全 文 ：枸骨益生菌的筛选及其抑菌作用∗
赵龙飞１∗∗　 徐亚军１　 赖心河２　 寇田超１　 闫俊利１　 周佩佩１　 范闪闪１　 闫永峰１
（ １商丘师范学院生命科学学院， 河南省高校植物与微生物互作重点实验室， 河南商丘 ４７６０００； ２温州医科大学附属第一医院
转化医学研究所， 浙江温州 ３２５０００）
摘　 要　 采用涂布平板法分离药用植物枸骨可培养内生细菌，采用对峙法和发酵滤液培养法
筛选对植物病原菌具高抑制作用的菌株，通过镜检和显微摄影观察处理组菌丝的变化，对 １６Ｓ
ｒＤＮＡ ＰＣＲ产物进行测序和同源性分析菌株的系统发育关系，通过形态、生理生化特征和 １６Ｓ
ｒＤＮＡ序列比对确定菌株的分类地位．从枸骨健康植株的根、茎、叶及果实中分离得到 ８５ 株内
生细菌，筛选出对烟草赤星病菌、稻瘟病菌、棉花枯萎病菌等有较强抑菌作用的 １０ 株菌，初步
鉴定为 ４属 ７种．其中，抑菌效果最强的 ＧＧ７８（６０．３％）、ＧＧ３１（４８．１％）、ＧＧ３（６１．０％）分别属
于阴沟肠杆菌、路德维希肠杆菌和蜡样芽孢杆菌．受抑制病原菌菌丝均发生畸形、扭曲，局部
膨大形成原生质浓缩球、菌丝基部出现毛发状细分支等现象，可能与内生菌分泌到胞外具有
一定抑菌或杀菌作用的代谢物质如抗生素、水解酶类、生物碱等有关．
关键词　 枸骨； 内生细菌； 抑菌作用； 代谢产物
文章编号　 １００１－９３３２（２０１５）０５－１５５３－１０　 中图分类号　 Ｑ１４　 文献标识码　 Ａ
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔ Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐａｔｈ⁃
ｏｇｅｎ⁃ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ． ＺＨＡＯ Ｌｏｎｇ⁃ｆｅｉ１， ＸＵ Ｙａ⁃ｊｕｎ１， ＬＡＩ Ｘｉｎ⁃ｈｅ２， ＫＯＵ Ｔｉａｎ⁃ｃｈａｏ１， ＹＡＮ Ｊｕｎ⁃
ｌｉ１， ＺＨＯＵ Ｐｅｉ⁃ｐｅｉ１， ＦＡＮ Ｓｈａｎ⁃ｓｈａｎ１， ＹＡＮ Ｙｏｎｇ⁃ｆｅｎｇ１ （ １ Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ⁃Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈａｎｇｑｉｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｑｉｕ
４７６０００， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ； ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｗｅｎｚｈｏｕ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｅｎｚｈｏｕ ３２５０００， Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ） ． ⁃Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｅｃｏｌ．， ２０１５， ２６（５）：
１５５３－１５６２．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔ Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ ｂｙ ｐｌａｔｅ⁃
ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ， ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｃｏｎｆｒｏｎｔａ⁃
ｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏ⁃
ｇｅｎ ｈｙｐｈａｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ． Ｔｈｅｉｒ
ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰＣＲ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ８５ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃ⁃
ｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｒｏｏｔｓ， ｓｔｅｍｓ， ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｆｒｕｉｔｓ ｏｆ Ｉ． ｃｏｒｎｕｔａ， ａｎｄ １０ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ
ｔｈｅｍ ｓｈｏｗｅｄ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ， Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ， Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ⁃
ｒｕｍ， ａｎｄ ｗｅｒｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ｆｏｕｒ ｇｅｎｅｒａ ａｎｄ ｓｅｖｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ， ＧＧ７８ （６０．３％）， ＧＧ３１ （４８．１％） ａｎｄ ＧＧ１３ （６１．０％） ｂｅ⁃
ｌｏｎｇｅｄ ｔｏ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ， Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ
ａｎａｌｙｓｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎ ｈｙｐｈａｅ ｂｅｃａｍｅ ｄｅｆｏｒｍｅｄ， ｄｉｓｔｏｒｔｅｄ， ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌｌｙ
ｅｘｐａｎｄｅｄ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈａｉｒ⁃ｌｉｋｅ ｂｒａｎｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｈｙｐｈａｅ ｂａｓｅ． Ｔｈｅｓｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉ⁃
ｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ
