全 文 ：收稿日期:2009-10-09;　修订日期:2010-03-09
基金项目:国家科技支撑计划项目(No.2006BAI06A01-1)
作者简介:曾宪仪(1955-),男(汉族),江西南昌人 ,现任江西省药物研究
所高级实验师 ,主要从事天然药物化学工作.
毛冬青酸性 、酚性及皂苷类成分分离鉴定
曾宪仪 1 ,李玉云1 ,徐晓艳 1 ,李后如2 ,吴　迪 1 ,李　艳 1 ,王丽静 1
(1.江西省药物研究所 ,江西 南昌　330029;　2.江西银涛药业有限公司 ,江西 抚州　344100)
摘要:目的 分离 、鉴定毛冬青(Ilexpubescens)中的酸性 、酚性 、皂苷类化学成分。方法 采用水提 、醇沉 、醋酸乙酯萃取
或乙醇提取 , 硅胶柱色谱方法进行分离 ,得到 11个化学成分 ,运用 IR、UV、MS、1H-NMR和 13C-NMR等光谱法鉴定化合
物结构。结果 分离鉴定了 11个化合物:3, 4-二羟基苯甲醛 (1);decumbicacid(2);富马酸(3);3, 4-二咖啡酰鸡纳酸
(4);琥珀酸(5);ilexgeninA(6), 毛冬青皂苷 B1(7);毛冬青皂苷 B2(8);毛冬青皂苷甲(9);毛冬青酸(10)和 β -谷甾醇(11)。结论 化合物 2 ～ 5是首次从该植物中分得 ,其中化合物 2为首次从高等植物中获得 ,化合物 10是首次从天然产
物中获得 , 根据 DEPT碳谱 , 首次对其碳信号进行了归属。
关键词:毛冬青;　有机酸;　酚性化合物;　皂苷
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.08.071
中图分类号:R284　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)08-2002-02
ChemicalConstituentsofIlexpubescens
ZENGXian-yi1 , LIYu-yun1 , XUXiao-yan1 , LIHuo-ru2 , WUDi1 , LIYan1 , WANGLi-jing1
(1.JiangxiInstituteofMateriaMedica, Nanchang330029 , China;2.JiangxiYintaoPharmaceuticalCo.
Ltd., Fuzhou344100, China)
Abstract:ObjectiveToisolateacidity, phenolic、tritepenesaponinsfromtherootsofIlexpubescensandtoidentifytheirstruc-
tures.MethodsThecompoundswereisolatedbysolventextractandsilicagelchromatographyandtheirstructuresweredeter-
minedbyIR, UV, MS, 1HNMR, 13CNMRetc..ResultsElevencompoundswereisolatedfromIlexpubescens.Theywereidenti-
fiedasprotocatechuicaldehyde(1), decumbicacid(2), fumanricacid(3), 3, 4-dicaffeoyl-quinicacid(4), succinicacid(5),
ilexgeninA(6), ilexsaponinB1(7), ilexsaponinB2(8), ilexsaponinA1(9), ilexolicacid(10)andβ -sitostrol(11).Conclusion-Compounds(2 ～ 5)wasobtainedfromtheplantforthefirsttime, inwhich(2)wasfirstisolatedfromhigherplant, and(10)was
obtainedfromthenaturalproductforthefirsttimeandits13CNMRsignalwasassignedbyDEPT.
