全 文 ：南方红豆杉内生真菌的多样性与群落结构*
臧摇 威1 摇 孙摇 翔2 摇 孙剑秋1**摇 于文喜3 摇 王雪松4 摇 尹军霞1 摇 宋瑞清3
( 1绍兴文理学院生命科学学院, 浙江绍兴 312000; 2中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室, 北京 100101; 3黑龙江
省林业科学院, 哈尔滨 150081; 4齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 黑龙江齐齐哈尔 161006)
摘摇 要摇 从南方红豆杉 480 个针叶与枝条组织块中分离到 628 株内生真菌,根据形态特征和
ITS序列鉴定为 28 属 43 个分类单元.其中,包括 10 种丝孢菌、20 种腔孢菌、12 种子囊菌和 1
种未知真菌,茎生拟茎点霉为优势种;根据相对频率,链格孢、出芽短梗霉、博宁刺盘孢、盘长
孢状刺盘孢、黑附球菌、Fungal sp. 、砖红镰孢、围小丛壳、Magnaporthales sp. 、稻黑孢、斑点拟盘
多毛孢、小孢拟盘多毛孢、Peyronellaea glomerata和 Xylaria sp. 1 等在南方红豆杉中比较常见.
南方红豆杉受到内生真菌侵染的程度较高,81%的组织有内生真菌存在,其资源丰富并具有
较高的物种多样性;内生真菌分布受组织性质影响,南方红豆杉针叶中内生真菌的定植率、丰
富度、多样性明显低于枝条,枝条间内生真菌组成比针叶与枝条间更加相似,表现出组织偏好
性或专一性;组织年龄影响内生真菌的群落结构,随着南方红豆杉枝条组织年龄的增长,内生
真菌的定植率、丰富度、多样性均表现出逐渐增加的趋势.系统研究南方红豆杉内生真菌的多
样性与群落结构,阐明内生真菌在植物组织中的分布规律,可以为南方红豆杉内生真菌的开
发利用提供基础资料和科学依据;探讨病原真菌在健康植物组织中的存在情况,对于南方红
豆杉的植物资源保护具有积极意义.
关键词摇 内生真菌摇 多样性摇 群落结构摇 南方红豆杉摇 ITS
*中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室开放课题(SKLMKF201307)、浙江省重大科技专项(2013C02006鄄1)和黑龙江省自然科学基
金项目(C200806)资助.
**通讯作者. E鄄mail: jianqius@ 163. com
2013鄄10鄄17 收稿,2014鄄04鄄16 接受.
文章编号摇 1001-9332(2014)07-2071-08摇 中图分类号摇 Q949摇 文献标识码摇 A
Diversity and community structure of endophytic fungi from Taxus chinensis var. mairei.
ZANG Wei1, SUN Xiang2, SUN Jian鄄qiu1, YU Wen鄄xi3, WANG Xue鄄song4, YIN Jun鄄xia1, SONG
Rui鄄qing3 ( 1 College of Life Sciences, Shaoxing University, Shaoxing 312000, Zhejiang, China;
2State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing
100101, China; 3Heilongjiang Academy of Forestry Science, Harbin 150081, China; 4College of
Life Sciences, Qiqihar University, Qiqihar 161006, Heilongjiang, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,
2014, 25(7): 2071-2078.
Abstract: A total of 628 endophytic fungi were isolated from 480 tissue segments of needles and
branches of Taxus chinensis var. mairei. According to morphological characteristics and ITS se鄄
quences, they represented 43 taxa in 28 genera, of which 10 Hyphomycetes, 20 Coelomycetes, 12
Ascomycetes and 1 unknown fungus. Phomopsis mali was confirmed as the dominant species. In ac鄄
cordance with relative frequency, Alternaria alternata, Aureobasidium pullulans, Colletotrichum
boninense, C. gloeosporioides, Epicoccum nigrum, Fungal sp. , Fusarium lateritium, Glomerella
cingulata, Magnaporthales sp. , Nigrospora oryzae, Pestalotiopsis maculiformans, P. microspora,
Peyronellaea glomerata and Xylaria sp. 1 were more common in T. chinensis var. mairei. T.
