全 文 ：食用菌学报 2007.14(4):25 ～ 30
收稿日期:2007-07-18原稿;2007-09-24 修改稿
基金项目:福建省科技厅项目“姬松茸低镉品种选育”(编号 2002I010), 福建省财政专项“福建省农业科学科技创新
团队建设基金”(S T IF-Y01)的部分研究内容
作者简介:林新坚(1955-), 男 , 1980 年毕业于厦门大学生物系 , 研究员 , 主要从事食用菌育种与微生物生态学研
究 , 发表主笔论文 31 篇。
文章编号:1005-9873(2007)04-0025-06
姬松茸 ISSR特异扩增体系的研究
林新坚1 , 江秀红2 , 蔡海松1 , 郑永标1 , 林陈强1
(1福建省农业科学院土壤肥料研究所 ,福州 350013;2福建省农产品质量安全检验检测中心 , 福州 350003)
摘　要:为了建立稳定的姬松茸(Agaricus blazei Murill)简单序列重复区间(Inter-Simple Sequence Repeats ,
ISSR)分子标记技术体系 ,笔者通过单因子试验分别研究了模板 DNA、Mg 2+浓度 、dNTP 、引物浓度和 Taq 酶
用量对姬松茸 ISSR-PCR扩增的影响 ,确定了姬松茸 ISSR分析的最佳 PCR条件为:25 μL反应体系中 , 模板
DNA 20 ng , 引物 0.75μmo l/ L , dNTP 200 μmo l/ L , Mg2+2.0 mmol/ L , Taq DNA polymerase 1.5 U 。并应用该
优化体系筛选到 6 个适合姬松茸 ISSR-PC R扩增的引物 ,为利用 ISS R标记技术研究姬松茸的种质资源提供了
参考。
关键词:姬松茸;简单序列重复区间;体系优化;单因子试验
中图分类号:646.110.1　　　　文献标识码:A
　　姬松茸(Agaricus blazei Murrill)又名小松
菇 、柏 氏 蘑菇 、巴 西蘑 菇 , 属担 子菌 亚门
(Basidiomyco tina)、层菌纲(Hymenomycetes)、
伞菌目(Agaricus)、蘑菇科(A garicaceae)、蘑菇属
(Agaricus),原产于巴西 ,是一种珍稀食药两用
菌[ 1] ,深受美国 、日本 、巴西等国消费者的青睐 。
我国生产的姬松茸主要用于出口 。由于受菌种
质量的影响 ,优质 、安全的姬松茸产品非常有限 。
因此 ,利用分子生物学技术研究姬松茸种质资源
的遗传关系是进一步加强姬松茸优良品种选育
的基础 ,也是保持食用菌产业可持续发展的需
要。但是 ,在分子生物学技术飞速发展的今天 ,
该技术在珍稀食药用菌姬松茸研究上的应用却
很少 ,很大程度上只处于分子水平上现象的观
察 、数据的收集等较浅的层面。因此 ,姬松茸遗
传育种 、种质资源多样性研究仍未取得实质性的
突破 。
简单序列重复区间(Inter-Simple Sequence
Repeats , ISS R)分子标记是 ZIETKIEWIC[ 2] 等以
简单重复序列(Simple Sequence Repeat , SSR)技
术[ 3] 为基础发展起来的一种新的简单序列重复
区间扩增多态性分子标记 。 ISSR通常为显性标
记 ,呈孟德尔式遗传 ,能比 RAPD 、RFLP 更快
速 、高效和灵敏地检测出基因组 DNA 的稳定性
和多态性 [ 4 , 5] ,且操作简单 ,所需 DNA 量少 ,无
需预知研究对象的基因组序列等优点 ,已经被
广泛应用于植物的品种鉴定 、遗传作图和遗传
多样性等方面的研究[ 6-9] 。在真菌的遗传研究
中也得到了广泛的应用[ 10-12] 。而姬松茸 ISSR-
PCR反应系统的建立及其群体遗传多态性的分
析尚未见报道 。鉴于 ISSR-PCR反应系统的各
个因素及水平对反应结果均有影响 ,因此 ,笔者
利用单因子试验对姬松茸 ISS R-PCR反应体系
(25 μL)的 5个因素 (模板 DNA , Mg2+ , dNTP ,
引物浓度 , Taq 酶用量)进行优化 ,确立了重复
性好 、结果清晰稳定的姬松茸 ISSR-PCR试验参