Keywords:Ilexpubescens;　Organicacids;　Phenolic;　Tritepenesaponins
　　毛冬青为冬青科植物毛冬青 IlexpubescensHook.etArn.的干
燥根 , 分布于我国南方各省 , 它具有活血通脉 、 消肿止痛 、 清热
解毒功效 , 在临床上主要用于治疗脉管炎和冠心病等 ,有较好疗
效 , 我们在对其有效成分进行研究时 , 从根的水提 、 醇沉 、醋酸
乙酯提取部位 , 分离到 3个酸性成分 、 2个酚性成分 ,从根的乙醇
提取部位分离到 6个皂苷类成分。根据其理化性质并综合运用
光谱技术分别鉴定为:3, 4 -二羟基苯甲醛(1);decumbicacid
(2);富马酸(3);3, 4-二咖啡酰鸡纳酸(4);琥珀酸(5);ilexge-
ninA(6),毛冬青皂苷 B1(7);毛冬青皂苷 B2(8);毛冬青皂苷甲(9), 毛冬青酸(10)和 β -谷甾醇(11)。化合物(2)～ (5)是首
次从该植物中分得 , 其中化合物(2)最早是从青霉菌 Penicilum
decumbea的代谢物中得到 , 此后又从肉桂枝枯病菌 Lasiodiplodia
theobromae的代谢物中获得 [ 1] , 本文是首次从高等植物中获得 ,
化合物(10)是首次从天然产物中获得 , 结合 DEPT碳谱 , 首次对
其碳信号进行了归属 。
1　仪器与材料
熔点用 Yanaco显微熔点仪测定;IR用 Shimadau-400或
SpectrumOne红外光谱仪测定;UV用 PElambda12紫外光谱仪
测定;MS用 VGZAB-2F质谱仪测定;HRMS用 Autospec-Ul-
timaETOF质谱仪测定;1H-NMR和 13C-NMR用 INOVA-500、
buruck-400、vns-600核磁共振仪测定。薄层色谱和柱色谱硅
胶(160 ～ 200目)为青岛海洋化工厂产品。溶剂均为分析纯。实
验药材采于江西大茅山 ,由江西省药物研究所朱良辉副研究员鉴
定为毛冬青(IlexpubescensHook.etArn.)。
2　方法
2.1　酚酸成分的提取分离 取毛冬青根粉碎(25kg),加水煎煮 3
次 , 每次 2 h, 合并煎液 , 浓缩 , 加入乙醇使含醇量达到 70%, 静
置 , 滤过 ,滤液减压回收乙醇至无醇味 ,用 10%HCl调 pH至 3.0,
静置 , 离心。上清液用醋酸乙酯萃取 , 合并醋酸乙酯液 , 回收溶
剂 , 残留物用热水提取 5次 ,合并水提取液 , 冷藏一夜 , 滤过 ,滤液
再用醋酸乙酯萃取 5次 , 合并萃取液 ,回收溶剂 ,得固体物。取固
体物上聚酰胺柱层析 , 依次用水 、30%, 50%乙醇洗脱 , 蒸干。 水
洗部分经硅胶柱层析得成分(2), (3), (5);30%洗脱部分经硅胶
柱层析和苯重结晶得成分(1), 50%洗脱部分经硅胶柱多次层析
得成分(4)。
2.2　皂苷的提取分离 取毛冬青细枝 、叶 , 0.6 kg, 加水煎煮 , 浓
缩 , 乙醇沉淀 ,滤过 , 滤液挥去溶剂 , 残留物加少量水稀释 ,用盐酸
调 pH至 3, 用醋酸乙酯萃取 , 醋酸乙酯萃取部分回收溶剂后经硅
胶柱层析 ,依次用石油醚∶醋酸乙酯∶甲酸(6∶4∶0.01)、(2∶
8∶0.01)和醋酸乙酯洗脱 , 后者得化合物(9)。取毛冬青根 7
kg,粉碎 , 同上处理 ,得醋酸乙酯萃取部分 ,回收溶剂后经硅胶柱
层析 , 石油醚:醋酸乙酯(7∶3)和(1∶1)洗脱 , 前者得(10)粗品 ,
乙醇重结晶得化合物成分(10), 后者得成分(6)粗品 , 乙醇重结
晶得化合物(6)。取毛冬青根 4.2 kg, 粉碎 , 加 80%乙醇回流提
取 , 合并提取液 ,回收溶剂 , 残留物离心 , 取沉淀物进行硅胶柱层
析 , 依次用石油醚 :醋酸乙酯(8∶2)、(1∶1)和乙醇洗脱 , (8∶
2)洗脱部分得化合物(11)、(1∶1)洗脱部分得(6)粗品 , 乙醇重
结晶得纯品 ,乙醇洗脱部分回收溶剂后 , 经反复柱层析 ,以醋酸乙
酯:甲醇(95∶5)～ (80∶20)洗脱 ,得化合物(7)、(8)。