chinensis var. mairei were severely infected by endophytic fungi. Endophytic fungi were found in 81
percent of plant tissues with a high diversity. Distribution ranges of endophytic fungi were influ鄄
enced by tissue properties. The colonization rate, richness, diversity of endophytic fungi in needles
were obviously lower than in branches, and kinds of endophytic fungi between branches were more
similar than those in needles, thus endophytic fungi had tissue preference. In addition, tissue age
influenced the community structure of endophytic fungi. The elder branch tissues were, the higher
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 7 月摇 第 25 卷摇 第 7 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jul. 2014, 25(7): 2071-2078
colonization rate, richness, diversity of endophytic fungi were. Systematic studying the diversity and
community structure of endophytic fungi in T. chinensis var. mairei and clarifying their distribution
regularity in plant tissues would offer basic data and scientific basis for their development and utili鄄
zation. Discussing the presence of fungal pathogens in healthy plant tissues would be of positive sig鄄
nificance for source protection of T. chinensis var. mairei.
Key words: endophytic fungi; diversity; community structure; Taxus chinensis var. mairei; ITS.
摇 摇 内生真菌栖居于生活植物的组织内部,菌体的
存在不会对植物造成明显伤害[1] . 人们发现内生真
菌已经有 100 余年的时间,但是直到美国科学家
Stierle等[2]确证红豆杉树的内生真菌可以产生抗癌
药物紫杉醇之后,有关植物内生真菌资源的研究才
受到国内外学者更加广泛的关注.基于地衣[3-4]、苔
藓[5]、蕨类[6]、禾草[7-8]、藤本[9]、灌木[10-11]、乔木[12]
等各类植物内生真菌的研究结果,内生于健康植物组
织中的真菌具有极其丰富的物种多样性[13] .这类特
殊的真菌资源不仅可以产生重要的生物活性物
质[14-16],而且可以促进宿主生长[17-19],增强抗虫能
力[20-21],在自然界的物质循环过程中承担重要角
色[22-23],植物内生真菌的多样性、资源学、系统学和
生态学等已经成为目前真菌学研究领域的热点之一.
近 20 年来,在红豆杉(Taxus)内生真菌资源的
开发利用方面成果丰硕,从短叶红豆杉(Taxus brevi鄄
folia) [2]、南洋红豆杉(T. sumatrana) [24]、欧洲红豆
杉(T. baccata) [25]、墨西哥红豆杉(T. globosa) [26]、
东北红豆杉(T. cuspidata) [27]、曼地亚红豆杉( T.
media) [28]、红豆杉 ( T. chinensis) [29]、南方红豆杉
(Taxus chinensis var. mairei) [30-31]、T. celebica[32]、西
藏红豆杉(T. wallichiana) [33]、云南红豆杉(T. yun鄄
nanensis) [34]等红豆杉属植物组织中,已经分离到可
以产生紫杉醇等多种生物活性物质的内生真菌. 但
是,这些研究成果主要着眼于内生真菌的潜在应用
价值,而红豆杉属植物内生真菌物种多样性与分布
规律方面的基础研究还比较薄弱. 通过经典真菌分
类方法并结合分子生物学技术,系统研究南方红豆
杉内生真菌的多样性与群落结构,阐明内生真菌在
植物组织中的分布规律,可以为南方红豆杉内生真
菌的开发利用提供基础资料和科学依据;探讨病原
真菌在植物组织中的存在情况,对于南方红豆杉的
植物资源保护具有积极意义.
1摇 研究地区与研究方法
1郾 1摇 采样地点与采样方法
采样地点为浙江省丽水市缙云县 (28毅 25忆—
28毅57忆 N,119毅52忆—120毅25忆 E),为我国南方红豆杉
主要分布区域,属亚热带气候,年均气温 17. 2 益,年
降水量 1450 mm,无霜期 245 d.
