 30 益和 40 益最适宜.另外,温度
对毒液的影响可能表现在对麻痹蛋白活性的影响
772311 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 卓志航等: 川硬皮肿腿蜂毒液对寄主黄粉虫蛹的影响摇 摇 摇 摇
上,进而影响寄主各方面的生理功能.
3郾 2摇 毒液的抑菌与延缓黑化作用
对寄生蜂而言,寄主的免疫作用是成功寄生的
一道障碍,不利于子代蜂发育[25],但寄生蜂有多种
分泌物对寄主免疫进行调控,例如多分 DNA 病
毒[26]和卵巢蛋白[27]等.另外,昆虫免疫包括体液和
细胞免疫,其中体液免疫涉及到调节抗菌肽、血淋巴
凝结和一系列黑化酶的产生等.试验中注射菌液后,
黄粉虫蛹死亡并整个躯体泛黑,从体壁颜色判断应
该是启动了黑化反应;而菌液与毒液共注射结果表
明,毒液能在 48 h 内延缓这种黑化反应,说明毒液
具有延缓黑化作用的功能. 关于寄生蜂毒液对寄主
黑化作用的抑制已有大量报道,如瘤姬蜂毒液中的
丝氨酸蛋白酶和寄主体内丝氨酸蛋白酶相互竞争与
酚氧化酶原的结合位点,结果导致寄主酚氧化酶原
活性不能正常启动,从而延缓寄主的黑化反应[28];
Asgari等[29]对微红盘绒茧蜂(Cotesia rubecula)研究
也发现毒液中的丝氨酸蛋白酶类似物对寄主血淋巴
的黑化有抑制作用;另外,有的寄生蜂在抑制寄主免
疫的同时又以其他方式提高寄主对外界的适应能
力,如杀虫剂的抗性等,以提高子代蜂的成活率. 因
此这种黑化反应的延缓作用可能涉及毒液的免疫作
用(丝氨酸蛋白酶和酚氧化酶等)或者毒液对虫体
抗菌作用的诱导(如抗菌肽)或者毒液的抗菌作用;
但在毒液对蛹蛋白调控的试验中,蛹血淋巴电泳与
对照相比并未有特异性蛋白产生,因此不大可能是
毒液诱导抗菌肽的产生,具体机制需要进一步试验
探明.
在抑性寄生过程中,寄生蜂抑制寄主的生长发
育并以寄主为取食对象,多数情况是通过杀死寄主
来达成的,但子代蜂发育需要一定的时间,这时既需
要分解食物供自己和子代蜂取食又要防止食物腐化
变质,抑菌作用就显得非常重要了[23],正是由于抑
菌作用才能为寄生蜂持续提供食物. 对于毒液的抗
菌活性,郦卫弟[30]对颈双缘姬蜂 (Diadromus col鄄
laris)研究发现蜂毒具有抗菌活性,这说明寄生蜂毒
液中确实存在抗菌类物质.平板抑菌试验结果证明,
0. 5 VRE毒液对大肠杆菌和金黄葡萄球菌均有抑制
作用,但对金黄葡萄球菌抑制作用显著高于大肠杆
菌;PBS对枯草芽孢杆菌有抑制作用,因此这种方法
不能鉴别毒液对枯草芽孢杆菌是否有抑菌作用. 大
肠杆菌和金黄葡萄球菌是革兰氏阴性菌与阳性菌的
典型代表,毒液对它们抑制强度的差别可能与革兰
氏阴阳菌的属性有关,具体需要进一步试验探索.另
外,温度对毒液抑菌作用试验证明,对大肠杆菌的抑
菌活性在 40 益后显著升高,以后没有显著变化,而
对金黄葡萄球菌的抑菌作用在 60 益时显著降低,之
后随着温度升高抑菌活性消失,这可能是由于毒液
耐高温程度不同或毒液中不同组分分别对两种菌产
生抑制作用.本文对寄生蜂毒液的麻痹和抑菌作用
以及延缓黑化做了研究,但也产生了很多疑问,后续
研究将努力探讨解决这些问题.
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作者简介摇 卓志航,男,1989 年生,硕士研究生.主要从事昆
虫生理生化与分子生物学研究. E鄄mail: zhihangzhuo@ gmail.
com
责任编辑摇 肖摇 红
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