全 文 ：第 40 卷 第 2 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 40 No． 2
2012 年 2 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Feb． 2012
1)黑龙江省自然科学基金项目(C200843)。
第一作者简介:潘磊，男，1987 年 4 月生，东北林业大学生命科
学学院，硕士研究生。
通信作者:郑宝江，东北林业大学生命科学学院，教授。E－mail:
zbjnefu@ 126． com。
收稿日期:2011 年 9 月 22 日。
责任编辑:潘 华。
茶藨子总 DNA提取及 ITS－PCR体系的优化1)
潘 磊 郑宝江
(东北林业大学，哈尔滨，150040)
摘 要 利用 Tiangen DP305 试剂盒对茶藨子(Ribes L．)总 DNA 进行提取，应用单因子试验分析了 DNA 模
板、dNTPs、引物和 Taq酶对 ITS－PCR扩增结果的影响，并建立了茶藨子 ITS－PCR扩增反应的优化体系，最优反应
体系为:25 μL体系中，10×PCR buffer 1 μL、Mg2+0． 4 mmol /L、引物浓度 0． 5 μmol /L、dNTP浓度为 1 mmol /L、Taq酶
的用量 1． 0 U、DNA模板用量为 50 ng。优化后的反应体系可作为茶藨子属植物 ITS－PCR的基本反应体系，为进一
步开展茶藨子属的分类和系统发育研究奠定基础。
关键词 单因子试验;ITS－PCR;茶藨子
分类号 Q751
Extraction of Genomic DNA from Ribes and Establishment of ITS-PCR Reaction Systems /Pan Lei，Zheng Baojiang
(College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin 150040，P． R． China)/ / Journal of Northeast Forestry
University． －2012，40(2)． －39－41
Single factor optimization was carried out in order to study the effects of concentrations of template DNA，dNTPs，
primer and Taq polymerase activity on ITS-PCR amplification． The total DNA was extracted from ribes by Tiangen DP305．
The optimal conditions for ITS-PCR on ribes were obtained as 10 ×PCR buffer 1 μL，Mg2+ concentration 0． 4 mmol /L，
primer 0． 5 μmol /L，dNTP 1 mmol /L，Taq DNA polymerase 1． 0 U，and total DNA 50 ng in a 25 μL reaction system． The
optimized reaction system can be used as the ITS-PCR basic reaction system for ribes plants．
Keywords Single factor test;ITS-PCR amplification system;Ribes
茶藨子属(Ribes L．)隶属于虎耳草科(Saxifra-
gaecea)一类小灌木，我国是该属植物分布中心之
一，据中国植物志记载有 59 种，30 个变种［1］。该属
植物在形态表型方面变异幅度大，从生殖系统结构
上可分为完全花和不完全花两大类群，分类难度较
大，至今仍存在诸多问题［2－3］，因此利用分子标记技
术对该属植物进行系统学研究，可为该属植物的科
学分类提供分子基础。
随着分子生物学的理论与技术的不断发展和完
善，通过选择不同物种和亚种中具有代表性的 DNA
片段进行克隆、测序以及遗传变异和进化分析，从而
在 DNA 水平上为某一物种的起源进化和分类提供
最直接的分子依据。目前，核糖体 DNA(rDNA)ITS
(Internal transcribed spacer)序列是研究种间的系统
学的一种重要的分子性状［4］。研究表明 ITS 在研究
属内种间和较近的族间、属间关系时都表现出较高