2011 年秋季,在缙云县山区从 15 棵百年以上
的南方红豆杉植株上采集研究标本,每棵植株间距
数千米.随机选取每棵植株的健康枝条,包括 1 年
生、2 年生和 3 年生等 3 个年龄阶段及针叶,立即运
回实验室进行内生真菌分离.
1郾 2摇 内生真菌分离和培养
将南方红豆杉的 1 年生、2 年生和 3 年生枝条
及其针叶剪切成 5 mm片段,用于内生真菌的分离.
植物组织块的表面消毒方法参照 Sun 等[13]进行,把
组织块连续浸入 75%乙醇(1 min)、3. 3%次氯酸钠
(5 min)、75%乙醇(0. 5 min),经无菌水冲洗后用滤
纸吸干,置于加有抗生素的 PDA 平板培养,定期观
察内生真菌的生长情况,适时采用尖端挑取法转接
于 PDA斜面保存备用.
1郾 3摇 内生真菌的分类地位
基于 3 个原则确定内生真菌的分类地位:内生
真菌的形态特征和培养特征;与 GeneBank核酸序列
数据库中公开发表的已知菌株相应序列相似程度;
分子系统学分析结果.
1郾 3郾 1 内生真菌形态型的划分摇 对分离到的大量内
生真菌培养物,首先检查菌株的产孢能力,对其中不
能产孢的菌株参照 Guo等[35]方法进行产孢诱导;然
后根据孢子大小、形态、颜色和产孢结构并结合内生
真菌的培养特征和生长特性,将内生真菌分成不同
的形态型[23] .
1郾 3郾 2 基因组 DNA 提取、ITS鄄PCR 扩增和测序 摇 参
照 Guo等[36]方法,从每个形态型的代表菌株新鲜培
养物中提取基因组 DNA. 使用引物 ITS5 ( 5忆鄄
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG鄄3忆) 和 ITS4 ( 5忆鄄
TCCTCCGCTTATTGATATGC鄄3忆)扩增内生真菌 28S
rDNA的 ITS区域(ITS1、5. 8S、ITS2),按照如下反应
条件进行 36 个循环:94 益,40 s;52 益,50 s;72 益,
1 min.获得 PCR产物经过纯化后,由北京华大基因
研究中心完成测序.
2702 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
1郾 3郾 3 内生真菌 ITS序列的比对分析摇 拷贝校正后
的内生真菌 ITS 序列提交 NCBI,在 GeneBank 核酸
序列数据库中进行同源序列搜索(BLAST search),
比较内生真菌与公开发表的已知菌株相应序列相似
程度;根据同源序列的搜索结果,使用 Clustal X 软
件进行匹配排列,然后用 Neighbor鄄Joining 分析方法
进行分子系统学分析.
1郾 4摇 数据处理
运用 EstimateS软件分析并计算物种累积曲线,
通过 Excel进行曲线绘制. 定植率是指南方红豆杉
标本中受内生真菌侵染的组织块数占全部样本组织
块数的百分数.丰富度是指南方红豆杉或其某类组
织中分离到的内生真菌种类数. Shannon 多样性指
数: H =- 移
k
i = 1
P i 伊 lnP i .其中:k 为南方红豆杉针叶
或枝条中内生真菌种类的总数;P i为某种内生真菌
的菌株数占全部内生真菌菌株数的百分数. 相对频
率是指南方红豆杉的某种内生真菌菌株数占内生真
菌总菌株数的百分数,逸1% ,该内生真菌为常见种
类. Sorenson相似性系数:Cs = 2j / (a+b). 其中: j 是
南方红豆杉两类组织中共同具有的内生真菌种类
数;a是一类组织中内生真菌的种类数;b 是另一类
组织中内生真菌的种类数. 基于每种常见内生真菌
在南方红豆杉不同组织中的定植率建立数据文库,
采用 SPSS 11. 5 统计软件进行系统聚类分析,分析
方法为组间平均距离法(between鄄groups linkage),按
照欧氏距离平方(squared Euclidean distance)测量相
似性,以树状图显示系统聚类分析结果.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 内生真菌的物种累积曲线
从 15 棵南方红豆杉的 480 个组织块中分离到
628 株内生真菌,基于菌株的培养特征、显微特征,
并结合 ITS序列分析结果,共鉴定为 43 种. 根据物
种累积曲线(图 1),约 84. 2%的南方红豆杉内生真
菌种类被分离出来,说明样本数量可以满足研究需
图 1摇 南方红豆杉内生真菌的物种累积曲线
Fig. 1摇 Species accumulation curves for endophytic fungi isola鄄
ted from Taxus chinensis var. mairei.