数 ,为深入研究姬松茸种质资源多样性奠定了
良好的基础 。
1　材料与方法
1.1 供试菌株
　　本研究共选用了 10个姬松茸菌株。姬松茸
菌 株 AbM L2 、 AbMD3 、 AbML7 、 AbM 9 和
AbML11为福建省农科院土壤肥料研究所保存
菌株;AbM2q 、AbM 8q 和 AbM ±购自福建省轻
工业研究所;AbM4s 购自三明市真菌研究所;
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2007.04.009
食　用　菌　学　报 第 14 卷
AbMA 购自福建省农科院工程研究所 。其中 ,
AbM9为出发菌株(引自日本), AbML2 、AbML7
和 AbML11为 AbM 9经离子束注入诱变所得菌
株;AbMD3 为 AbM9 单孢分离菌株 。本试验优
化反应体系所用姬松茸菌株为 AbM 9 ,验证优化
反应条件所用菌株为上述 10个菌株。
1.2 主要试剂和引物
　　Taq 酶 、dN TP 、MgCl2 、10×buf fe r 等 PCR
扩增所用试剂及 DNA M arker (Gene RulerTM
100bp Ladder P lus)购自上海生工生物工程技术
服务有限 公司;ISS R 引 物由 大连 宝生 物
(TAKARA)公司合成(表 1)。
表 1　ISSR引物
Table 1　ISSR primers1)
引物 Primer 序列 Sequence(5′-3′) 引物 P rime r 序列 Sequence(5′-3′)
ISS R1 AGAGAGAGAGAGAGAGT ISSR9 BDBACAACAACAACAACA
ISS R2 CACACACACACACACAG ISSR10 AAGAAGAAGAAGAAGAAGC
ISS R3 VDH TCGTCGTCGTCGTCG ISSR11 DHBCGACGACGACGACGA
ISS R4 C TC TCTCTCTCTCTCTRC ISSR12 GAGAGAGAGAGAGAGACT
ISS R5 GAGAGAGAGAGAGAGAC ISSR13 NNNNNNNNNNNNNNN
ISS R6 CTCCTCCTCCTCSC ISSR14 CACACACACACACACAWG
ISS R7 CATACATACATACATAG ISSR15 CTCTCTCTCTCTCTCTG
ISS R8 VHVGTGTGTGTGTGTGTGT
1)A:腺嘌呤 adenine;T:胸腺嘧啶 thymine;C:胞嘧啶 cy tosine;G:鸟嘌呤 guanine;N = A , G , C , T ;R = A , G ;B
= C , G , T; D = A , G , T ;H = A , C , T; V = A , C , G ;S = G , C;W = A , T
1.3 基因组 DNA的提取
　　采用改进后的氯化苄法[ 13] 提取基因组
DNA 。经一定量的核酸酶(RNase)纯化后 ,用美
国 UV-2800AH 型紫外可见分光光度计(上海尤
尼柯仪器有限公司)定量测定波长 260 nm 和
280 nm处的吸光度值 。根据 OD260计算 DNA 的
浓度 , 根据 OD260 ∶OD 280的值估算 DNA 的纯
度[ 14] 。用无菌 ddH2O 稀释至所需浓度后 , 4 ℃
保存备用 。
1.4 ISSR扩增反应条件优化
1.4.1 ISSR基础扩增反应体系
基础扩增反应体系包括模板 DNA(25 ng/μL)
1 μL , 10 × buffer 缓 冲 液 2.5μL , Mg 2+
1 μL , dNTP (2.5 mmol/L) 2.5 μL , 引物
(50 μmo l/L)1μL , Taq 酶 (5 U/μL)0.3 μL ,
最后用无菌 ddH 2O将总体积补至 25 μL 。
1.4.2 ISSR扩增反应体系的设计
以纯化的姬松茸 DNA 为模板进行 ISSR 扩
增反应。为探索出适于姬松茸 ISS R扩增反应的
最优体系 ,设置了 25 μL 扩增反应体系的各反应
参数梯度 (表 2)。
