全 文 ：[基金项目 ] 　广东省科技厅科技计划项目基金资助(2003C33711)
[作者简介 ] 　陈晓燕(1966 - ),女 ,博士 , 副主任技师 ,主要从事
预防医学及临床检验学研究。
【论著】
高效毛细管电泳法测定膝沟藻毒素 2和 3
陈晓燕 ,张允奇 ,张银辉
(广东省深圳市第四人民医院 ,广东深圳　518033)
[摘要 ] 　目的:建立膝沟藻毒素(gonyautoxin, GTX)2和 3的毛细管电泳分析方法。用毛细管电泳法分析和定量 GTX免
疫原。方法:用磷酸氢二钠 -柠檬酸为运行缓冲液的区带毛细管电泳紫外检测法 ,对 GTX2和 3进行检测。结果:GTX2
在 0. 5 ～ 118. 0 μm o l /L, GTX3在 0.5 ～ 39. 0μmo l /L时 , 有良好的线性关系。 GTX2最低检测限为 0. 38 μm o l /L, GTX3最
低检测限为 0. 36 μm o l /L(S /N≥3)。日内精密度为:GTX2是 2. 5%, GTX3是 2. 6%;日间精密度是:GTX2为 5. 6%,
GTX3为 6.3%。用该法定量 GTX 2＆3免疫原中 GTX2的浓度为 325.8 ±32. 8 μm o l /L, GTX3的浓度为 287. 6 ±
15.1 μm o l /L。结论:用磷酸氢二钠 -柠檬酸为运行缓冲液的高效毛细管电泳法 , 可对 GTX2＆3相关样品进行快速而又
灵敏的分析和定量。
[关键词 ] 　麻痹性贝毒;膝沟藻毒素;毛细管电泳
[中图分类号 ] 　R155.5+1　　　　[文献标识码 ] 　A　　　　[文章编号 ] 　1004 - 8685(2007)03 - 0398 - 02
Analysis of gonyautoxin - 2＆3 by high performance capillary electrophoresis
Chen X iao-yan, Zhang Yun-qi, Zhang Y in-hui
(The Fourth People′s Hospita l o f Shenzhen, Shenzhen 518033, China)
[ Abstract] 　Objectives:To estab lish a m e thod to de term ine gonyautoxin (GTX) 2＆3 by capilla ry electropho re sis.M ethods:
This assay w as based on the ultravio le t abso rbance o fGTX 2＆3 a t zone capillary electrophore sis.The running buffe rwa s d isod ium
hydrogen phospha te - citric acid.Resu lts:The linea rity o f GTX2 was from 0. 5 μm o l /L to 118. 0 μm o l /L, and GTX3 from 0.5
μm ol /L to 39. 0μmo l /L.Them in im al de tection lim it of GTX2 was 0.38μmo l /L, and GTX3 w as 0.36μmo l /L(S /N≥3). W ith-
in - run precision of GTX2 w as 2. 5%, and GTX3 2. 6%. Between - run precision o f GTX2 w as 5. 6%, and GTX3 6. 3%. C on-
centra tion of imm unogen GTX2 w as quantified as 325.8±32. 8μmo l /L, and GTX3 quan tified as 287. 6±15.1μm ol /L. C onc lu-
sion:GTX 2＆3 can be quan tified rap id ly and sensitive ly by h igh perform ance cap illa ry e lec trophoresis in disodium hydrogen pho s-
pha te - citric acid buffer sy stem.