玉: 观察到的物种累积曲线 Observed species accumulation curve; 域:
95%置信区间 95% confidence interval; 芋: 物种丰富度 Bootstrap 均
值 Bootstrap mean of species richness.
要,结果能够反映南方红豆杉内生真菌的物种丰富
程度.
2郾 2摇 内生真菌的定植率
南方红豆杉的植物组织受到内生真菌侵染的程
度较高,81%的组织有内生真菌存在.从组织性质来
看,针叶中内生真菌的定植率明显低于枝条;从组织
年龄来看,1 年生枝条中内生真菌的定植率低于 2
年生、3 年生枝条,在 3 年生枝条中内生真菌的定植
率达到 100% (表 1).
2郾 3摇 内生真菌的组成与分布
南方红豆杉的 628 株内生真菌鉴定为 28 属、43
个分类单元,包括 10 种丝孢菌、20 种腔孢菌、12 种
子囊菌和 1 种未知真菌(表 2). 其中,10 种分离自
针叶、17 种分离自 1 年生枝条、23 种分离自 2 年生
枝条、28 种分离自 3 年生枝条(表 1). 从多样性指
数(H)来看,南方红豆杉的内生真菌具有丰富的物
种多样性,总体多样性指数达到 2. 8,而且表现出针
叶<1 年生枝条<2 年生枝条<3 年生枝条.
从表 3 可以看出,在南方红豆杉的常见内生真
菌中,出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、博宁刺
盘孢( Colletotrichum boninense) 、盘长孢状刺盘孢
表 1摇 南方红豆杉内生真菌的定植率、Shannon多样性指数和丰富度
Table 1摇 Colonization rates, Shannon diversity index and richness of endophytic fungi in Taxus chinensis var. mairei
项目
Item
样品块数
Number of
samples
长菌块数
Number of
isolates recovered
定植率
Colonization rate
(% )
丰富度
Richness
Shannon多样性指数
Shannon diversity
index
叶 Leaf 120 40 33. 3 10 1. 9
1 年生枝 1鄄year鄄old twig 120 111 92. 5 17 2. 2
2 年生枝 2鄄year鄄old twig 120 118 98. 3 23 2. 4
3 年生枝 3鄄year鄄old twig 120 120 100 28 2. 5
合计 Total 480 389 81 43 2. 8
37027 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 臧摇 威等: 南方红豆杉内生真菌的多样性与群落结构摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 南方红豆杉内生真菌的鉴定
Table 2摇 Identification of endophytic fungi in Taxus chinensis var. mairei
分类单元
Taxon
登录号
GenBank
accession No.