ｂａｃｔｅｒｉａ， ｓｕｃｈ ａｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ， ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ， ａｌｋａｌｏｉｄｓ ａｎｄ ｓｏ ｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ； ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ； ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ．
∗国家自然科学基金项目（Ｕ１２０４３０１）和河南省高等学校青年骨干教师项目（２０１２ＧＧＪＳ１６６）资助．
∗∗通讯作者． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｈｎｚｈａｏｌｏｎｇｆｅｉ＠ １６３．ｃｏｍ
２０１４⁃０７⁃０７收稿，２０１５⁃０２⁃０３接受．
应 用 生 态 学 报　 ２０１５年 ５月　 第 ２６卷　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ ２０１５， ２６（５）： １５５３－１５６２
　 　 内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段
生活于健康植物各种组织和器官细胞间隙或细胞
内，对植物不造成明显实质性危害而与植物建立和
谐联合关系的微生物类群［１］，它们是一类重要的微
生物资源，也是新型天然活性物质的重要来源之一．
自 Ｓｔｉｅｒｌｅ等［２］从短叶紫杉（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｏｉｆｏｌｉａ）中发现
产紫杉醇的内生真菌后，有关植物内生菌的研究逐
渐引起研究者的兴趣，已成为近十年来微生物学、植
物学、药学、生态学等研究的一大热点．药用植物是
具有特殊化学成分和生理功能的植物资源，内生菌
生活在植物体内特定环境，与宿主长期进化、共生，
形成了稳定的互利关系，能产生与宿主植物代谢相
同或相似的活性物质，参与药用植物的抗菌过
程［３－４］ ．多种能够产生药用代谢产物的内生菌已经从
药用植物红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉ⁃
ｌｏｂａ）、茅苍术（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｌａｎｃｅａ）、石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉ⁃
ｕｍ ｎｏｂｉｌｅ）、雷公藤（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）、长春花
（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、连翘（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｓｕｓｐｅｎｓａ）、艾
蒿（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｒｇｙｉ）、薄荷（Ｍｅｎｔｈａ ｈａｐｌｏｃａｌｙｘ）、杜仲
（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）、美登木（Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｈｏｏｋｅｒｉ）、姜
黄（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、射干（Ｂｅｌａｍｃａｎｄａ ｃｈｉｎｅｎｓｉ）、金
银花（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、山药（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｏｐｐｏｓｉｔａ）、
枸杞 （ Ｌｙｃｉｕｍ）、甘草 （ Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、党参
（Ｃｏｄｏｎｏｐｓｉｓ ｐｉｌｏｓｕｌａ）、麻黄（Ｅｐｈｅｄｒａ ｓｉｎｉｃａ）、怀地黄
（Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｕｓａ）、大戟 （ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｋｉｎｅｎ⁃
ｓｉｓ）、独一味（Ｌａｍｉｏｐｈｌｏｍｉｓ ｒｏｔａｔａ）、苦豆子（Ｓｏｐｈｏｒａ
ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ）、苦马豆 （ Ｓｗａｉｎｓｏｎｉａ ｓａｌｓｕｌａ）和紫苏
（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）等［５－６］中分离获得．李小林等［７］采
用 ＬＨ⁃ＰＣＲ技术研究 ３ 种药用植物党参、麻黄和独
一味内生细菌多样性；戴传超等［８］研究了大戟内生
菌 Ｅ５ 的抑菌活性及其与宿主的相关性；陈传文
等［９］对药用植物长春花（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、海南
粗榧（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ）和见血封喉（Ａｎｔｉａｒｉｓ
ｔｏｘｉｃａｒｉａ）的内生菌进行了抗肿瘤活性筛选；冀玉良
等［１０］采用组织块分离法，从药用植物连翘根茎叶组
织分离内生菌，以烟草赤星菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、
苹果干腐病菌（Ｂｏｔｒｙｏｌｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ）、棉立枯病
菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、茄腐皮病镰孢霉（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｓｏｌａｎｉ）、草燕麦镰孢霉（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｖｅｎａｃｅｕｍ）５ 种植
物病原菌作为靶标菌，测定了连翘内生菌的抗菌活
性；杨清香等［１１］利用平板分离法从怀地黄中分离出
１３０株内生菌，以大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、金黄色
葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）和黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌ⁃
ｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）作为供试菌株，通过对峙试验和平板点接
