全 文 ：ChineseJournalofNewDrugs2009, 18(9)
852　
中国新药杂志 2009年第 18卷第 9期
[作者简介 ] 　袁旭江 ,男 ,助理研究员 ,硕士 ,主要从事中药质量分析
和新药研究 ,联系电话:(020)39352540, E-mail:xjyuan.xj@163.com。
·实验研究·
RP-HPLC法测定竹柏叶中穗花双黄酮含量
袁旭江 1 ,杜红光2
(1广东药学院中药开发研究所 ,广州 510006;2广东食品药品职业学院 ,广州 510520)
　　[摘要 ] 　目的:建立竹柏叶中穗花双黄酮含量测定方法。方法:采用高效液相色谱法 ,色谱条件为:Agi-
lentC18色谱柱(150mm×4.6mm, 5μm);乙腈 -0.05%磷酸水液为流动相 ,梯度洗脱(时间 0 ～ 30min,乙腈
15% ～ 100%);流速为 1.0mL·min-1 ,检测波长为 340nm。结果:穗花双黄酮在 0.013 ～ 0.130μg范围内线
性关系良好(r=0.999 9),平均加样回收率为 96.34%, RSD为 1.4%(n=6)。结论:本法操作简便 ,结果准
确 ,重现性好 ,可用于竹柏叶中穗花双黄酮成分的含量测定 ,并为其开发应用提供基础 。
[关键词 ] 　竹柏;穗花双黄酮;高效液相色谱法
[中图分类号 ] R927.2　　[文献标识码 ] A　　[文章编号 ] 1003-3734(2009)09-0852-03
DeterminationofamentoflavoneinPodocarpusnagilevesbyRP-HPLC
YUANXu-jiang1 , DUHong-guang2
(1 Research＆ DevelopmentInstituteofChineseMateriaMedicaofGuangdongPharmaceuticalUniversity,
Guangzhou510006, China;2 GuangdongFoodandDrugVocationalColege, Guangzhou510520, China)
[ Abstract] 　Objective:ToestablishamethodtodeterminethecontentofamentoflavoneinPodocarpusnagi
leves.Methods:AnHPLCmethodwascariedoutwithanAgilentHypersilODScolumn(150mm×4.6mm, 5
μm).Themobilephaseswereacetonitrile(A)and0.05%phosphoricacidsolution(B), andthegradientelution
wasperformedin0 ～ 30minwithacetonitrilefrom15% to100%.Theflowratewas1.0mL·min-1 andthedetec-
tionwavelengthsetat340nm.Results:Thelinearrangeofamentoflavonewaswithin0.013 ～ 0.130μg.Theaver-
agerecoveryratewas96.34%withRSDof1.4%(n=6).Conclusion:Themethodwassimple, rapid, accurate
andsuitableforthedetectionofamentoflavoneinPodocarpusnagileves.Theresultsprovidedabasisforthedevel-
opmentandapplicationofPodocarpusnagileves.