相关匹配菌株(登录号)摇 摇
Closest blast match摇 摇
(GenBank accession No. ) 摇 摇
内生真菌 /参考
菌株 ITS相似性
ITS similarity of
query / reference (% )
链格孢 Alternaria alternata KF574864 Alternaria alternata (JX960576. 1) 100
Amphiporthe sp. KF574865 Amphiporthe leiphaemia (AJ293882. 1) 94
Fungal sp. KF574866 Fungal sp. P2鄄2鄄4 (FR648382. 1) 99
Ascobolus sp. KF574867 Ascobolus crenulatus (DQ491504. 1) 91
豆类壳二孢菌 Ascochyta pinodes KF574868 Ascochyta pinodes (FJ194522. 1) 99
黑曲霉 Aspergillus niger KF574869 Aspergillus niger (KC119204. 1) 100
杂色曲霉 A. versicolor KF574870 A. versicolor (JQ717331. 1) 100
出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans KF574871 Aureobasidium pullulans (KC865285. 1) 100
葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea KF574872 Botryosphaeria dothidea (JF440858. 1) 100
尖孢刺盘孢 Colletotrichum acutatum KF574873 Colletotrichum acutatum (AJ301905. 1) 100
博宁刺盘孢 C. boninense KF574874 C. boninense (JX258796. 1) 99
盘长孢状刺盘孢 C. gloeosporioides KF574875 C. gloeosporioides (JX258727. 1) 100
Creosphaeria sassafras KF574876 Creosphaeria sassafras (JF502457. 1) 99
黑附球菌 Epicoccum nigrum KF574877 Epicoccum nigrum (KC568289. 1) 100
燕麦镰孢 Fusarium avenaceum KF574878 Fusarium avenaceum (HQ379700. 1) 99
木贼镰孢 F. equiseti KF574879 F. equiseti (JQ936181. 1) 100
砖红镰孢 F. lateritium KF574880 F. lateritium (AY266406. 1) 99
Gibberella avenacea KF574881 Gibberella avenacea (AY147283. 1) 100
G. sp. KF574882 G. sp. (JF502432. 1) 99
尖孢小丛壳 Glomerella acutata KF574883 Glomerella acutata (JF288551. 1) 100
围小丛壳 G. cingulata KF574884 G. cingulata (JX993255. 1) 100
G. fioriniae KF574885 G. fioriniae (JN121193. 1) 100
芒果球座菌 Guignardia mangiferae KF574886 Guignardia mangiferae (KC456263. 1) 100
Heydenia alpina KF574887 Heydenia alpina (JX171178. 1) 99
Leptostroma sp. KF574888 Leptostroma sp. (KC354586. 1) 100
Magnaporthales sp. KF574889 Magnaporthales sp. (JN198466. 1) 99
Microdiplodia hawaiiensis KF574890 Microdiplodia hawaiiensis (EU273508. 1) 99
疣孢漆斑菌 Myrothecium verrucaria KF574891 Myrothecium verrucaria (EF211127. 1) 100
稻黑孢 Nigrospora oryzae KF574892 Nigrospora oryzae (FJ487918. 1) 100
Paraconiothyrium brasiliense KF574893 Paraconiothyrium brasiliense (JF439492. 1) 100
木枋已拟盘多毛孢 Pestalotiopsis cocculi KF574894 Pestalotiopsis cocculi (EU273507. 1) 99
斑点拟盘多毛孢 P. maculiformans KF574895 P. maculiformans (HQ608011. 1) 99
小孢拟盘多毛孢 P. microspora KF574896 P. microspora (EU935587. 1) 99
韦司梅拟盘多毛孢 P. vismiae KF574897 P. vismiae (EU273510. 1) 100
Peyronellaea glomerata KF574898 Peyronellaea glomerata (HM008924. 1) 100
Phoma glomerata KF574899 Phoma glomerata (FJ481024. 1) 100
茎生拟茎点霉 Phomopsis mali KF574900 Phomopsis mali (AB665315. 1) 99
P. sp. KF574901 P. sp. (HM595506. 1) 99
Seiridium ceratosporum KF574902 Seiridium ceratosporum (JN198518. 1) 100
S. phylicae KF574903 S. phylicae (KC005788. 1) 99
S. sp. KF574904 S. sp. (JN198507. 1) 100
Xylaria sp. 1 KF574905 Xylaria sp. (KC110618. 1) 99
X. sp. 2 KF574906 X. sp. (HM535368. 1) 99
(C. gloeosporioides)、茎生拟茎点霉(Phomopsis ma鄄
li)从针叶和不同年龄的枝条中都可以分离到,而链
格孢(Alternaria alternata)、黑附球菌(Epicoccum nig鄄
rum)、Fungal sp. 、砖红镰孢(Fusarium lateritium)、围
小丛壳 (Glomerella cingulata)、Magnaporthales sp. 、
斑点拟盘多毛孢(Pestalotiopsis maculiformans)、小孢
拟盘多毛孢(P. microspora)、Peyronellaea glomerata
只存在于枝条组织.可见,常见种类占南方红豆杉内
生真菌的 88. 6% ,其中优势种茎生拟茎点霉的数量
达到南方红豆杉内生真菌的 23郾 4% .