法筛选出 ８株对 ３种供试菌株均具较强拮抗作用的
内生菌．
枸骨（ Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ）是冬青科（Ａｑｕｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）冬
青属（ Ｉｌｅｘ）常绿灌木或小乔木，是一味传统中药，其
根、茎、叶和果实等均可入药，具有清热养阴、平肝益
肾、散风通络等药用功效，还有杀菌抗炎、抑制免疫
细胞过度活化、增殖的作用［１２］ ．目前，对枸骨的研究
主要集中在化学成分、药理作用［１２］以及枸骨内生真
菌抑制黄瓜枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ． ｓｐ． ｃｕ⁃
ｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、菜豆炭疽病菌 （ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅ⁃
ｍｕｔｈｉａｎｕｍ）、西瓜枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．
ｓｐ． ｎｉｖｅｕｍ）、黄瓜立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）和番
茄早疫病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｎａｌｉ）等病原菌方面［１３］，而
关于枸骨内生细菌抑制植物病原菌的研究未见报
道．本研究从枸骨的根、茎、叶及成熟果实中分离内
生菌，筛选出高效抑制植物病原菌的内生细菌，确定
其系统发育地位和初步探索抑制病原菌的机理，旨
在为进一步研发生物杀菌剂及研究内生菌活性成分
提供理论依据．
１　 材料与方法
１􀆰 １　 供试样品
枸骨样品于 ２０１１ 年 ５ 月采自商丘师范学院药
用植物园（３３°２３′—３３°２８′ Ｎ、１１５°３６′—１１５°３８′ Ｅ），
海拔 ５１ ｍ，地势平坦，排水状况良好，土壤为沙壤
土，ｐＨ ７．６．取健康植株的根、茎、叶及果实，装入无
菌袋迅速带回实验室处理．
１􀆰 ２　 供试培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基、马铃薯蔗糖琼脂培
养基（ＰＤＡ）和 ＬＢ培养基［１４］ ．
１􀆰 ３　 供试植物病原菌
棉花枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｖａｓｉｎ⁃
ｆｅｃｔｕｍ） ＦＯ１０１、 稻 瘟 病 菌 （ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ）
ＭＧ１０２ 和烟草赤星病菌 （ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ ）
ＡＡ１０３由西北农林科技大学生命科学学院惠赠．以
菌核的形式保藏在－ ８０ ℃冰箱中，传代培养采用
ＰＤＡ培养基，３０ ℃培养 ２～３ ｄ．
１􀆰 ４　 试验设计
１􀆰 ４􀆰 １枸骨内生菌的分离、纯化和保藏 　 将枸骨植
株的根、茎、叶和果实等组织进行表面消毒［１５］，内生
菌的分离、纯化采用涂布平板法于 ＬＢ 培养基、牛肉
膏蛋白胨培养基上，２８ ℃恒温培养箱中培养 ３～７ ｄ．
根据平板上长出菌落的形态、颜色、大小等挑取不同
菌落，反复划线后经染色、镜检，保藏于斜面备用．
４５５１ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
１􀆰 ４􀆰 ２拮抗性内生菌的筛选 　 拮抗性内生菌的初
筛、复筛采用平板对峙法［１６］ ．抑菌活性采用抑制率＝
［（对照菌落直径－处理菌直径） ／对照菌落直径］ ×
１００％．将初筛中抑菌活性较强的菌株进行复筛．过程
同上，每处理 ３次重复．
１􀆰 ４􀆰 ３拮抗菌株代谢液抑菌活性的测定　 把活化好
的抑菌活性较强的菌株接种到装有 ２００ ｍＬ 的 ＬＢ
液体培养基的三角瓶中，２８ ℃ １２０ ｒ·ｍｉｎ－１恒温震
荡培养 ７ ｄ 后，８０００ ｒ·ｍｉｎ－１离心后在无菌条件下
过滤除去沉淀和菌体，滤液用于代谢产物活性的测
定［１７］ ．
取 ２０ ｍＬ 滤液与 １５０ ｍＬ 熔化冷却至 ６０ ℃的
ＰＤＡ培养基混合均匀制成平板，将直径为 ０．５ ｃｍ生
长旺盛的植物病原菌菌饼接种在平板上，以加无菌
水的 ＰＤＡ平板为对照，每处理 ３次重复，置于 ２８ ℃
下恒温培养 ５ ｄ，测量处理和对照菌落直径，计算抑
制率．
１􀆰 ４􀆰 ４拮抗菌的理化特性和培养特征　 对所筛选的
拮抗菌在不同培养基上进行生理生化特性测试，对
菌体形态、大小、革兰氏染色等细胞学特征进行观
察、镜检并记录．
１􀆰 ４􀆰 ５ １６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析　 采用 ＤＮＡ试剂盒 ＯＳＲ⁃
Ｍ５０２ （天根生化科技有限公司生产）提取细菌基因
组总 ＤＮＡ，并以之为模板，进行 １６Ｓ ｒＤＮＡ的扩增．所
用引物、扩增体系、反应条件见文献［１８］，扩增产物
送北京奥科鼎盛生物技术服务公司测序，把测出的
序列在 ＧｅｎＢａｎｋ 中进行 ＢＬＡＳＴ 分析，用 ＤＮＡＭＡＮ
６．０ 进行序列相似性分析，通过 Ｃｌｕｓｔａｌ⁃Ｘ１． ８１ 和
ＴＲＥＥＣＯＮＷ软件（ｖｅｒｓｉｏｎ １．３ｂ），以 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇ
方法构建系统发育树，用 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ（１０００ 次重复）进
行检验．
１􀆰 ４􀆰 ６病原菌菌丝的显微观察　 用装有荧光装置的
系统相差显微镜观察病原菌菌丝形态发生的变化，
记录并拍摄照片．
１􀆰 ５　 数据处理
利用 ＳＰＳＳ １７． ０ 软件对数据进行统计分析．采
用双因素随机方差分析（ ｔｗｏ⁃ｗａｙｓ ＡＮＯＶＡ）和最小
显著差数法（ＬＳＤ）分析菌落直径和对照菌落直径对
抑菌率的影响，显著性水平设定为 α＝ ０．０５．
２　 结果与分析
２􀆰 １　 内生菌的分离
从枸骨根、茎、叶和果实中共分离到可培养内生
细菌 ８５ 株．其中，根部 ５２ 株（６１． ２％），茎部 １７ 株
（２０􀆰 ０％），果实 １２株（１４．１％），叶部 ４株（４．７％）．根
部分离得到的内生菌最多，茎部、果实次之，叶片中
最少．
２􀆰 ２　 拮抗菌的筛选
枸骨内生菌对植物病原菌均表现出不同程度的
抑制作用．接种内生菌后的植物病原菌则表现为菌
落萎缩，菌丝生长受阻，部分菌丝颜色发生变化，且
出现消融现象，导致菌落形态不规则，在抑制区域出
现一些类似分泌物的物质，使菌丝贴在培养基表面．
　 　 从表 １ 可知，８５ 株枸骨内生菌中有 ２９ 株（占
３４．１％）对烟草赤星病原菌有不同程度的抑菌活性．
其中，抑制率＞２０％的内生菌有 １０ 株（占抑菌总数
的 ３４．５％）．根中分离到有抑菌作用的内生菌有 ２０
株，所占抑菌总数比例最大，为 ６９．０％；茎部有抑菌