[ Keywords] 　Podocarpusnagi;amentoflavone;highperformanceliquidchromotography(HPLC)
　　竹柏 Podocarpusnagi(Thun.)ZoletMor,为罗
汉松科(Podocarpaceae)竹柏属常绿乔木 ,别名糖鸡
子 、罗汉柴 、椰树 、山杉 、铁甲树等 ,属裸子植物类。
广泛分布于广东 、浙江 、福建 、广西等地 [ 1] 。竹柏在
我国南方有大量栽培 ,但多作为观赏的庭园 、园林树
种 ,在医药上的研究应用并不多见 。竹柏具有止血 、
接骨 、消肿 、抗肿瘤作用 [ 1-2] ,其主要含黄酮 、萜类 、
挥发油等成分 [ 1, 3] ;但在黄酮类成分方面的研究仍
较为鲜见 ,特别是含量测定方面 ,故作者对竹柏叶中
的黄酮类成分进行了研究 ,建立了穗花双黄酮的高
效液相色谱含量测定方法 ,为竹柏叶中黄酮类成分
的开发应用提供依据和基础。
材　　料
Agilcnt1100型高效液相色谱仪(四元泵 、DAD
阵列检测器 ,美国惠普公司);BS124S电子分析天平
(德国 Sartorius);BP211电子分析天平(德国 Sartori-
us);超声清洗器(北京医疗设备二厂)。
穗花双黄酮对照品由广东省中医研究所提供 ,
面积归一法测纯度为 99.8%;竹柏叶由广东省广州
市中药研究所提供 ,原植物经蔡岳文副主任中药师
鉴定为罗汉松科竹柏 Podocarpusnagi(Thun.)Zol
etMor。乙腈为色谱纯 ,其他试剂均为分析纯 ,水为
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三蒸水。
方法与结果
1　色谱条件
色谱柱为 AgilentHypersilC18柱(150mm×4.6
mm, 5μm);流动相为乙腈 -0.05%磷酸水液 ,梯度洗
脱(时间 0 ～ 30min,乙腈 15% ～ 100%);检测波长
为 340nm;流速为 1.0mL·min-1;柱温为 20℃。理论
塔板数按穗花杉双黄酮计应≥5 000。结果见图 1。
图 1　穗花双黄酮对照品和竹柏供试品
高效液相色谱图
2　对照品溶液的制备
精密称取穗花杉双黄酮对照品 ,加甲醇溶解制
成 0.013mg·mL-1的对照品溶液。
3　供试品溶液的制备
　　分别取药材样品 ,粉碎 ,取 0.33g,精密称定 ,加
50%乙醇 10mL,置具塞量瓶中 ,密塞 ,称定重量 ,超
声处理 40min,取出 ,放冷 ,称定重量 ,补足损失的重
量 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤液作为供试品溶液 。
4　线性范围的考察
分别精密吸取对照品溶液 1, 2, 5, 8, 10 μL进行
色谱测定 ,按上述色谱条件测定峰面积 ,以进样量为
横坐标(X, μg)、峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归 ,
得标准曲线。结果显示 ,进样量在 0.013 ～ 0.130μg
范围呈线性关系 ,回归方程为 y=3 273.1x+1.242 9,
相关系数 r=0.999 9。
5　精密度试验
精密吸取样品溶液 10μL, 按上述色谱条件 ,
重复测定 6次 ,测得峰面积的积分值 ,计算精密
度 ,结果穗花杉双黄酮平均峰面积为 434.3, RSD
为 0.29%。
6　稳定性试验
取同一供试品溶液 10μL按上述色谱条件测定
0, 0.5, 2.5, 5 , 20h,测得峰面积并计算含量 ,穗花杉
双黄酮平均峰面积为 442.8, RSD为 3.1%,结果显
示 20h内稳定。
7　重复性试验
按拟定的含量测定方法 ,对同一批样品制备供试
品溶液 ,平行做 6份 ,测得峰面积并计算含量 ,结果穗
花杉双黄酮平均含量为 0.317mg·g-1 , RSD为 2.9%。
8　回收率试验
精密吸取已知含量(0.316 9mg·g-1)的同一批
样品 0.17g,分别精密加入 1mL的穗花杉双黄酮对
照品溶液(0.050mg·mL-1),按供试品溶液制备项
下操作 ,平行操作 6份 ,按拟定色谱条件测定含量 ,
计算回收率 ,结果见表 1。
