全 文 ：石生黄堇和毛黄堇的核糖体 DNA ITS序列分析
易思荣，韩 凤，黄 娅，李 娟，曹厚强，全 健
（重庆市药物种植研究所，重庆市中药良种选育与评价工程技术中心，重庆 408435）
摘 要：核糖体 DNA 的内转录间隔区 ITS序列包含被 5.8S rDNA所分隔的 ITS1和 ITS2两个片段，在被子植物中，ITS序列的长
度稳定且序列变异较快，可以提供丰富的信息位点，是被子植物鉴定中的重要分子标记。通过毛黄堇和石生黄堇的 rDNA ITS序
列测试对两个物种进行了鉴别，并对核 rDNA ITS序列在药用植物种质资源鉴定中的应用进行了简要介绍。
关键词：ITS序列；药用植物；鉴定
中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2011）23-0010-03
ITS Sequence Analysis of Ribosomal DNA in Corydalis Tomentella
and C. Saxicola
YI Si-rong, HAN Feng, HUANG Ya, LI Juan, CAO Hou-qiang, QUAN Jian
(Chongqing Research Institute of Medicine Plantation, Chongqing Engineering Research Center for
Fine Variety Breeding and Evaluation of Chinese Materia Medica, Chongqing 408435, PRC)
Abstract: The internal transcribed spacer (ITS) sequence of ribosomal DNA (rDNA) includes two sections ITS1 and
ITS2 which were divided by 5.8S rDNA. In angiosperm, the ITS sequence has stable length and quick variation, which
can provide abundant informative sites. Therefore the ITS sequence is an important molecular mark for identification of
angiosperm. By respectively testing ITS sequence of rDNA of Corydalis tomentella and C. saxicola, these two species
were identified. In the end, the application of ITS sequence of rDNA in identification of medicinal plants germplasm
resources were briefly introduced.
Key words: ITS sequence; medicinal plant; identification
分子生物学技术的迅速发展，使以形态组织
学、解剖学等客观指标为划分依据的传统分类学
得到了补充，为药用植物系统与进化研究提供了
丰富而翔实的资料，为解决分类学、系统发育、物
种形成与进化等方面的难题提供了极为有力的技
术途径[1-2]。目前，越来越多的研究者将 ITS技术应
用于药用植物的鉴别，为揭示药用植物的遗传差异
和鉴定中药材品种的道地性提供了新的方法和手
段[3]。我国中草药有 1.2万余种，其中药用植物约占
85%，对它们进行明确地鉴别具有重要意义。我国
药用植物种类繁多，药材来源复杂，使用上互混互
代、以假充真等现象极为常见，严重影响了用药的
安全性和有效性。应用形态学、组织学和化学成分
等方法来鉴定比较困难，通过 ITS区序列比较，可
以很容易地鉴别其真伪[4]。
随着 DNA测序技术的快速发展，rDNA ITS序
列分析已经应用到中药的基原鉴定、道地性研究等
多个领域，在生药鉴别方面也已进行了许多开拓性
的研究[5]。由于道地药材和非道地药材物种来源相
似，在形态、药性、化学成分等特征上具有高度的一
致性，对道地药材的鉴定很困难[6]。利用 rDNA ITS
区分析技术对这些药材进行遗传分子标记研究，找
出其遗传基础，阐明其道地性的规律，建立完善的
道地性评价的遗传学、分子生物学和天然药物化学
指标体系具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材 料
供试材料为石生黄堇（Corydalis saxicola）和毛
黄堇（Corydalis tomentella），凭证标本均存放于中国
科学院昆明植物研究所标本馆（KUN），材料来源、
凭证标本号、基因库号见表 1和表 2。
1.2 方 法
1.2.1 总 DNA的提取 取硅胶干燥的石生黄堇和
毛黄堇两种叶片材料样品各 2份，每份 0.1 g左右，
采用改良 CTAB法[7]提取总 DNA。
收稿日期：2011-07-30
基金项目：科技部“十一五”支撑计划项目（2006BAC01A1
6）；重庆市科技攻关计划项目（CSTC，2011AC5182）；重庆市中医药
科技计划项目（20090116，201002166）
作者简介：易思荣（1972－），男，四川达州市人，副研究员，主
要从事药用植物资源和栽培等方面的研究工作。
湖南农业科学 2011，（23）：10~12 Hunan Agricultural Sciences
DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2011.23.029
基因库号
Corydalis_trnH
Corydalis_trnH
Corydalis_ITS
Corydalis_ITS
表 2 rDNA ITS序列基因库号
Corydalis tomentella.
Corydalis saxicola.
Corydalis tomentella.