的趋异率和信息位点百分率，为类群内部的系统重
建提供了很好的支持［5－6］。而基因组 DNA 的提取
纯化是整个工作的基础，所以，高效地获得基因组
DNA具有一定的难度，提取 DNA 的质量在很大程
度上影响后续的 PCR、酶切等的研究工作［7－8］。因
此，无论是分类还是系统发育研究，基因组 DNA 提
取是研究开始的关键。本研究利用 Tiangen DP305
基因组 DNA 提取试剂盒，通过纯化获得良好的
DNA。同时对茶藨子 ITS－PCR 反应体系进行了优
化与建立，为进一步开展茶藨子属的分类和系统发
育研究工作奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
试验材料采集自大兴安岭地区茶藨子属植物
(黑果茶藨子、英吉利茶藨子、水葡萄茶藨子和东北
茶藨子) ，采集叶片硅胶干燥，用塑封袋封装带回。
密封在 20 ℃下保存，待用，标本凭证现存于东北林
业大学生命科学院。
1． 2 基因组 DNA的提取与检测
用 Tiangen DP305 植物基因组 DNA提取试剂盒
进行提取，提取之后的 DNA 采用 MicroElute DNA
Clean－Up Kit 试剂盒进行纯化，具体方法参照说明
进行。然后采用 1%琼脂糖凝胶(含 0． 5 mg /L 溴化
乙锭)电泳检测 DNA的完整性。
1． 3 引物设计和扩增程序
PCR扩增在 ABI公司的 Gene Amp PCR System
9700 型 PCR 循环仪上进行。引物参考 LISA M．
SCHULTHEIS等［9］为 ITS1 －F 和 ITS4，由上海生物
工程公司合成。引物序列为:ITS—F(5’TCCTC-
CGCTTATTGATATGC3’)、ITS4(5’GTCCACTGAAC-
CTTATCATTTAG3’)。扩增程序为:97 ℃预变性 1
min后进行 35 个循环，每个循环包括 97 ℃变性 10
s，48 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，循环结束后 72 ℃
延伸 7 min，4 ℃保存。用 1%的琼脂糖凝胶(含 0． 5
mg /L溴化乙锭)电泳进行检测。
1． 4 PCR主要参数的优化和产物的纯化与测序
为了得到较好的 PCR 结果，本研究对 PCR 反
应成分包括 Taq 酶、dNTP、引物和模板 DNA 的用量
等进行了不同的组合，以优化 PCR 反应条件，PCR
扩增反应体积 25 μL。在其他参数固定不变的情况
下，分别对影响 PCR扩增的几个重要条件和参数进
行优化。先分别确定单个的最优条件，后根据成本
等因素综合最终确定一个最优的 ITS－PCR 反应条
件。PCR扩增产物的纯化与测序送入公司完成。
表 1 ITS－PCR反应的因素水平
水平 DNA模板 /mg·L－1 dNTPs /mmol·L－1 引物 /μmol·L－1 Taq酶 /U
1 10 0． 25 0． 3 0． 75
2 30 0． 50 0． 4 1． 00
3 50 0． 75 0． 5 1． 25
4 70 1． 00 0． 6 1． 50
5 90 1． 25 0． 7 1． 75
2 结果与分析
2． 1 单因子试验
模板 DNA 含量:模板的 DNA 浓度是一个制约
扩增产量及特异性的因素，当 DNA 含量过少时，扩
增产物少，甚至无扩增;当含量过多时，会抑制 PCR
的反应，使扩增产物减少甚至无扩增。由不同水平
DNA模板含量的 ITS － PCR 电泳结果可知:模板
DNA含量在 10 ～ 90 ng时，都可以扩增出条带;但在
30 ～ 70 ng时条带较为为明显，50 ng 时条带最清晰，
所以模板 DNA含量 50 ng为宜，见图 1。
M．标准分子量 DL2000;1 ～5． DNA模板量分别为 10、30、50、70、90 ng。
图 1 ITS－PCR不同 DNA模板浓度的扩增结果
dNTPs浓度:dNTPs是 PCR反应的原料，当浓度
过高时，会导致聚合酶错误的掺入，并使碱基错配，
导致 PCR 扩增的忠实性降低;当浓度过低时，又会
影响合成效率。由不同水平 dNTPs浓度的 ITS－PCR
电泳结果可知，当 dNTPs 浓度为 0． 25、0． 50、0． 75
mmol /L时，有扩增条带，但以 1． 0 mmol /L 时为最
佳;浓度为 1． 25 mmol /L 时，扩增产物减少，且条带
较为模糊，见图 2。
M．标准分子量 DL2000;1 ～ 5． dNTPs 浓度分别为 0． 25、0． 50、0． 75、
1． 00、1． 25 mmol /L。