作用的内生菌有 ７ 株（约占 ２４．１％），叶片内生菌有
２株（约占 ６．９％）．对烟草赤星有抑菌作用内生菌的
数量表现为：根部＞茎部＞叶片．其中，ＧＧ７８ 抑菌率
最大（６０．３％），ＧＧ３３其次（５６．４％），ＧＧ１６ 抑菌率为
２１．８％，三者间差异显著．其余菌株的抑菌率逐渐
变小．
　 　 对棉花枯萎病菌有抑菌效果的内生细菌有 ２２
株（占 ２５． ９％），其中抑菌率 ＞ ２０％的有 １３ 株 （占
５９􀆰 １％）（表 ２）．根部对棉花枯萎病菌有抑菌效果的
内生菌有 １０ 株，占 ４５．５％；茎部有 ７ 株，占 ３１．８％；
果实有 ４株，占 １８．２％；叶部内生菌 １株，为 ４．６％．对
棉花枯萎病菌有抑菌作用的内生菌数量为：根部＞
茎部＞果实＞叶片 ．ＧＧ１３抑菌效果最强（抑菌率为
表 １　 枸骨内生菌对烟草赤星病菌 ＡＡ１０３的抑制作用
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅ⁃
ｒｉａ ａｇａｉｎｓｔ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ ＡＡ１０３
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
菌落直径
Ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ
（ｃｍ）
抑菌率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ
（％）
对照 Ｃｏｎｔｒｏｌ ７．８±０．０ －
ＧＧ７８ ３．１±０．０ ６０．３±０．１ａ
ＧＧ３３ ３．４±０．１ ５６．４±０．５ｂ
ＧＧ４９ ４．１±０．１ ４７．４±０．１ｃ
ＧＧ５９ ４．２±０．１ ４６．２±０．１ｄ
ＧＧ６５ ４．４±０．０ ４３．６±０．３ｅ
ＧＧ０５ ４．８±０．０ ３８．５±０．１ｅ
ＧＧ０８ ５．２±０．１ ３３．３±０．１ｆ
ＧＧ３６ ６．０±０．０ ２３．１±０．１ｇ
ＧＧ４１ ６．１±０．０ ２１．８±０．２ｇ
ＧＧ１６ ６．１±０．１ ２１．８±０．１ｈ
菌落直径为 ７２ ｈ 时测得的 ３ 个重复的平均值±标准差 Ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ
ｃｏｌｏｎｙ ｇｒｏｗｉｎｇ ｆｏｒ ７２ ｈｏｕｒｓ ｗａｓ ｍｅａｎ±ＳＤ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ． 不同小
写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｍｅａｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒ⁃
ｅｎｔ ａｔ ０．０５ ｌｅｖｅｌ． 下同 Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
５５５１５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 赵龙飞等： 枸骨益生菌的筛选及其抑菌作用　 　 　 　 　 　
表 ２　 内生菌对棉花枯萎病菌 ＦＯ１０１的抑制作用
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅ⁃
ｒｉａ ａｇａｉｎｓｔ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＦＯ１０１
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
菌落直径
Ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ
（ｃｍ）
抑菌率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ
（％）
对照 Ｃｏｎｔｒｏｌ ８．２±０．０ －
ＧＧ１３ ３．２±０．１ ６１．０±０．１ａ
ＧＧ６２ ４．２±０．３ ４８．８±０．１ｂ
ＧＧ６３ ４．４±０．１ ４６．３±０．２ｃ
ＧＧ６１ ５．３±０．２ ３５．４±０．３ｄ
ＧＧ４８ ５．４±０．１ ３４．１±０．５ｅ
ＧＧ６７ ５．４±０．２ ３４．１±０．３ｅ
ＧＧ７４ ５．４±０．１ ３４．１±０．１ｅ
ＧＧ０９ ５．６±０．０ ３１．７±０．６ｆ
ＧＧ４１ ６．３±０．１ ２３．２±０．３ｇ
ＧＧ４３ ６．３±０．０ ２３．２±０．１ｇ
ＧＧ５６ ６．４±０．０ ２２．０±０．２ｈ
ＧＧ７８ ６．５±０．２ ２０．７±０．１ｈｉ
ＧＧ７９ ６．５±０．５ ２０．７±０．４ｉ
６１􀆰 ０％），ＧＧ６２次之（４８．８％），ＧＧ７９ 为 ２０．７％，其余
抑菌率＜２０％．
　 　 对稻瘟病菌有抑菌效果的内生菌有 １８ 株菌
（２１．２％），且均为根部内生细菌．其中，抑菌效果＞
２０％有 １３株（占有抑菌效果菌株总数的 ７２．２％）（表
３）． ＧＧ３１ 抑菌效果最强 （ ４８． １％）， ＧＧ３０ 次之
（４３􀆰 ０％），ＧＧ４１抑制率为 ２１．５％．
抑菌率最大的内生菌分别为 ＧＧ７８（抑制烟草
赤星病菌）、ＧＧ１３（抑制棉花枯萎病菌）和 ＧＧ３１（抑
制稻瘟病菌）．抑菌率＞２０％的内生菌中，仅有 ＧＧ４１
对３种病原真菌有不同程度的抑菌效果；对烟草赤
表 ３　 内生菌对稻瘟病菌ＭＧ１０２的抑制作用
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅ⁃
ｒｉａ ａｇａｉｎｓｔ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ＭＧ１０２
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
菌落直径
Ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ
（ｃｍ）
抑菌率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ
（％）
对照 Ｃｏｎｔｒｏｌ ７．９±０．０ －
ＧＧ３１ ４．１±０．０ ４８．１±０．１ａ
ＧＧ３０ ４．５±０．０ ４３．０±０．１ｂ
ＧＧ０８ ５．０±０．１ ３６．７±０．３ｃ
ＧＧ０２ ５．２±０．２ ３４．２±０．４ｃｄ
ＧＧ２９ ５．１±０．０ ３５．４±０．３ｃｄ
ＧＧ０１ ５．２±０．０ ３４．２±０．１ｄ
ＧＧ０７ ５．３±０．０ ３２．９±０．１ｅ
ＧＧ１０ ５．４±０．０ ３１．６±０．５ｅ
ＧＧ０５ ５．６±０．１ ２９．１±０．２ｆ
ＧＧ１６ ５．９±０．１ ２５．３±１．０ｇ
ＧＧ３６ ５．９±０．４ ２５．３±０．５ｇ
ＧＧ０９ ５．９±０．２ ２５．３±０．１ｈ
ＧＧ４１ ６．２±０．３ ２１．５±１．１ｈ
星和稻瘟病菌均有抑制效果的有 ＧＧ０５、 ＧＧ０８、
ＧＧ３６、ＧＧ４１；对棉花枯萎和稻瘟病菌兼有抑制效果
的仅有 ＧＧ０９ 和 ＧＧ４１．这些内生菌对不同病原真菌
并非都有最佳的抑制效果，因此，内生细菌对不同病