4702 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
表 3摇 南方红豆杉常见内生真菌的相对频率
Table 3摇 Relative frequency (RF) of endophytic fungi in Taxus chinensis var. mairei (%, RF逸1%)
分类单元
Taxon
叶
Leaf
1 年生枝
1鄄year鄄old twig
2 年生枝
2鄄year鄄old twig
3 年生枝
3鄄year鄄old twig
合计
Total
链格孢 Alternaria alternata 1. 6 1. 0 2. 6
Fungal sp. 0. 8 2. 1 2. 9
出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans 2. 6 4. 3 1. 1 0. 5 8. 4
博宁刺盘孢 Colletotrichum boninense 1. 3 3. 0 2. 4 1. 6 8. 3
盘长孢状刺盘孢 Colletotrichum gloeosporioides 0. 3 1. 0 2. 6 3. 5 7. 3
黑附球菌 Epicoccum nigrum 1. 0 0. 3 1. 3
砖红镰孢 Fusarium lateritium 0. 2 0. 3 3. 5 4. 0
围小丛壳 Glomerella cingulata 1. 3 0. 6 0. 3 2. 2
Magnaporthales sp. 1. 6 1. 6
稻黑孢 Nigrospora oryzae 0. 8 0. 8 0. 6 2. 2
斑点拟盘多毛孢 Pestalotiopsis maculiformans 1. 1 1. 1
小孢拟盘多毛孢 P. microspora 0. 3 3. 0 4. 1 7. 5
Peyronellaea glomerata 0. 6 1. 3 1. 9
茎生拟茎点霉 Phomopsis mali 0. 6 2. 2 8. 4 12. 1 23. 4
Xylaria sp. 1 1. 9 7. 0 4. 9 13. 9
稀有内生真菌种类 Rare taxa (RF<1% ): Amphiporthe sp. 、Ascobolus sp. 、豆类壳二孢菌 Ascochyta pinodes、黑曲霉 Aspergillus niger、杂色曲霉 A. ver鄄
sicolor、葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea、尖孢刺盘孢 Colletotrichum acutatum、Creosphaeria sassafras、燕麦镰孢 Fusarium avenaceum、木贼镰孢 F.
equiseti、Gibberella avenacea、G. sp. 、尖孢小丛壳 Glomerella acutata、Glomerella fioriniae、芒果球座菌 Guignardia mangiferae、Heydenia alpina、Lep鄄
tostroma sp. 、Microdiplodia hawaiiensis、疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria、Paraconiothyrium brasiliense、木枋已拟盘多毛孢 Pestalotiopsis cocculi、韦司
梅拟盘多毛孢 P. vismiae、Phoma glomerata、Phomopsis sp. 、Seiridium ceratosporum、S. phylicae、S. sp. 、Xylaria sp. 2.
2郾 4摇 内生真菌组成的相似性和聚类分析
南方红豆杉针叶与枝条内生真菌组成的相似性
系数在 0. 5 ~ 0. 7,而枝条间内生真菌组成的相似性
系数达到 0. 7 ~ 0. 8 (表 4),与针叶相比,3 个年龄
枝条的内生真菌组成具有更高的相似程度.
摇 摇 基于每种常见内生真菌(表 3)在南方红豆杉针
叶与枝条中的定植率建立数据文库,进行系统聚类
分析.结果发现,15 株南方红豆杉的针叶在树形图
中聚在一个分枝内(图 2玉),而 15 个枝条标本有 11
株聚成一个分枝(图 2域),表明南方红豆杉的组织
性质影响内生真菌的种类、数量和分布.