图 2 ITS－PCR不同 dNTPs浓度的扩增结果
引物浓度:在 PCR 反应中，当引物的浓度过低
时，引物与模板的结合率低，无法进行有效的扩增;
当引物浓度过高时，又会增加非特异性结合的机率，
会形成引物二聚体，并且会与 Taq DNA聚合酶竞争
Mg2+。分析 5 种引物浓度下的扩增结果，发现在试
验中所设引物浓度均有扩增产物，但当引物浓度为
0． 5 μmol /L 时，条带最为清晰，见图 3。因此，0． 5
μmol /L为引物最佳反应浓度。
M．标准分子量 DL2000;1 ～5．引物浓度分别为 0． 3、0． 4、0． 5、0． 6、0． 7
μmol /L。
图 3 ITS－PCR不同引物浓度的扩增结果
Taq酶浓度:Taq 酶的用量是影响 PCR 反应的
一个重要因素，当 Taq酶浓度过低时不扩增，浓度太
高又会引起非特异性扩增。对不同浓度 Taq酶的扩
增结果表明:在 0． 75、1． 00、1． 25、1． 50、1． 75 U 时均
有条带，但从扩增效果和经济角度考虑，在体系中确
定 Taq酶适宜用量为 1． 00 U(图 4)。
M．标准分子量 DL2000;1 ～ 5． Taq 酶分别为 0． 75、1． 00、1． 25、1． 50、
2． 00 U。
图 4 ITS－PCR不同 Taq酶浓度的扩增结果
退火温度的筛选:参考 Lisa M Schultheas 等［9］
扩增程序中引物的退火温度，选择 52 ℃。研究结果
表明在此温度下，引物扩增结果比较稳定。
2． 2 PCR扩增结果
通过单因素对每个条件进行优化，获得了茶藨
04 东 北 林 业 大 学 学 报 第 40 卷
子 ITS － PCR 最优的反应体系，其总体积 25 μL:
ddH2O 17． 8 μL、Taq 酶 0． 20 μL(5 U /μL)、引物各
1． 25 μL(10 μmol /L)、dNTPs 2． 5 μL(10 mmol /L)、
Buffer(Mg2+)1 μL(10 ×)、DNA 模板 1 μL(50 ng /
μL)。以优化条件组合对 4 种不同类群的茶藨子模
板 DNA进行 PCR扩增，产物经 1． 0%的琼脂糖凝胶
电泳检测，在约 600 bp处有一明亮的 DNA 带(见图
5) ，与预期大小一致。表明所建立的 PCR扩增优化
条件可以满足不同类群的 ITS反应要求。
M．标准分子量 DL2000;1 ～ 5．代表不同种类的茶藨子。
图 5 ITS－PCR扩增电泳图
2． 3 ITS基因的 PCR测定分析
在上述的优化扩增条件下，取 2 个 25 μL 的相
同反应物混合共 50 μL(因测序时需要一定总量的
PCR产物)的产物，其中 5 μL以检测用，45 μL 进行
PCR产物(未纯化)直接测序。目前，不仅对东北茶
藨子 ITS序列进行成功测序(图 6) ，还测出了茶藨
子子属其他 3 种(黑果茶藨子、英吉利茶藨子、水葡
萄茶藨子)的 ITS序列。
图 6 东北茶藨子(Ribes mandshuricum (Maxim．)Kom)测序
结果
3 讨论
PCR扩增条件中样品 DNA 模板量、Taq 酶用量
及来源、dNTP浓度等均会影响 PCR扩增结果，从而
影响扩增产物重复性。其中，dNTPs 提供扩增所需
原料，dNTPs浓度过高，可能造成非靶序列启动和延
伸时核苷酸的错误掺入，还会抑制 Taq酶的活性;浓
度过低，则会影响扩增产量。DNA 模板使用量也是
影响 PCR扩增的重要因素，DNA浓度过低时产物的
量少或无扩增产物;浓度过高会产生非特异性产物。
同时随着模板用量增加，污染也可能增加，致使扩增
效果下降。因此对反应体系中各因子进行优化组合
是决定 PCR 扩增反应成败的关键程序。对 ITS 的
研究，国外这方面的研究起步较早，发展迅速，而且
研究的范围比较广泛，主要集中在胡桃科［6］、虎耳
草科［10］、豆科［11］等的分类和系统发育研究上。在
国内，虽然起步较晚，但在大戟属［12］、杨属［13］、芥菜
属［14］、珍珠黄杨［15］等植物的系统发育研究上已取
得较大的进展［16］。但已有的反应体系和扩增条件
不适合茶藨子属植物。本研究通过对各因素的不同
梯度比较，确定茶藨子 ITS－PCR 扩增条件:引物浓
度 0． 5 μmol /L、dNTPs浓度为 1 mmol /L、Taq 酶的用
量为 1． 0 U、DNA模板用量为 50 ng。利用此反应体
系可得到预期大小的 ITS 基因片段，可以为后续的
测序及酶切提供基础。
研究结果表明，采用不同的反应体系会对 ITS－
PCR扩增产生较大的影响，合适的 PCR反应参数是
保证 ITS扩增结果的基本条件。经过对反应体系的