表 1　穗花杉双黄酮回收率测定结果 n=6, x±s
序号 样品量/g
样品中穗花杉双
黄酮含量 /mg
加入量
/mg
测得值
/mg
回收率
/%
平均回收率
/%
RSD
/%
1 0.166 9 0.052 89 0.050 0.102 1 98.42
2 0.167 3 0.053 02 0.050 0.101 2 96.36
3 0.167 2 0.052 99 0.050 0.100 5 95.03
4 0.166 8 0.052 86 0.050 0.100 9 96.08 96.34±1.33 1.4
5 0.166 9 0.052 89 0.050 0.101 5 97.22
6 0.166 9 0.052 73 0.050 0.100 2 94.94
9　样品测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10
μL,按上述色谱条件测定峰面积 ,外标法计算各样
品中穗花杉双黄酮的含量 ,结果见表 2。
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表 2　5批竹柏叶中穗花双黄酮含量测得结果
样品
编号
采集时间
和地点
取样量
/g 峰面积
穗花双黄酮
含量 /mg·g-1
竹柏叶 1 2007.08广州 0.335 0 341.4 0.312
竹柏叶 2 2007.09广州 0.335 8 300.9 0.274
竹柏叶 3 2007.09广州 0.333 6 268.3 0.246
竹柏叶 4 2007.10广州 0.333 6 434.5 0.399
竹柏叶 5 2007.10广州 0.337 1 628.4 0.572
讨　　论
竹柏具有止血 、接骨 、消肿作用 ,用于骨折 、外伤
出血 、风湿痹痛等 [ 2] ,还有抗污染 、抗肿瘤作用 ,主
要含挥发油 、萜类成分和黄酮类成分 ,其中竹柏内酯
A和竹柏内酯 B具有极强的细胞毒性作用 [ 1] 。由
于竹柏中黄酮类成分的研究较少 ,故作者对其总黄
酮进行了提取 ,并采用高效液相进行了分离分析 ,结
果表明 ,竹柏叶中黄酮类成分以双黄酮类成分为主 ,
其吸收波长大多均在 280和 340nm处。故选择在
波长 340nm处进行分离分析 ,其中以穗花双黄酮成
分的吸收峰较高 ,可见黄酮类成分中以其含量较高 ,
且有关文献报道[ 4]穗花双黄酮对磷脂酶 C有抑制
作用(磷脂酶 C是磷酸肌醇转换退速酶 ,在一些肿
瘤中磷酸肌醇的转换活性都有所增强),而磷酸肌
醇抑制剂是研究细胞内信息传递和治疗肿瘤的有效
工具。因此 ,本研究选择对穗花双黄酮成分进行了
含量测定 ,为进一步开发总黄酮成分提供研究基础。
含量测定结果表明 , 5批竹柏叶中穗花双黄酮含量
为 0.246 ～ 0.572mg·g-1。
在供试品溶液制备方面 ,还对甲醇 、50%乙醇 、
水进行了比较研究 ,结果表明甲醇能够将竹柏总黄
酮提取出来 ,但叶绿素也同样被充分提取出来 , 50%
乙醇提取同样能将大部分总黄酮提取出来 ,而叶绿
素被提取出来较少;水则难以提取到总黄酮成分;还
对不同浓度 (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,
90%)乙醇进行了提取研究 ,结果表明 ,以 50%乙醇
提取总黄酮类成分较为理想 ,有利于色谱的分析;考
察了提取时间 ,在超声处理 40min时穗花双黄酮加
样回收率达到了 96.34%。故选择以 50%乙醇超声
处理 40min进行了含量测定 。
在测定穗花杉双黄酮含量时 ,参考文献 [ 5]的
方法 ,虽然对照品出峰时间短 ,但样品的分离不好 ,
个别样品在穗花杉双黄酮保留时间处有吸收峰干
扰;采用了文献 [ 6]的方法 ,但由于使用缓冲盐 ,对
色谱柱伤害较大 。因此 ,采用了本实验的方法 ,使样
品能得到较好的分离 。
本方法简便快速 、稳定 、重现性好 ,可用于竹柏
叶的鉴别和含量测定 ,也为其进一步开发应用提供
了一定的基础和依据 。
致谢:感谢广东省中医研究所孙冬梅研究员提供穗花双黄酮
对照品。
[ 　参　考　文　献　]
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