摇 摇 基于每种常见内生真菌(表 3)在南方红豆杉不
同年龄枝条中的定植率建立数据文库,进行系统聚
类分析.从图 3 可以看出,15 株南方红豆杉 3 个年
龄的枝条在树形图中趋向于分布在 3 个分枝内. 其
中,9 株植物的 1 年生枝条聚在分枝玉内,6 株植物
的 2 年生枝条聚在分枝域内,9 株植物的 3 年生枝
条聚在分枝芋内.而且,代表 1 年生枝条的玉分枝中
表 4摇 南方红豆杉常见内生真菌组成的相似性系数
Table 4 摇 Sorenson爷 s similarity coefficients of endophytic
fungi in Taxus chinensis var. mairei
1 年生枝
1鄄year鄄old twig
2 年生枝
2鄄year鄄old twig
3 年生枝
3鄄year鄄old twig
叶 Leaf 0. 7 0. 6 0. 5
1年生枝1鄄year鄄old twig 0. 7 0. 8
2年生枝2鄄year鄄old twig 0. 8
混入 2 年生枝条 3 个,代表 3 年生枝条的芋分枝中
混入 2 年生枝条 6 个,域分枝中除 6 个 2 年生枝条
外还存在1年生枝条6个及3年生枝条6个 . 表明
图 2摇 基于定殖率的南方红豆杉针叶与枝条中内生真菌组
成的聚类分析
Fig. 2摇 Dendrograms based on the colonization rate of endophy鄄
tic fungi isolated from needles and branches of Taxus chinensis
var. mairei.
L: 针叶 Needle; B: 枝条 Branch. 字母后数字为样本树的编号 Num鄄
bers after letters were the individual number of sampling plants. 下同 The
same below.
57027 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 臧摇 威等: 南方红豆杉内生真菌的多样性与群落结构摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 3摇 南方红豆杉枝条内生真菌组成的聚类分析
Fig. 3摇 Cluster analysis of endophytic fungi isolated from bran鄄
ches of Taxus chinensis var. mairei.
字母前数字表示枝条年龄 Numbers before letters indicated the branch
age.
南方红豆杉枝条的年龄不仅影响内生真菌的定植率
(表 1),还对内生真菌的群落组成产生影响,从 1 年
生枝条、2 年生枝条直到 3 年生枝条,内生真菌的组
成随着年龄的增长表现出逐渐演替的趋势.
3摇 讨摇 摇 论
传统的内生真菌研究多基于培养物的显微特征
和培养特性进行,但是每种植物的内生真菌中都有
大量菌株不能产生无性孢子或有性孢子[4,13],即使
经过产孢诱导之后,不能产孢的菌株仍然占有较高
比例,因此,传统的内生真菌研究方法具有很大的局
限性[35] .序列分析等分子生物学技术与传统内生真
菌研究方法相结合,提升了内生真菌研究的技术水
平[23],是未来内生真菌研究技术的重要发展方
向[37-38] .本研究对于南方红豆杉的每个内生真菌培
养物进行形态型划分,并通过 ITS 序列的系统学分
析明确菌株分类地位.
在南方红豆杉植物组织中,内生真菌定植率达
到 81% ,多样性指数达到 2. 8,丰富度为 43,表明南
方红豆杉的内生真菌资源丰富并具有较高的物种多
样性. Fr觟hlich 等[39]对生长于热带地区的棕榈树
(Licuala)内生真菌进行研究,发现澳大利亚棕榈树
的内生真菌定植率为 83% ,而文莱棕榈树的内生真
菌定植率达到 81% ~89% ,内生真菌的丰富度分别
达到 36 和 54;但是对于一些温带植物,如杜仲(Eu鄄
commia ulmoides)、连翘(Forsythia suspense)、秦岭连
翘(F. giraldiana)、卵叶连翘(F. ovata)、细叶小檗
(Berberis poiretii)、青麸杨(Rhus potanini)等的内生
真菌定植率在 47. 9% ~ 63. 1% ,多样性指数为 1 ~
1. 6[13];不同季节的油松组织中内生真菌定植率为
21% ~46% [40] .因此,与温带地区生长的植物相比,
亚热带和热带地区的植物组织中可能蕴藏着更加丰
富多样的真菌资源.