3　结构鉴定
3.1　化合物 1 浅黄色片状或针状结晶 , mp155 ～ 156℃(毛细管
·2002·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.8
封闭法), 三氯化铁和 2, 4 -二硝基苯肼反应阳性。 IRνKBrmax
(cm-1):3210(缔合羟基 、宽峰), 1650(羰基), 1 590、1 535、1 440
(苯环)及 870、810、750(苯环芳氢)。 UVλMeOHmax nm:205, 231, 280
, 312。 MS:m/z138(M+), 137(M-1), 109(M-29), 91, 81, 63,
53。1H-NMR(500MHz, CD3OD)δ:6.85(1H, d, J=8Hz), 7.24
(2H, m), 9.63(1H, s)。13C-NMR(CD3OD, 125MHz)δ:115.30,
116.22, 126.43, 130.84, 147.21, 153.74(苯环), 193.07(醛基)。
根据以上理化性质及光谱数据并与 SADTLER标准光谱比较 ,鉴
定为 3, 4-二羟基苯甲醛 ,即原儿茶醛。
3.2　化合物 2 白色结晶 , mp136 ～ 137℃;在薄层板上显有机酸
反应;IRνKBrmax(cm-1):3 500 ～ 2 300 (宽峰 , 缔合 -OH), 1 700(>C=O), 1 650(>C=C<)1 460, 1 410, 1 372, 1 330, 1 190, 1 140,
1 125, 1 038, 1 010, 940, 875, 750, 700。 UVλMeOHmax nm:220。MSm/
z:184(M+), 166(M-18), 155(M-29), 142(M-42), 124, 113,
96, 71, 67, 55。 HRMSm/z:184.073 200 (计算值 184.073559),得
分子式C9H12O4 ,不饱和度为 4。根据 1H-1HCOSY、HMQC,对相
关信号进行了归属 , 1H-NMR(500MHz, CD3OD)δ5.095(1H,br, d, H-4), 1.522(1H, m, H-5), 2.033(1H, m, H-5), 1.361
(2H, m, H-6), 0.902 (3H, t, J=7.5Hz, H-7)、 2.080(3H, s, H
-8);13C-NMR(125MHz, CD
3
OD)δC175.17(C1)137.36(C2),
150.69(C3), 82.99(C4), 35.75(C5), 19.15 (C6), 14.10(C7),
10.66(C8), 164.79(C9)。以上理化性质及光谱数据与文献 [ 1]
中 decumbicacid一致 , 故鉴定为 decumbicacid。
3.3　化合物 3 白色结晶 , 200℃以上升华。 在薄层板上显有机
酸反应。 IRνKBrmax(cm-1):3 080(宽峰 , 缔合 -OH), 1 680 (-
COOH)。 UVλMeOHmax nm:211 。 MSm/z:116(M+), 98(M-18), 88
(M-28), 81, 72, 53。1H-NMR(500MHz, CD3OD)δ6.697。 13CNMR(125MHz, CD3OD)δ135.185, 168.036。根据以上理化性质
及光谱数据并与 SADTLER标准光谱比较 , 鉴定为富马酸 , 即反
式丁烯二酸。
3.4　化合物 4 浅黄色颗粒 , IRνKBrmax(cm-1):3 360(OH), 1 700(-COOH), 1 595, 1 520(Ar), 1 442, 1 350, 1 270, 1 150, 1 030,
970。 UVλMeOHmax nm:210, 235, 245, 300, 328。 MSm/z:539[ M +
Na] +, 517[ M+1] , 499。1H-NMR(500MHz, CD3OD)δ:6.14、6.