[ Keyw ords] 　Pa ra ly tic she llfish po ison ing;Gonyautoxins;Capilla ry e lectropho resis
　　海水贝类毒素的产生与海洋环境污染有密切的关系 , 在
目前发现的几大类贝类毒素中 , 麻痹性贝类毒素 (paraly tic
she llfish po isoning, PSP)在世界上分布的范围最为广泛。 PSP
是一类主要由赤潮藻类产生 、带有胍基的三环氨基甲酸脂类
酸稳定性小分子化合物 [ 1] 。
据报道 , PSP是大亚湾海域及广东沿海中常见的贝类毒
素 [ 2] , 其中膝沟藻毒素 (gonyautoxin, GTX)、 neoSTX、C1和 C2
等均有在沿岸贝类和藻类中被发现的报道 [ 3] , GTX2和 GTX3
的毒性较强也较为常见。制备针对 GTX 2＆3乃至针对大部分
麻痹性贝毒的特异性抗体 , 是生产 PSP快速检测试剂盒的关
键。本文建立了 GTX 2＆3高效毛细管电泳 (cap illa ry e lec tro-
pho resis, CE)分析系统 , 对作为免疫原的 GTX 2＆3样品进行
了分析和定量 , 而 GTX 2＆3的定量是这种半抗原与载体进行
有效连接和相关特异性抗体筛选的必要条件。
1　材料与方法
1.1　仪器与试剂
所用仪器包括 P /ACETM MDQ 型高效毛细管电泳仪
(BECKMAN COULTER, USA), 紫外检测器 , 熔融石英毛细管
(河北省永年锐沣光纤科技公司 ), O rion 410A型精密 pH 计
(USA)。
麻痹性贝类毒素 GTX 2＆3(NRC -CRM -GTX 2＆3 - b)
标准品购自加拿大国家研究院海洋研究所 , 免疫用 GTX 2＆3
样品赠自某国家重点实验室。其它化学试剂有:磷酸氢二钠
和柠檬酸(汕头市光华化学厂 , 分析纯), 36%醋酸 (广州市海
珠区化学试剂厂 , 分析纯 ), 醋酸钠 (广东光华化学厂 , 分析
纯)。
1.2　分离条件
冲洗及运行缓冲液为磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液。毛细
管 75 μm ×40 cm, 有效长度为 30 cm。分离电压 6 kv, 温度
25℃,压力进样(0.5 psi, 5 s),紫外检测波长为 200 nm。
1.3　分离条件的优化
采用不同的 pH 值(分别为 3.0, 4. 0, 5. 0, 6. 0)、不同的磷
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酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液浓度(75, 37.5, 18.8 mm o l /L)、不同
的分离电压 (7, 6, 5 kv), 对 NRC - CRM - GTX 2＆3 - b标准
GTX 2＆3毒素进行检测。
1. 4　对 GTX 2＆3免疫原的检测及定量
采用 37.5 mm ol /L, pH值为 5.0的磷酸氢二钠 -柠檬酸
缓冲液为运行缓冲液 ,对 GTX2浓度分别为 118. 0, 59.0, 29.5,
14.6, 5. 6, 1.3和 0. 5μm ol /L;GTX3浓度分别为 39 . 0, 19.5,
9. 8, 4.9, 2. 1, 0.5和 0. 2μm ol /L的 NRC -CRM -GTX 2＆3 -
b进行检测 , 绘制峰面积 -浓度标准曲线。并测定日内及日间
检测精密度。
用盐酸 -醋酸溶液(3 mmo l /L盐酸 , 10 mmo l /L醋酸 )按
1∶10及 1∶20的比例稀释 GTX 2＆3免疫原 , 每个样品检测 3
次。 NRC -CRM -GTX 2＆3 -b(118. 0μmo l /L)和 GTX 2＆3 -
b免疫原(1∶20稀释)按 1∶1体积混匀 ,连续检测 3次。
2　结果
2. 1　分离条件优化
经不同 pH值 、不同运行缓冲液浓度和不同分离电压的测
试 , 结果发现当 磷酸氢 二钠 - 柠檬酸 缓冲液 浓度为
37.5 mmo l /L、 pH值为 5.0、分离电压为 6 kv时 ,电泳图谱的基
线最为平整 , 噪音较低 ,两个峰的间隔较为适中 (图 1)。出峰