在整个反应过程中 ,除对上述比较因素进行
梯度设置而变动外 ,其余参数和反应条件不变 ,
而且每个优化好了的因素将用到下一个优化因
素的反应体系中 ,并相应地调整 ddH 2O 的量 ,以
保持反应体系为 25 μL 。
表 2　ISSR反应体系优化设计
Table 2　Design of optimal ISSR reaction system
因素 Reactant 反应参数　Reactant concentra tion
引物浓度 P rimer(μmo l/ L) 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 1.50 -
Mg2+(mmol/ L) 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 -
dNTP(μmol/ L) 50 100 150 200 250 300 350
DNA 浓度 DNA (ng) 10 20 30 40 50 60 -
Taq酶 Taq DNA polymerase(U) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 -
1.4.3 扩增程序
ISS R-PCR反应程序:94 ℃预变性 5 min;
94 ℃变性 1 min , 48 ℃退火 1 min , 72 ℃延伸
2 min , 35个循环;最后 72 ℃延伸 10 min结束反
26
第 4 期 林新坚 , 等:姬松茸 ISS R特异扩增体系的研究
应 ,扩增产物 4 ℃保存备用。
1.4.4 扩增产物鉴定
取 12 μL 扩增产物 ,加入 2 μL 6×溴酚蓝前
沿指示剂 ,充分混匀 ,于 1.5 %琼脂糖凝胶(1×
TA E配制)上进行电泳分析(70 V 1 h),染色 、脱
色后 ,于紫外凝胶成像系统上拍照。优化结果的
评判以电泳结果为标准 ,谱带清晰 、数目适中 、重
复性好的为最佳反应参数 ,将各因素的最佳反应
参数组合作为 ISSR-PCR的最适反应条件。
2　结果与分析
2.1 模板 DNA浓度对 ISSR扩增的影响
　　模板 DNA浓度是影响 ISS R-PCR扩增的重
要因素之一 。模板 DNA 浓度低 ,引物与之结合
的机率小 , 扩增产物的量也少 , 条带弱;模板
DNA 浓度过高 ,则模板分子间结合的机会增大 ,
从而减少了引物与之结合的机率 ,导致扩增产物
稳定性下降或导致过量扩增 ,使电泳图谱呈弥散
状[ 15] 。从图 1 中看出 ,模板 DNA 浓度在 10 ～
60 ng/25 μL 时均可以扩增出条带 ,但是效果差
别较大。当模板 DNA 用量为 20 ng/25 μL 时 ,
条带清晰 、丰富 、亮度好;当用量大于 40 ng/
25 μL时 ,条带开始模糊 、变暗 ,数目减少。通过
比较 ,适宜的模板 DNA 用量为 20 ng/25 μL(这
一浓度既可获得较好的扩增效果 , 又可节约
DNA 用量)。
图 1　不同模板 DNA浓度对 AbM9 菌株
ISSR-PCR扩增的影响
Fig.1　Effect of template DNA concentration
on ISSR amplification from AbM9
M:标记;1 ～ 6:模板 DNA 浓度分别为 10 、20 、30 、
40 、50和 60 ng /25μL
M:markers;Lanes 1 ～ 6:10 , 20 , 30 , 40 , 50
and 60 ng /25 μL template DN A , respectiv ely
2.2 引物浓度对 ISSR扩增的影响
　　由图 2可见 , 6个水平的引物浓度均可扩增
出较清晰的带型。当引物浓度在 0.25 μmo l/L 、
0.5 μmo l/L 时 ,扩增出的条带亮度低 ,分子量较
小的片段开始缺失;当引物浓度高于 1.00μmol/L
时 ,扩增条带增多 ,但较模糊 ,削弱了遗传多态性特
异条带的鉴别分析;引物浓度为 0.75 μmol/L 时 ,
扩增带型清晰且重复性好 ,为本试验的最佳引物
浓度。