24(2×1H, d, J=16.0, C8′-H), 6.68, 6.69(2 ×1H, d, J=8.0,C5′-H), 6.85, 6.86(2 ×1H, dd, J=8.0, J=2.0, C6′-H), 6.
94, 6.96(2×1H, d, J=2.0, C2′-H), 7.47, 7.55(2×1H, d, J=
16.0, C7′-H), 2.04(1H, dd, J=14.0, 4.0, C6 -H), 2.16 ～ 2.20(2H, m, C
2
-H), 2.25(1H, dd, J=14.0, 4.0, C
6
-H), 4.31
(1H, , dd, J=8.5, 3.0, C5 -H), 5.06(1H, dd, J=8.5, 3.0, C4 -
H), 5.55(1H, m, C3 -H)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz), 鸡纳
酸部分 δ:C1 75.95, C2(39.24或 38.37), C3(68.97), C4(69.
22), C5(75.60), C6(39.24), 176.73为 C1上的 -COOH, 咖啡
酸部分:C1′(123.16), C2′(114.65), C3′(149.70), C4′(146.
78), C5′(115.12), C6′(127.63), C7′(147.73或 147.61), C8′(114.70或 116.46), C9′(168.55 或 168.20)。以上数据与文献[ 2] 中 3, 4 -二咖啡酰鸡纳酸一致 , 故鉴定为 3, 4-二咖啡酰鸡
纳酸。
3.5　化合物 5 白色结晶 , mp191 ～ 193℃;在薄层板上显有机酸
反应;IRνKBrmax(cm-1):3 600 ～ 2 300(宽峰 , 缔合 -OH), 1 680(>C=O), 1 410, 1 300, 1 195。根据以上理化性质及红外光谱数据 ,
并与 SADTLER标准光谱比较 ,鉴定为丁二酸 ,即琥珀酸。
3.6　化合物 6 无定形粉末 , mp>300℃;可溶于甲醇 、乙醇。
IRνKBrmax(cm-1):3 450(-OH), 2 931, 1 690(>C=O), 1 647, (>
C=C<), 1 455, 1 384, 1 252, 1 157, 1 044, 769。 UVλMeOHmax nm:
205。 FABMSm/z:525(M+Na)+, 483(M-H-H2O), 438(M-
HCOOH-H2O)。1H-NMR(400 MHz, C5D5N)δ:1.13(3H, s,Me), 1.16(3H, s.Me), 1.46(3H, s.Me), 1.71 (3H, s.Me), 1.76
(3H, s.Me), 1.11(3H, d, J=6.4, Me), 3.06(1H, s, H-18), 3.35
(1H, dd, J=11.6, 4.3, H-3), 5.11(1H, br, s, 19-OH,重水交换
消失), 5.62(br, t, H-12)。13C-NMR(100MHz, C5D5N)见表 1。
以上数据及理化性质与文献 [ 3]中 ilexgeninA一致 ,故鉴定为 il-
exgeninA。
3.7　化合物 7 无色细小针晶 , mp243 ～ 244℃;可溶于甲醇 、乙
醇。 IRνKBrmax(cm-1):3 436(-OH), 2 928, 1 697(>C=O),
1 637, (>C=C<), 1 456, 1 370, 1 167, 1 071, 1 041, 762。
FABMSm/z:789(M +Na)+, 455, 437。1H-NMR(400MHz,
C5D5N)δ:0.88(3H, s, Me), 1.08(3H, s.Me), 1.09(3H, s.Me),
1.12(3H, d, J=7, Me), 1.25(3H, s, Me), 1.42(3H, s, Me), 1.74
(3H, s.Me), 3.28(s, H-18), 4.81(1H, d, J=7, Xyl-H-1),