Corydalis saxicola.
seq
seq
seq
seq
HQ735402
HQ735403
HQ735404
HQ735405
表 1 试验材料来源及凭证标本号
序号
Ⅰ
Ⅱ
标本号
YISIRONG100623017
YISIRONG100706004
采集地
南川区三泉镇千佛岩
南川区三泉镇老龙洞
经纬度
N 29°07′42″，E 107°12′29″
N 29°08′19″，E 107°12′58″
海拔（m）
630
670
1.2.2 ITS区的扩增 聚合酶链式反应（PCR）在
PERKIN ELMER 9700 型 PCR仪上进行，用White
等 [8]描述的引物（ITS5，5′-GGAAGTAAAAGTAA－
CAAGG -3′；ITS4，5′ -TCCTTCCGCTTATTGATAT－
GC-3′）进行 ITS区的扩增。PCR程序为：97℃预变
性 4 min；94℃变性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延
伸 1 min，30个循环；72℃延伸 7 min。
扩增反应采用 25 μL的反应体系：10× buffer，
0.2 U 的 Taq 聚合酶，2.5 mmol 的 MgCl2，250 μmol
的 dNTPs，正反向引物浓度各为 0.2 μmol，以及约
50 ng的模板 DNA。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检
测合格后，用美国华舜公司的纯化试剂盒纯化以备
测序反应之用。
1.2.3 rDNA- ITS区序列的测序 扩增引物同时
作为测序引物，利用正反向引物分别对两条链测
序，反应依据双脱氧链终止法终端荧光标记，进行
DNA序列的测定。测序反应在 PE9600或 PE9700
PCR仪上进行，采用 5 μL的反应体系：1 μL的测
序 mix，0.5 μL的测序引物，1 μL的 PCR纯化产物
和 2.5 μL 的双蒸水。反应程序为：95℃预变性 4
min；96℃变性 10 s、50℃退火 5 s、60℃延伸 4 min，
共 33个循环。反应产物经 95%乙醇＋乙酸钠沉淀，
之后用 70%乙醇、无水乙醇洗涤，干燥后加入 20
μL的双蒸水充分溶解，经 95℃变性 4 min后上样，
在 ABI3700型自动测序仪上进行检测。为保证所测
序列的准确性，分别对每一种类型的 ITS序列的
正、反链进行测序并校准[9-10]。
2 结果与分析
试验获得石生黄堇和毛黄堇各 2份样品的 ITS
DNA 片段共 4 条序列的数据，并对这些序列在
DNAstar软件上进行了比对分析。来自同种的两份
样品有完全一致的 ITS序列，两种的 ITS序列之间
有 4.3%（共 24个位点）的差异。该差异处于陈月琴
等[11]提出的 ITS序列在被子植物中的 1.2%～10.2%
变异范围。
应用 ITS通用引物 ITS1/ITS4 对毛黄堇和石生
黄堇进行 PCR 扩增，毛黄堇和石生黄堇序列结果
如图 1所示。序列长度分别为: 561 bp和 552 bp。
毛黄堇 5.8S rDNA147 bp，ITS1spacer173 bp ，ITS2
spacer231 bp；石生黄堇 5.8S rDNA147 bp，ITS1
spacer172 bp，ITS2 spacer223 bp 。分析结果如表 3
图 1 毛黄堇和石生黄堇 ITS序列分布图
第 23期 易思荣等：石生黄堇和毛黄堇的核糖体 DNA ITS序列分析 11
表 3 毛黄堇和石生黄堇 G+C含量及同源性 （%）
毛黄堇
石生黄堇
同源性比较
ITS
67.02
64.85
81.26
5.8S rDNA
22.91
22.91
100.00
ITS1
32.98
32.96
83.73
ITS2
45.21
44.13
78.79
所示，毛黄堇和石生黄堇的 5.8S rDNA具有 100%
的同源性，而 ITS1和 ITS2表现出种间的多态性，
其 ITS1 spacer和 ITS2 spacer对应的差异性分别为
16.27%和 21.21%，同源性分析表明，两物种的亲缘
关系相近，但也存在一定的差异。
获得毛黄堇和石生黄堇的 ITS DNA 片段后，
对其按照 5.8S rDNA、ITS1和 ITS2进行划分，并分
别进行 G+C 含量百分比和同源性比较，结果表明，
毛黄堇和石生黄堇的 5.8 S rDNA 的 G +C含量百
分比完全一致，ITS1、ITS2 的 G+C 含量百分比相
似，说明它们的亲缘关系相近（见表 3）。
3 讨 论
近年来，利用分子生物学的方法获得的大量
DNA序列资料被应用于植物系统学的研究。其中
核糖体 DNA ITS 区的应用最为广泛，并且已经证
明这一区域的 DNA序列特征可以作为被子植物系
统学研究的一个非常有用的性状。由于 ITS区具有
较快的进化速率，所以可以用来解决一些较低分类
阶元的问题。随着 DNA测序技术的快速发展，rD－
NA ITS 序列分析已经应用到了中药的基原鉴定、
道地性研究等多个领域，在生药鉴别方面也已进行
了许多开拓性的研究。虽然 DNA序列分析技术操
作复杂、成本高，在实际应用中仍存在很大的困难，
目前还不能成为一种常用的鉴别手段，但为从
DNA水平上寻找药用植物鉴定和道地药材鉴别的
可靠的特异性 DNA分子标记提供了有益的启示。
不同药材品种在特定的遗传和生态两种因素
长期而复杂的相互作用下，形成了特有的品质和药
性，这些构成了道地药材的主要特征，但道地药材
和非道地药材物种来源相似或相同，在形态、药性、
化学成分等特征上具有高度的一致性，因此对道地
药材的直接鉴定十分困难。利用 rDNA ITS测序技
术对这些药材进行遗传分子标记研究，找出其道
地性即药用植物多样性的遗传分子基础，阐明其
道地性的规律，建立完善的道地性评价的遗传学、
分子生物学和天然药物化学指标体系，则能够为
实现对道地药材和非道地药材的鉴别提供可靠的
依据。
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（责任编辑：石 君）
第 23期湖南农业科学12