图2　不同引物浓度对 AbM9菌株 ISSR-PCR扩增的影响
Fig.2　Effect of primer concentration on
ISSR amplif ication from AbM9
M :标记;1 ～ 6:引物浓度分别为 0.25 、0.50 、
0.75 、1.00 、1.25和 1.50μmol/ L
M :markers;Lanes 1 ～ 6:0.25 , 0.50 , 0.75 ,
1.00 , 1.25 and 1.50 μmol/ L primer , respectively
2.3 dNTP浓度对 ISSR扩增的影响
图 3　不同 dNTP浓度对AbM9菌株 ISSR-PCR扩增的影响
Fig.3　Effect of dNTP concentration on
ISSR amplif ication from AbM9
M :标记;1 ～ 7:dNTP 浓度分别为 50 、100 、150 、
200 、250 、300和 350μmol/ L
M :markers;Lanes 1 ～ 7:50 , 100 , 150 , 200 ,
250 , 300 and 350 μmo l/L dNTP , respectively
　　dN TP 作为 PCR反应的原料 ,其浓度对扩增
产物的生成量影响较大。由图 3可见 ,200μmol/L
dN TP 扩增片段较为清晰 , 扩增效果最好;
dN TP 浓度过低(50 和 100 μmol/L),产物扩增
条 带 模 糊 不 清;浓 度 过 高 (250 、 300 和
27
食　用　菌　学　报 第 14 卷
350 μmol/L),则出现拖尾 ,产物扩增条带减少 ,
甚至无扩增产物 ,其原因可能是 dN TP 分子中
的磷酸基团定量地与 Mg2+结合 ,导致反应中
Mg2+的 浓度 降低 , 从而 影响 了聚 合 酶的
活力[ 16] 。
2.4 Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响
　　Mg2+浓度是 ISS R-PCR扩增的一个主要变
化因素 ,选择合适的 Mg2+浓度对 PCR反应至
关重要 。Mg2+作为 Taq酶的辅助因子 ,其浓度
影响 Taq酶活性的发挥。适当的 Mg 2+浓度可
以提高反应的特异性 ,但浓度过高会使特异性
下降 , 增加引物错配频率 。由图 4 可见 , 当
Mg
2+浓度超过 2.5 mmol/ L 时 ,由于酶活性过
高 ,产生了一些不同分子量的非特异性的弥散
带 。当 Mg 2+浓度为 2.0 mmol/ L 时 ,条带数清
晰 、稳定且丰富 。
图 4　不同Mg2+浓度对 AbM9 菌株 ISSR扩增的影响
Fig.4　Effect of Mg2+ concentration on ISSR
amplification from AbM9
M:标记;1 ～ 6:Mg2+浓度分别为 1.5 、2.0 、2.5 、
3.0 、3.5和 4.0 mmo l/L
M:markers;Lanes 1 ～ 6:1.5 , 2.0 , 2.5 , 3.0 ,
3.5 and 4.0 mmo l/L M g2+ , respect ively
2.5 Taq酶浓度对 ISSR扩增的影响
　　在 ISSR-PCR 反应体系中 , Taq酶直接影
响扩增反应的成功与否 。适宜的 Taq酶浓度
既能保证试验成功 ,又可以节省试验药品 。高
浓度的 Taq酶不仅成本过高 ,且易产生非特异
性扩增产物;Taq酶浓度过低则导致产物的合
成效率下降 。本试验所设置的 6 个 Taq酶浓
度梯度中 ,除了 3.0 U 出现非特异性扩增外 ,
其他浓度对扩增结果影响不大(图 5)。从条带
的清晰度 、稳定程度及经济角度考虑 , 1.5 U
的 Taq酶浓度是姬松茸 ISS R-PCR扩增的最适
酶浓度 。
图 5　不同 Taq 酶浓度对 AbM9 菌株 ISSR 扩增的影响
Fig.5　Effect of Taq DNA polymerase
concentration on ISSR amplif ication from AbM9