原真菌的最佳抑制作用具有一定的选择性．与此同
时，对 ３种植物病原菌抑菌率最大的菌株均来自构
骨根部．
２􀆰 ３　 拮抗菌株代谢液的活性
根据平板对峙试验结果，选择抑菌率＞４０％的内
生菌（共 １０株），进行液体摇床培养，取上清滤液验
证其抑菌活性是否和平板筛选结果一致．
　 　 由表 ４可知，内生菌的代谢液对烟草赤星病菌
抑制率 ＞ ４０％ 的有 ４ 株菌 （ ＧＧ７８、 ＧＧ３３、 ＧＧ４９、
ＧＧ５９），其中 ＧＧ７８ 抑菌率最大（５７．９％），ＧＧ３３ 次
之 （ ４８． ７％）． 与平板对峙法相比， ＧＧ７８、 ＧＧ３３、
ＧＧ４９、ＧＧ５９、ＧＧ６５的抑菌率均有所降低．对棉花枯
萎病菌的抑制率 ＞ ４０％的有 ３ 株 （ ＧＧ６３、 ＧＧ１３、
ＧＧ６２），其中 ＧＧ１３ 的抑菌率最高（６９． ２％），ＧＧ６２
抑菌率次之（４９．２％）．与平板对峙试验相比，ＧＧ６３
的抑菌率有所降低，而 ＧＧ１３ 的抑菌率有所提高，
ＧＧ６２基本不变．对稻瘟病抑菌率 ＞ ５０％有 ２ 株菌
（ＧＧ３１和 ＧＧ３０），抑菌率分别为 ５１．７％和 ５３．４％，与
平板对峙法相比，两株菌的抑菌率均有所提高．因
此，通过比较代谢液抑菌活性和对峙培养结果发现，
代谢液抑菌率高的菌株在对峙培养中也有较高抑菌
活性，如菌株 ＧＧ７８、ＧＧ３３ 对烟草赤星病菌的抑制
作用等，说明这些菌株的抑菌活性物质是分泌到胞
（或菌丝）外发挥作用．但也有部分菌株在对峙平板
试验中抑菌率较高，而代谢液抑菌活性降低的现象，
如 ＧＧ６３ 对棉花枯萎病菌的抑制作用等，说明其对
病原菌的抑制作用可能并非单一机制在发挥作用．
２􀆰 ４　 拮抗菌株的鉴定
２􀆰 ４􀆰 １拮抗菌株的培养特征　 拮抗菌株理化指标和
细胞特征研究结果见表 ５．
２􀆰 ４􀆰 ２ １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因的序列分析 　 对菌株测序结
果进行比对（表 ６），并构建系统进化树（图 １）．结果
发现，整个系统发育树形成 ３个分支，分支Ⅰ包括待
测菌株 ＧＧ３０、ＧＧ３３、ＧＧ７８ 和肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、
Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属的模式株，ＧＧ３０、ＧＧ３３ 和路德维希肠
杆菌 （Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ） ＥＮ⁃１１９Ｔ（ＡＪ８５３８９１）为
最相近菌株，最高同源性分别为 ９８． ６％和 ９９％；
ＧＧ７８ 和 阴 沟 肠 杆 菌 （ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ）
ＡＴＣＣ １３０４７Ｔ（ＡＪ２５１４６９）为最相近菌株，序列同源
６５５１ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
表 ４　 内生菌株代谢液的抑菌活性
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌｉｑｕｉｄ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ
滤液
Ｆｉｌｔｒａｔｅ
烟草赤星病菌 ＡＡ１０３
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ ＡＡ１０３
菌落直径
Ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ
（ｃｍ）
抑制率１）
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ
（％）
棉花枯萎病菌 ＦＯ１０１
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＦＯ１０１
菌落直径
Ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ
（ｃｍ）
抑制率２）
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ
（％）
稻瘟病菌 ＭＧ１０２
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ＭＧ１０２
菌落直径
Ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ
（ｃｍ）
抑制率３）
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ
（％）
ＧＧ７８ ３．２±０．１ ５７．９±０．２ａ ４．５±０．１ ３０．８±０．１ｆ ４．１±０．０ ２９．３±０．２ｆ
ＧＧ３３ ３．９±０．０ ４８．７±０．３ｂ ４．６±０．２ ２９．２±０．１ｇ ４．０±０．２ ３１．０±０．１ｄ
ＧＧ４９ ４．３±０．２ ４３．４±０．６ｃ ４．８±０．１ ２６．２±０．１ｉ ３．６±０．１ ３７．９±０．１ｃ
ＧＧ５９ ４．３±０．１ ４３．４±０．２ｃ ４．３±０．１ ３３．９±０．２ｅ ４．１±０．１ ２９．３±０．２ｅ
ＧＧ３１ ４．７±０．３ ３８．２±０．１ｄ ４．７±０．１ ２７．７±０．０ｈ ２．８±０．１ ５１．７±０．１ｂ
ＧＧ６５ ４．８±０．１ ３６．８±０．３ｅ ４．１±０．１ ３６．９±０．１ｄ ４．５±０．２ ２２．４±０．１ｊ
ＧＧ６３ ４．９±０．１ ３５．５±０．１ｆ ３．６±０．０ ４４．６±０．３ｃ ４．２±０．１ ２７．６±０．２ｈ
ＧＧ３０ ５．２±０．１ ３１．６±０．１ｇ ５．１±０．１ ２１．５±０．２ｊ ２．７±０．０ ５３．４±０．２ａ
ＧＧ１３ ５．３±０．１ ３０．３±０．１ｈ ２．０±０．１ ６９．２±０．０ａ ４．２±０．１ ２７．６±０．１ｇ
ＧＧ６２ ５．３±０．１ ３０．３±０．２ｈ ３．３±０．０ ４９．２±０．０ｂ ４．３±０．１ ２５．９±０．１ｉ
１） 对照菌落直径为（７．６±０．１） ｃｍ Ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｌｏｎｙ ｗａｓ （７．６±０．１） ｃｍ； ２） 对照菌落直径为（６．５±０．１） ｃｍ Ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｌｏｎｙ ｗａｓ
（６．５±０．１） ｃｍ； ３） 对照菌落直径为（５．８±０．１） ｃｍＤｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｌｏｎｙ ｗａｓ （５．８±０．１） ｃｍ．
表 ５　 拮抗菌株的理化特征
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎｓ
项目 Ｉｔｅｍ ＧＧ１３ ＧＧ６３ ＧＧ３１ ＧＧ７８ ＧＧ３０ ＧＧ３３ ＧＧ６５ ＧＧ５９ ＧＧ４９ ＧＧ６２
接触酶
Ｃａｔａｌａｓｅ ｔｅｓｔ