筛选优化，建立了可用于茶藨子 ITS－PCR 最适宜的
条件。利用此反应体系已成功扩增出黑果茶藨子、
英吉利茶藨子、水葡萄茶藨子和东北茶藨子四个类
群的 ITS序列。因此，优化后的反应体系可作为茶
藨子属植物 ITS－PCR的基本反应体系。
参 考 文 献
［1］ 陆玲娣，黄淑美． 中国植物志． 第 35 卷［M］． 北京:科学出版
社，1995．
［2］ 陆玲涕． 中国茶藨子属的研究［J］． 植物分类学报，1995，33
(1) :58－75．
［3］ 黄普华，叶万辉．茶藨子属植物的花粉形态及其在分类学上的
意义［J］．植物分类学报，1989，27(5) :378－385．
［4］ 倪穗，田敏，李纪元，等．红山茶总 DNA提取及 ITS—PCR扩增
条件优化研究［J］．浙江林业科技，2007，27(2) :16－19．
［5］ Schwarzbach A E，Rickefs R E． Systematic affinities of Rhizo-
phoraceae and Anisopylle aceae and intergeneric relationships within
Rhizophora ceae，based on chlorplast DNA，nuclear ribosomal
DNA and morphology［J］． Bot，2000，87:547－564．
［6］ Stanford A M，Harden R，Parks C R． Phylogeny and biogeography
of Jugland (Juglandaceae)based on mat K and ITS sequence［J］．
Bot，2000，87:872－882．
［7］ 李钧敏，柯世省，金则新．濒危植物七子花 DNA的提取及分析
［J］．广西植物，2002，22(6) :499－502．
［8］ 李思光，罗玉萍，陈万秋，等． 猕猴桃基因组 DNA 的提取及其
RAPD扩增研究［J］．南昌大学学报:理科版，2001，25(3):264．
［9］ Lisam． Schultheis． Molecular phylogeny and biogeography of Ribes
(Grossulariaceae) ，with an emphasis on gooseberries(subg． Gros-
sularia) ［J］． Systematic Botany，2004，29(1) :77－96．
［10］ Soltis D E． Phylogenetic relationships in Saxifragaceae sensu la-
to:a comparison of topologies based on 18S rDNA［J］． Bot，
1997，84:504－522．
［11］ Kollipara K P，Singh R J，Hymowitz T． Phylogenetic and genomic
relation ships in the genus Glycine Willd． based on sequences from
the ITS region of nuclear rDNA［J］． Genome，1997，40(1):57－59．
［12］ 孟娜，周守标，蒋继宏．五种大戟属植物 nrDNA的 ITS 序列及
其叶的比较解剖学研究［J］．广西植物，2006，26(1) :18－21．
［13］ 史全良，诸葛强，黄敏仁，等．杨属 ITS序列的分子进化特点分
析［J］．分子植物育种，2006，4(2) :255－261．
［14］ Qi X H，Zhang M F，Yang J H． Molecular phylogeny of Chinese
vegetable mustard (Brassica juncea)based on the internal tran-
scribed spacers (ITS)of nuclear ribosomal DNA［J］． Genetic
Resources and Crop Evolution，2007，54(8) :1709－1716．
［15］ 刘娜娜，季孔庶．珍珠黄杨 ITS－PCR 体系的建立与优化［J］．
基因组学与应用生物学，2009，28(5) :975－980．
［16］ 刘志文，韩旭，赵明辉，等．核糖体 DNA在植物系统发育中的
应用与研究进展［J］． 安徽农业科学，2008，36(9) :3561 －
3562．
14第 2 期 潘 磊等:茶藨子总 DNA提取及 ITS－PCR体系的优化