在南方红豆杉的常见内生真菌中,许多种类分
布广泛,包括链格孢[13]、出芽短梗霉[41]、博宁刺盘
孢[42]、盘长孢状刺盘孢[42-43]、黑附球菌[41]、砖红镰
孢[43]、围小丛壳[44]、稻黑孢(Nigrospora oryzae) [23]、
斑点拟盘多毛孢[26]、小孢拟盘多毛孢[45]、Peyronel鄄
laea glomerata[46]和 Xylaria sp. [41]等及在南方红豆
杉各组织中具有明显分布优势的茎生拟茎点霉[47],
在其他红豆杉树种或其他植物组织中经常可以分离
到. Hawksworth 和 Rossman[48]指出,每种植物的组
织中可能有 5. 3 种特殊内生真菌存在. 植物组织作
为新的真菌资源的可能栖息生境已经受到广泛关
注,内生于各种植物组织的新的真菌种类也不断被
发现[49-50] .基于 ITS鄄PCR对南方红豆杉内生真菌的
鉴定结果也表明,其组织中蕴藏着一些特殊的新的
真菌种类(表 2).
在南方红豆杉针叶和枝条组织中,针叶的内生
真菌定植率为 33. 3% ,远低于枝条的内生真菌定植
率(92. 5% ~ 100% ) (表 1);聚类分析结果(图 2)
表明,南方红豆杉针叶、枝条等不同性质组织受到内
生真菌的侵染程度不同.从内生真菌的组成来看,南
方红豆杉针叶中内生真菌的多样性(1. 9)小于枝条
(2. 2 ~ 2. 5)(表 1),且枝叶间内生真菌的相似程度
(0. 5 ~ 0. 7)也低于枝条间(0. 7 ~ 0. 8)(表 4),表明
南方红豆杉的内生真菌群落分布受组织性质的影
响.这可能与植物组织内生理条件、组织结构和营养
物质等因素不同,从而影响到内生真菌的侵染过程,
使内生真菌的分布表现出组织偏好性或专一
6702 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
性[13,51] .
植物组织的年龄也影响着内生真菌的群落结
构[52] .在南方红豆杉的枝条中,随着组织年龄的增
长,内生真菌的定植率、丰富度、多样性均表现出逐
渐增加的趋势(表 1).聚类分析结果也表明,不同种
类的内生真菌对于南方红豆杉不同年龄枝条的侵染
可能是一个渐进发生的过程(图 3). Aly 等[51]认为,
表生菌在植物组织变老或者在外部条件不适合时,
可能侵入组织内部转化为内生菌. 较老的植物组织
由于发生表皮降解等变化,有利于内生真菌侵染过
程的实现[13],而且有更多的时间从环境中积聚真
菌[39-40] .
在南方红豆杉的健康组织中存在着大量常见病
源真菌,例如,链格孢、博宁刺盘孢、盘长孢状刺盘
孢、砖红镰孢、围小丛壳、小孢拟盘多毛孢等.这些真
菌在内生阶段,虽然不会对植物健康产生明显的负
面影响[51,53],但是在植物衰退的过程中可能转化为
植物的病源菌[51,54] . 例如,小孢拟盘多毛孢在内生
于佛罗里达榧树(Torreya taxifolia)树皮的初期不会
引起病症,但若生理条件或环境条件发生改变会促
使它表现出致病性[55] .然而,Brum 等[41]发现,尽管
这些真菌在很多文献中与植物病害相关,但是内生
于植物组织的病源真菌可能只具有较弱的致病性或
者已经丧失了致病能力.
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作者简介 摇 臧 摇 威,女,1975 年生,博士,副教授. 主要从事
微生物资源学与微生物生态学研究,发表论文 30 余篇.
E鄄mail: zangwei4670@ sina. com
责任编辑摇 肖摇 红
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