5.05(s, 19α-OH,重水交换消失), 5.35(1H, d, J=7.5, Glu-H
-1), 5.54(1H, t, H-12)。 13C-NMR(100MHz, C
5
D
5
N)见表 1。
以上数据及理化性质与文献 [ 3]中 ilexsaponinB1一致 , 故鉴定为
毛冬青皂苷 B1(ilexsaponinB1)。
3.8　化合物 8 白色无定形粉末 , 可溶于甲醇 、乙醇。 IRν
KBrmax(cm-1):3 436(-OH), 2 927, 1 697(>C=O), 1 637, (>C=C<), 1 456, 1 387, 1 075, 1 041, 985, 813, 763。FABMSm/z:935
(M+Na)+;1H-NMR(400MHz, C5D5N)δ:0.83(3H, s, Me),
1.06(3H, s.Me), 1.32(3H, s.Me), 1.41(3H, s, Me), 1.74(3H, s,
Me), 1.11(3H, d, J=7.2, Me), 1.77(3H, d, J=6.4, rha-Me),
3.3(1H, s, H-18), 4.89(1H, d, J=5.4, Xyl-H-1), 5.04
(1H, s, 19α-OH, ), 5.53 (1H, br, t, H-12), 5.80(1H, d, J=
7.6, Glu-H-1), 6.40(1H, br, s, rha-1 -H)。13C-NMR
(100MHz, C5D5N, )见表 1。以上数据及理化性质与文献 [ 3]中ilexsaponinB2一致 , 故鉴定为毛冬青皂苷 B2(ilexsaponinB2)。
3.9　化合物 9 白色无定形粉末 , mp290 ～ 291℃;可溶于甲醇 、乙
醇。 Liebermann-burcharde试验和 α-萘酚试验均呈阳性 ,
IRνKBrmax(cm-1):3 400(-OH), 2 925, 1 720(>C=O), 1 630, (>C=C<), 1 443, 1 380, 1 060, 1 020, 985, 790, 755。 FABMSm/z:
687(M+Na)+。酸水解检查出葡萄糖 ,苷元部分 TLC与化合物 6
薄层色谱行为一致 , 根据以上数据及理化性质并与文献 [ 3]比
较 , 鉴定为毛冬青皂苷甲(ilexsaponinA
1
)。
3.10　化合物 10 白色细针状结晶 , mp281 ～ 283℃;可溶于甲醇 、
乙醇 、氯仿等。 Liebermann- burcharde试验呈阳性 , IRνKBrmax(cm-1):3443(-OH), 2 933, 1 692(>C=O), 1 649, (>C=C
<), 1452, 1372 1278, 1 035, 999。 UVλMeOHmax nm 234(ε7431)。EIMSm/z:454(M+), 436(M-H
2
O), 408(M-HCOOH), 390
(95)(M -HCOOH, -H
2
O), 375, 347, 246, 231, 207, 201, 189,
187, 185(100), 145, 119, 55。1H-NMR(600MHz, CDCl3)δ:0.79(3H, s, Me), 0.90(3H, s.Me), 0.97(3H, s.Me), 0.99(6H, s, 2×
Me), 1.04(3H, d, J=6.6, Me-CH), 1.73(3H, s, Me-C=),
3.23(1H, dd, J=10.8, 4.8, C3 -H), 5.41(1H, 宽 s, C12 -H)。以
上数据与文献 [ 4]中毛冬青苷甲的苷元数据基本一致 , 又根据
DEPT碳谱数据 ,以乌索酸及其甲酯为基本母核对其碳信号进行
归属 , 13C-NMR(600MHz, CDCl3)数据见表 1。根据以上数据 ,
鉴定(10)为毛冬青酸(ilexolicacid), 即(18 -去氢 -20-表 -乌
索酸)。经查文献 , 本品为首次从天然产物中获得 , 为了检测其
在天然产物中的存在 ,取毛冬青根 , 加水煎煮 ,浓缩 , 乙醇沉淀 , 滤
过 , 滤液挥去溶剂 , 残留物加少量水稀释 , 用醋酸乙酯萃取 ,回收