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
Ｖ⁃Ｐ 试验
Ｖ⁃Ｐ ｔｅｓｔ
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋
Ｄ⁃葡萄糖产酸
Ｄ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ａｃｉｄ ｙｉｅｌｄ
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
Ｌ⁃阿拉伯糖产酸
Ｌ⁃Ａｒａｂ ｓｕｇａｒ ａｃｉｄ ｙｉｅｌｄ
－ － ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ ＋
Ｄ⁃甘露醇
Ｄ⁃ｍａｎｎｉｔｏｌ
－ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
木糖
Ｘｙｌｏｓｅ
－ － ＋ － － － ＋ ＋ ＋ ＋
肉汤
Ｂｒｏｔｈ （ｐＨ ５．０）
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
淀粉
Ｓｔａｒｃｈ
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋
苯丙氨酸脱氨酶
Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ
－ － － － － － ＋ － － －
卵黄磷脂酶
Ｌｅｃｉｔｈｉｎａｓｅ
＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － － －
硝酸还原酶
Ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
酪素分解
Ｃａｓｅｉｎ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
柠檬酸盐利用
Ｃｉｔｒａｔｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － ＋
酪氨酸水解
Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － －
形态
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
短杆状
Ｓｈｏｒｔ ｒｏｄ
杆状
Ｒｏｄ
杆状
Ｒｏｄ
短杆状
Ｓｈｏｒｔ ｒｏｄ
球状
Ｓｐｈｅｒｅ
短杆状
Ｓｈｏｒｔ ｒｏｄ
杆状
Ｒｏｄ
杆状
Ｒｏｄ
杆状
Ｒｏｄ
杆状
Ｒｏｄ
菌体大小
Ｓｔｒａｉｎ ｓｉｚｅ （μｍ）
（０．９～１．１）×
（１．４～１．９）
（１．２～１．４）×
（４．４～４．５）
（０．９～１．２）×
（２．５～２．８）
（０．６～１．４）×
（１．３～３．２）
０．２～０．３ （０．６～１．１）×
（１．２～１．５）
（０．１～０．３）×
（１．５～１．９）
（０．７～０．８）×
（１．５～２．４）
（０．８～１．２）×
（０．５～１．８）
（０．４～２．１）×
（１．２～８）
革兰氏染色
Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ
Ｇ＋ Ｇ＋ Ｇ＋ Ｇ＋ Ｇ－ Ｇ－ Ｇ－ Ｇ＋ Ｇ＋ Ｇ＋
芽孢有无
Ｓｐｏｒｅ ｆｏｒｍｉｎｇ
＋ ＋ ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋
７５５１５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 赵龙飞等： 枸骨益生菌的筛选及其抑菌作用　 　 　 　 　 　
表 ６　 测序菌株的同源性分析
Ｔａｂｌｅ ６　 Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
菌株所属属种　 　
Ｇｅｎｕｓ ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ　 　
１６ＳｒＤＮＡ序列登记号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
最相似菌株　 　 　
Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｌｏｓｅｓｔ ｍａｔｃｈ　 　 　
相似率
Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ （％）
ＧＧ７８ 肠杆菌 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ＫＪ８５０２０７ 阴沟肠杆菌 Ｅ． ｃｌｏａｃａｅ ＡＴＣＣ１３０４７Ｔ ９７．１
ＧＧ３３ 肠杆菌 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ＫＪ８５０２０８ 路德维希肠杆菌 Ｅ． ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥＮ⁃１１９Ｔ ９９．０
ＧＧ３０ 肠杆菌 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ＫＪ８５０２０９ 路德维希肠杆菌 Ｅ． ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥＮ⁃１１９Ｔ ９８．６
ＧＧ５９ 假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＫＪ８５０２１０ 恶臭假单胞菌 Ｐｓ． ｐｕｔｉｄａ ＡＴＣＣ１２６３３Ｔ ９９．１
ＧＧ６５ 假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＫＪ８５０２１１ 恶臭假单胞菌 Ｐｓ． ｐｕｔｉｄａ ＡＴＣＣ１２６３３Ｔ ９９．１
ＧＧ４９ 类芽孢杆菌 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ＫＪ８５０２１２ Ｐａ． ｐｏｌｙｍｙｘａ ＩＡＭ １３４１９Ｔ ９９．７
ＧＧ１３ 芽孢杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＫＪ８５０２１３ 蜡样芽孢杆菌 Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１４５７９Ｔ １００
ＧＧ３１ 芽孢杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＫＪ８５０２１４ 苏云金芽孢杆菌 Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ１０７９２Ｔ １００
ＧＧ６３ 芽孢杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＫＪ８５０２１５ 苏云金芽孢杆菌 Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ１０７９２Ｔ １００