时间为 8.2 ～ 8.5 m in的峰为 GTX2吸收峰 , 8. 6 ～ 8. 9 m in的
峰是 GTX3的吸收峰。在约 11 m in处有一个醋酸根离子的负
吸收峰。
图 1　NRC - CRM -GTX 2＆3 - b标准品(59. 0μm ol /L)电泳图
2. 2　标准曲线的线性关系 、最低检测限和精密度
对系列稀释浓度的 NRC -CRM -GTX 2＆3 - b标准品进
行检测后 , 结果表明 GTX2浓度在 0. 5 ～ 118. 0 μm o l /L时 , 其
峰面积与质量浓度之间有良好的线性关系 , 直线方程为 Y =
0. 0004964X +0.081476,直线相关系数( r2)为 0. 9984, 最低检
测限为 0. 38 μm o l /L(按 S /N =3计算);GTX3浓度在 0. 5 ～
39.0 μm o l /L时 ,其峰面积与质量浓度之间有良好的线性关
系 , 直线方程为 Y =0.0004074 +0.027997,直线相关系数( r2)
为 0. 9986,最低检测限为 0. 36 μmo l /L(按 S /N =3计算)。取
NRC - CRM -GTX 2＆3 -b标准品作两倍稀释 , 进行日内和日
间的连续测定 , 测得日内精密度是:GTX2的浓度是 58. 7 ±
1. 5μm ol /L, RSD 为 2. 5%(n =12);GTX3的浓度是 19. 2 ±
0. 5μm ol /L, RSD为 2.6%(n =12)。 日间精密度是:GTX2的
浓度是 58.5±3. 3 μm o l /L, RSD 为 5. 6%(n =8);GTX3的浓
度是 19.5±1.3 μmo l /L, RSD 为 6.3%(n =8)。
2. 3　GTX 2＆3免疫原的鉴定及定量
在 8. 5 ～ 10 m in之间 , GTX 2＆3免疫原有 4个明显的吸收
峰 (图 2 a), 将免疫原样品与NRC - CRM -GTX2＆3 - b标准
品混匀后 , 8. 5 m in和 8.9 m in 两个峰的峰面积明显增加(图
2b), 表明 GTX 2＆3免疫原的这两个吸收峰与 NRC - CRM -
GTX 2＆3 - b标准品的 GTX2与 GTX3的两个吸收峰发生了叠
加。根据 8.5 m in的峰面积及 GTX2标准曲线 , 计算出 GTX
2＆3免疫原中 GTX2的浓度为 325. 8±32.8 μm o l /L(n=3);依
据 8.9 m in的峰面积及 GTX3标准曲线 , 计算出 GTX 2＆3免疫
原中 GTX3的浓度为 287.6±15. 1μmo l /L(n =3)。
图 2　GTX 2＆3免疫原电泳图
a.按 1∶20的比例稀释的 GTX 2＆3免疫原电泳图;b.GTX 2＆3
免疫原和 NRC -CRM -GTX 2＆3 - b标准品混匀后电泳图
3　讨论
Thibault等 [ 4]建立的 GTX 2＆3 CE检测系统中使用的吗啉
价格较贵 , 本文首次利用价格便宜的磷酸氢二钠 -柠檬酸缓
冲系统作为 CE运行缓冲液来检测 GTX 2＆3,获得了较低的检
测限(GTX2 0.38 μm o l /L, GTX3 0. 36 μm o l /L)和较为满意的
线性检测范围。这个检测方法的建立 , 不但使作为免疫原的
GTX 2＆3样品得到较好的定量 , 而且也极有可能应用于海产
品中污染 GTX 2＆3的定性和定量检测。 本文所使用的 GTX
2＆3免疫原为经过高压液相法分离的样品 , CE电泳图谱表明 ,
这个样品除 GTX2和 GTX3吸收峰外 , 还存在至少两个杂峰。
高压液相法为经典的 GTX分析方法 , 其分辨率显然没有 CE
法高。作为分辨率高而耗样量极少的分析方法 , CE法在 GTX
2＆3的分析和鉴定中 ,具有很好的应用前景。
[参考文献 ]
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(收稿日期:2006 -11 - 14)
399中国卫生检验杂志 2007年 3月第 17卷 第 3期　C hinese Jou rnal ofH ea lth Laboratory Technology, M ar 2007;Vol 17　No 3