溶剂后 ,残留物以甲醇溶解 , 0.45 μm微孔滤膜滤过 , 滤液作为供
试品溶液 ,另取结晶 10用甲醇制成每 1 ml含约 0.1 mg的溶液 ,
作为对照品溶液 , 以乙腈∶甲醇∶水∶乙酸铵(70∶16∶ 14∶
0.5)为流动相 , 以高效液相色谱法检测 , 检测波长 234 nm, 结果
在供试品色谱中在与对照品相同的保留时间处检测到色谱峰。
3.11　化合物 11 无色针晶 , mp139 ～ 141 ℃;ESI/Ms测得 M+
Na峰 437和 M-H峰 413, 与已知品 β -谷甾醇共薄层色谱 , Rf
值和色斑一致 , IR与 Theacdrichlibraryinfraredspectra中 β -谷
·2003·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.8 时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期
甾醇一致 , 故鉴定为 β -谷甾醇。
表 1　化合物 6 ～ 8、10的 13C-NMR数据
碳位 (6) (7) (8) (10) 碳位 (6) (7) (8) (10)
1 39.5 38.8 38.5 39.06 25 13.7 16.1 15.9 16.09
2 29.1 27.1 26.9 28.25 26 16.9 17.3 17.0 17.70
3 78.1 88.8 89.3 79.00 27 24.5 24.4 24.2 21.90
4 49.1 39.6 39.5 38.79 28 180.4 180.7 180.4 179.40
5 56.7 55.9 55.8 55.42 29 26.9 29.8 29.6 20.25
6 20.7 18.6 18.4 18.26 30 16.5 16.7 16.6 18.43
7 33.7 33.5 33.3 34.34 3-O-Xyl-1＊＊ 105.7 105.5
8 40.0 40.2 40.0 38.90 2 83.3 79.1
9 47.0 47.7 47.5 47.78 3 78.0 77.5
10 37.7 37.0 36.8 36.92 4 71.6 71.0
11 24.0＊ 24.9 24.7 23.31 5 66.7 66.4
12 127.9 127.2 127.0 127.52 Glc-1 106.1 102.2
13 139.7 139.5 139.3 139.15 2 77.1 79.2
14 42.2 42.1 41.9 44.45 3 78.3 78.8
15 28.9 29.2 29.0 28.83 4 71.0 72.1
16 26.2 26.7 26.4 27.28 5 77.9 78.3
17 48.1 47.9 47.7 50.47 6 62.6 63.0
18 54.5 47.4 47.2 138.54 Rha-1 101.5
19 72.5 73.4 73.2 132.91 2 72.5
20 42.0 43.0 42.8 37.25 3 72.5
21 26.7 24.0 23.7 34.38 4 74.1
22 38.2 32.4 32.2 35.09 5 69.4
23 24.3 28.1 28.2 28.17 6 18.8
24 180.6 15.6 15.2 15.69
　　＊DEPT提示该峰为 CH2 , ＊＊(7)=3-o-Xyl2-Glc, (8)=3-o-Xyl2 -Glc2-Rha
　　致谢:本文工作得到中国医学科学院
药物研究所于德泉教授热情帮助 ,在此
表示衷心感谢!
参考文献:
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收稿日期:2009-09-22;　修订日期:2010-01-04
基金项目:生物资源保护与利用湖北省重点实验室科研项目
(No.2007017);
国家民委科研资助项目(No.08HB06)
作者简介:罗洪斌(1968-),男(土家族), 湖北利川人, 现为华中科技大学
同济医学院在读博士研究生 ,硕士学位 ,主要从事分子生物学研究工作.