ＧＧ６２ 芽孢杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＫＪ８５０２１６ 枯草芽胞杆菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＲＲＬ ＮＲＳ⁃７４４Ｔ １００
图 １　 筛选菌株的 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列的系统发育树
Ｆｉｇ．１　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ．
粗体是待测菌株 Ｓｔｒａｉｎｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｅｒｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｉｎ ｂｏｌｄ．
性为 ９７．１％．结合理化特性和培养特征，ＧＧ３０、ＧＧ３３
初步鉴定为路德维希肠杆菌，ＧＧ７８ 属于阴沟肠杆
菌．分支Ⅱ由待测菌株和假单胞菌模式株构成，菌株
ＧＧ５９、ＧＧ６５的最相近株菌为恶臭假单胞菌（Ｐｓｅｕｄ⁃
ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） ＡＴＣＣ１２６３３Ｔ（ＡＦ０９４７３６），序列同源
性为 ９９．１％．结合理化特征和培养特征，菌株 ＧＧ５９、
８５５１ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
ＧＧ６５ 鉴定为恶臭假单胞菌． ＧＧ４９、 ＧＧ６２、 ＧＧ１３、
ＧＧ６３、ＧＧ３１ 和类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、芽孢杆
菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 模式菌株构成了分支Ⅲ， ＧＧ４９ 和
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ＩＡＭ １３４１９Ｔ（Ｄ１６２７６）形成独
立的小分支，二者序列同源性为 ９９． ７％； ＧＧ６２、
ＧＧ１３、ＧＧ６３、ＧＧ３１ 的最相近模式株分别为枯草芽
胞 杆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ） ＮＲＲＬ ＮＲＳ⁃７４４Ｔ
（ＥＵ１３８５２０）（同源性为 １００％）、蜡样芽孢杆菌（Ｂａ⁃
ｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７９Ｔ （ ＡＦ２９０５４７） （同源性为
１００％）、苏云金芽孢杆菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）
ＡＴＣＣ１０７９２Ｔ（ＡＦ２９０５４５）（同源性为 １００％），结合理
化特征和培养特征，ＧＧ４９ 属于 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙ⁃
ｍｙｘａ，ＧＧ６２属于枯草芽胞杆菌，ＧＧ１３ 属于蜡样芽
孢杆菌，ＧＧ６３、ＧＧ３１属于苏云金芽孢杆菌．
２􀆰 ５　 内生菌对病原真菌的抑菌机制
在系统相差显微镜下观察对照组和处理组间病
原菌菌丝变化，发现处理组（图 ２Ｂ、图 ３Ｂ、图 ４Ｂ）病
原菌菌丝发生波浪状扭曲（图 ２Ｂａ、图 ３Ｂａ、图 ４Ｂｂ）、
菌丝相互缠绕（图 ２Ｂｂ、图 ３Ｂｂ、图 ４Ｂａ）等现象．当烟
草赤星病原菌被处理２４ ｈ后，菌丝局部细胞壁被溶
图 ２　 烟草赤星病菌 ＡＡ１０３受枸骨内生细菌抑制作用的菌丝变化
Ｆｉｇ．２　 Ｍｙｃｅｌｉａ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔｅ ＡＡ１０３ ｕｎｄｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ （１０×２０）．
Ａ： 对照 Ｃｏｎｔｒｏｌ； Ｂ： ＧＧ７８处理 １２ ｈ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＧＧ７８ ｆｏｒ １２ ｈ； Ｃ： ＧＧ７８处理 ２４ ｈ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＧＧ７８ ｆｏｒ ２４ ｈ．
图 ３　 棉花枯萎病原菌 ＦＯ１０１受抑制作用的菌丝变化
Ｆｉｇ．３　 Ｍｙｃｅｌｉａ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＦＯ１０１ ｕｎｄｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ （１０×２０）．
Ａ： 对照 Ｃｏｎｔｒｏｌ； Ｂ： ＧＧ１３处理 ２４ ｈ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＧＧ１３ ｆｏｒ ２４ ｈ； Ｃ： ＧＧ１３处理 ４８ ｈ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＧＧ１３ ｆｏｒ ４８ ｈ．
图 ４　 稻瘟病菌 ＭＧ１０２受抑制作用的菌丝变化
Ｆｉｇ．４　 Ｍｙｃｅｌｉａ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ＭＧ１０２ ｕｎｄｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｌｅｘ ｃｏｒｎｕｔａ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ （１０×２０）．
Ａ： 对照 Ｃｏｎｔｒｏｌ； Ｂ： ＧＧ３０处理 ２４ ｈ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＧＧ３０ ｆｏｒ ２４ ｈ； Ｃ： ＧＧ３０处理 ４８ ｈ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＧＧ３０ ｆｏｒ ４８ ｈ．
９５５１５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 赵龙飞等： 枸骨益生菌的筛选及其抑菌作用　 　 　 　 　 　
解变得透明（图 ２Ｃｄ），有些菌丝局部形成原生质球
（图 ２Ｃｃ）；而棉花枯萎病原菌 ＦＯ１０１ 和稻瘟病菌
ＭＧ１０２被内生菌处理 ４８ ｈ 后，也发生类似的现象：
菌丝局部膨大、形成原生质浓缩球（图 ３Ｃｄ、ｅ），有些
菌丝在靠近膨大附近发生断裂（图 ３Ｃｃ、图 ４Ｃｃ）．稻
瘟病菌 ＭＧ１０２的菌丝末端明显发生萎缩、畸形扭曲
（图 ４Ｃｄ），菌丝基部形成放射状毛细菌丝（图 ４Ｃｅ）．
３　 讨　 　 论
内生菌不仅参与植物次生成分合成或转化，而
且还能独立产生丰富的次生代谢产物［１９］ ．本试验
中，药用植物枸骨内生细菌对棉花枯萎病菌、烟草赤
星病菌和稻瘟病菌都有拮抗作用，前期试验［１６］及本
试验初步表明有几种可能机制发挥作用：１）内生菌