五鹤续断 18SrRNA基因序列的分析
罗洪斌1 ,张　健 2 ,胡泽华 1 ,丁　莉3
(1.湖北民族学院·医学院 ,湖北 恩施 　445000;　2.湖北省利川市人民医院　445400;
3.湖北民族学院生物科学与技术学院 ,湖北 恩施 　445000)
摘要:目的 研究中药五鹤续断叶 18SrRNA基因的序列特征 ,为五鹤续断分子鉴定提供分子依据。方法 采用 PCR直接
测序技术测定五鹤续断的 18SrRNA基因核苷酸序列 , 并分析其序列组成。结果 通过对五鹤续断 DipsacusasperoidesC.
Y.chengetT.M.Ai叶的 18SrRNA基因序列进行测序 ,获得了五鹤续断 18SrRNA基因序列特征。结论 DNA测序技术
可作为五鹤续断基原鉴定准确而有效的分子鉴定方法 ,也可为五鹤续断分子鉴定提供基础性资料。
关键词:分子鉴定;　五鹤续断;　18SrRNA基因;　序列分析
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.08.072
中图分类号:R282.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)08-2004-02
　　五鹤续断 DipsacusasperoidesC.Y.chengetT.M.Ai为产于湖
北省恩施自治州鹤峰县和宜昌市五峰县中药 , 属川续断科植物 ,
多年生草本 , 药用部位为其干燥根 [ 1] , 常生长在海拔 1 200 ～
2 500 m的高寒地区 , 具有耐严寒 、喜湿润等特征 , 无病虫害等特
点 , 是上等的中药原料。 五鹤续断经过加工后具有根条粗 , 无头
尾 , 质柔软 ,墨绿色(俗称乌梅色)菊花心 , 气味微苦 , 微甜而涩的
品质特色。尤其是 “乌梅花心 ”的特征享誉国内外 [ 2] , 为恩施州
道地药材。其有效成分主要有皂苷 、挥发油类 、生物碱类和维生
素 E等 , 它具有补肝益肾 ,续接筋骨 , 止血安胎等功效 ,临床上主
要用于治疗跌打损伤 、骨折 [ 3] 、腰椎骨质增生 、先兆性和习惯性
流产 [ 4]等症。
传统上五鹤续断鉴定方法主要是通过其形态和活性成分来
进行鉴定 , 在分子水平上仅见张文蘅等 [ 5]对川续断目(广义)下
双参属的两个种在内的 21种植物和外类群用叶绿体 DNAtrnL-
F序列进行分析 ,探讨双参属的系统位置 ,在国内外尚未见用 18S
rRNA基因测序方法对五鹤续断基源进行分类鉴定的研究报道。
同时 , 从分子生物学水平研究中药植物基源的基因 ,寻找有效成
分的功能基因 ,对中药现代化研究也具有重要意义。目前 , 已广
泛运用 18SrRNA基因测序技术进行人参 、三七 、山药 、姜黄 、大黄
等药材的基源鉴定 [ 6 ～ 11] 。本研究是通过 PCR直接测序的方法对
产于湖北省鹤峰县的五鹤续断核基因组 18SrRNA基因序列特点
进行分析 , 为探讨五鹤续断的系统发育关系和分子鉴定提供分子
依据和基础性资料。
1　材料与仪器
1.1　材料 五鹤续断叶片均采自湖北省恩施土家族苗族自治州
鹤峰县走马镇万寺坪道地药材五鹤续断 GAP研究及种植基地 ,
经湖北民族学院医学院中药教研室袁成玉副教授鉴定 ,用干燥剂
将叶片干燥后置于 -80℃冰箱备用 。
1.2　试剂 TaqDNA聚合酶 、dNTPs等 , 购自大连宝生物有限公
司;十六烷基三甲基溴化锭(CTAB)为 Geneview分装 , 购自北京
鼎国生物技术有限责任公司;引物由大连宝生物有限公司合成。
1.3　仪器 梯度 PCR仪购自德国 Eppendorf公司:电泳仪购自北
京六一仪器厂;BeckmanD/U530紫外分光光度计购自美国 Beck-
·2004·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.8