和病原菌在培养过程中，二者竞争养分和生存空间，
内生菌快速生长形成生物膜［２０］，覆盖培养基表面的
营养空间，大量利用培养基养分，导致病原菌因营养
缺乏而生长受阻，出现菌丝萎缩、畸形现象；２）内生
菌产生抗生素类物质［１９］如寡霉素 Ａ、卡那霉素水解
物、双效菌素 Ａ 等对病原菌菌丝发生作用，如菌丝
新生细胞壁合成受到抑制导致菌丝末端萎缩等；３）
在培养过程中内生菌不直接接触病原真菌，菌丝就
发生变形，很可能是内生菌产生了化感物质及胞外
代谢产物，如螯合型铁载体、杀菌性挥发物（ＶＯＳ）、
溶菌酶、解毒酶、水解酶类、生物碱等［１５］ ．这些代谢
产物不断被释放出来，抑菌机制大多为干扰细胞壁
合成、损害细胞膜机能、抑制核酸合成或干扰能量代
谢等方式［１０］，导致病原菌细胞壁变薄，因壁受力不
均出现局部原生质浓缩，而且在浓缩球附近出现菌
丝断裂．易龙等［２１］的研究支持了这个解释，烟草内
生细菌 Ｉｔｂ１６２ 对烟草赤星病原菌菌丝生长有明显
的抑制作用，主要是拮抗菌使病原菌菌丝形成膨胀
泡，破裂、消解，致使菌丝停止生长．蛋白酶和其他生
物控制特性也参与对菌核病以及灰霉病菌生长的抑
制作用［２２］ ．类芽孢杆菌也可产生 β⁃１，３⁃葡聚糖酶，
可酶解枯萎病菌的细胞壁，导致菌丝自溶、断裂［２３］；
也可能是多种机制的结合．但具体抑制机理是进一
步研究的重点．
从枸骨不同组织分离出可培养内生细菌 ８５ 株
中，抑菌率＞４０％的内生细菌分布于 ４ 属 ７ 种，表现
出对植物病原菌具有拮抗性的内生细菌种类的多样
性．不同属内生菌对不同病原真菌的抑制作用并非
都有最佳抑制效果，即对不同病原真菌的最佳抑制
作用具有一定的选择性．本试验筛选的肠杆菌属菌
株 ＧＧ３３和 ＧＧ３０，对 ３ 种病原真菌均有抑制作用，
但对烟草赤星病菌和稻瘟病菌有较强效果，抑制率
分别为 ４８．６％、５３．５％．肠杆菌常被发现在玉米、大
米、大豆、小麦和草类等根际［２４］，成为根际微生物种
类的主要部分．这些菌产生的植物生长调节物，如乙
烯、生长素、细胞分裂素、铁载体等［２５］，促进植物生
长．芽孢杆菌属是最普遍被报道的植物生长促生根
际细菌，能够有效定殖宿主根部，如烟草、西红柿、拟
南芥、大米、谷物、油菜和可可等［２６］，而且可通过产
生一些代谢产物（植物激素、溶磷物质、铁载体等）
分泌到根附近，增加宿主可利用营养．另外，芽孢杆
菌还产生抗菌素、抗菌蛋白、多粘菌素羊毛硫抗生
素、多肽类 ｇａｖａｓｅｒｉｎ 和 ｓａｌｔａｖａｌｉｎ 等生物活性物
质［２７］ ．如宋素琴等［２８］从新疆胀果甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ
ｉｎｆｌａｔａ）中分离一株可产生甘草酸类似物的内生枯
草芽孢杆菌．芽孢杆菌产生的水解酶类（如 β⁃１，３⁃葡
聚糖酶、几丁质酶）对病原真菌表现出较好的抑菌
活性．本试验中，芽孢杆菌属菌株 ＧＧ１３ 处理病原菌
２４ ｈ后菌丝出现扭曲，４８ ｈ 后菌丝出现原生质浓
缩、断裂，说明内生菌产生了一些作用于菌丝胞壁的
物质，使菌丝溶解、变薄、甚至断裂，导致原生质局部
浓缩．已有研究支持了这个推理，芽孢杆菌属产生蛋
白酶降解真菌细胞壁，环脂肽类（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）、ｉｔｕｒｉｎ 和
ｆｅｎｇｙｃｉｎ 在抑制植物病原菌、建立三者间营养关系
中发挥着重要作用［２９］ ．假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）是植
物根际较普遍的微生物类群之一，多数种类具有拮
抗或促生作用，它的生防作用一直是研究的热点．内
生菌已成为筛选新型抗生素和其他生理活性物质的
重要资源．根据“基因传递理论”、“内共生理论”，内
生菌在植物体内经长期协同进化，二者间发生基因
传递或间接遗传转化，导致二者具有相同或相似的
次生代谢产物合成基因，产生与宿主相同或相似的
活性成分［３］ ．孙力军等［３０］从中药金银花（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａ⁃
ｐｏｎｉｃａ）组织中分离得到 １ 株具有抗菌活性的内生
菌，其培养液对多种细菌、霉菌均有明显的抗菌活
性；曾庆桂等［３１］从蛇足石杉（Ｈｕｐｅｒｚｉａ ｓｅｒｒａｔａ）中分
离得到一株拮抗真菌的内生细菌．本试验中，筛选出
假单胞菌属菌株 ＧＧ５９、ＧＧ６５ 对 ３ 种植物病原菌都
产生不同程度的抑制作用，但对烟草赤星的抑制作
用效果更强．假单胞菌能产生有效铁载体、抗生素、
ＨＣＮ、胞外水解酶等抑菌代谢物，有效保护根系免受
病原微生物的侵害，基因组学分析［３２］已证实恶臭假
单胞菌 ＫＴ２４４０ 无毒性，为生物安全特性、环境生物
技术应用提供了遗传基础．本试验筛选出 ＧＧ７８、
０６５１ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
ＧＧ３０、ＧＧ１３等，无论对峙平板培养或是代谢液处理
均表现出较强的抑菌效果，具备生防菌的潜质．但作
为生防菌，目前仅作了拮抗性测定，生物测定和田间
试验正在进一步试验之中．课题组将采取基因组分
析和蛋白组学技术对筛选菌株进行遗传背景和代谢
产物的探索，为研制农业绿色生物杀菌剂、缓解化学
农药残留问题提供理论基础和方法．
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日明）， ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ
ｂａｃｔｅｒｉａ Ｈ⁃６ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ Ｈｕｐｅｒｚｉａ
ｓｅｒｒａｔａ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｈｉｎａ （微生物学通报）， ２００８，
３５（４）： ５１２－５１８ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［３２］　 Ｎｅｌｓｏｎ ＫＥ， Ｗｅｉｎｅｌ Ｃ， Ｐａｕｌｓｅｎ ＩＴ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅ⁃
ｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉ⁃
ｃａｌｌｙ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０． Ｅｎｖｉｒｏｎ⁃
ｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００２， ４： ７９９－８０８
作者简介　 赵龙飞，男，１９７８ 年生，博士，副教授． 主要从事
植物内生菌和豆科植物根瘤菌研究． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｈｎｚｈａｏｌｏｎｇｆｅｉ＠
１６３．ｃｏｍ
责任编辑　 肖　 红
２６５１ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