M :标记;1 ～ 6:Taq酶浓度分别为0.5 、1.0 、1.5 、
2.0 、2.5和 3.0 U/25 μL
M :markers;Lanes 1 ～ 6:0.5 , 1.0 , 1.5 , 2.0 ,
2.5 and 3.0 U/25 μL Taq DNA polymer-
ase , respectively
2.6 姬松茸 ISSR反应体系的建立及引物的筛选
　　本研究以姬松茸 DNA 为模板 ,通过单因子
多水平试验 ,建立了重复性好 、分辨率高的适合
姬松茸 ISS R-PCR的扩增反应体系:25 μL 总反
应体积中 ,模板 DNA 1μL , 10 ×Buf fe r缓冲液
2.5 μL , Mg2+ 1 μL , dN TP (2.5 mmol/L)
2.5 μL ,引物(50μmol/ L)1μL , Taq 酶 0.3 μL ,
最后用无菌 ddH 2O将总体积补至 25 μL 。
图 6　引物 ISSR9对 10 个姬松茸菌株基因组
DNA扩增的 ISSR带型
Fig.6　Banding patterns produced from 10 Agricus
blazei Murrill by primer ISSR9
　　上述确定条件分别用合成的 15个引物扩增
姬松茸的 DNA ,进行引物的筛选。发现 ISS R1 、
ISS R3 、ISSR6 、ISS R8 、ISSR9 和 ISSR11 的扩增
多态性 、清晰度 、稳定性效果较好 ,扩增后得到的
DNA 片段的分子量在 200 ～ 2000 bp之间。引物
ISS R3和 ISS R9在 10 个姬松茸供试菌株中的验
28
第 4 期 林新坚 , 等:姬松茸 ISS R特异扩增体系的研究
证结果表明(图 6和图 7),扩增产物带型丰富 、条
带清晰 、菌株间有不同程度的多态性 ,说明该反
应体系适用于姬松茸(38个姬松茸菌株的 ISSR
分析将另文报道)。
图 7　引物 ISSR3对 10 个姬松茸基因组
DNA扩增的 ISSR带型
Fig.7　Banding patterns produced from 10 Agricus
blazei Murrill by primer ISSR3
3　讨论
3.1 本文通过单因子试验分别研究了模板DNA 、
Mg
2+浓度 、dN TP 、引物浓度和 Taq 酶用量对姬
松茸 ISSR-PCR扩增的影响 ,确定了姬松茸 ISSR
分析的最佳 PCR 条件为:25 μL 反应体系中 ,
模板 DNA 20 ng , 引物 0.75 μmol/ L , dN TP
200 μmo l/L ,Mg2+2.0 mmo l/L , Taq酶 1.5 U 。
应用该优化体系筛选到 6 个适合姬松茸 ISS R-
PCR扩增的引物 ,为利用 ISS R标记技术研究姬
松茸的种质资源提供了参考 。
3.2 从试验结果可以看出 ,Mg2+ 、引物和 dN TP
浓度对 ISSR-PCR扩增有显著的影响 ,浓度过
低 ,不能满足扩增的要求 ,浓度过高 ,则由于组分
间的竞争影响了扩增效果。Mg2+浓度适宜的范
围比较窄 ,适当的 Mg2+浓度可以提高反应的特
异性 ,使聚合酶的活力适当 ,有益扩增效果 。引
物浓度过高 ,容易形成引物二聚体 ,同时 ,易引起
碱基错配 ,产生非特异性条带;引物浓度过低 ,其
与模板 DNA 的结合位点少 ,扩增产量下降 ,条带
少[ 17] 。而 Taq 酶浓度在试验梯度中对反应的影
响不大。试验还发现 ,利用氯化苄法提取的模板
DNA 经核酸酶纯化后 ,在低浓度下就可以得到
较理想的扩增效果 ,说明该方法提取的 DNA 完
全可以满足 ISS R-PCR扩增的需要 。
3.3 此外 ,优化体系筛选到 6个 ISS R-PCR扩增
的引物即 4(G+C)和 2(A+T)结构的引物 ,虽然
能较好地扩增出10个姬松茸菌株基因组的 DNA
条带 ,但在大样本情况下能否扩增出姬松茸菌株
基因组 DNA 的多态性 ,还有待进一步研究 。
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[本文编辑] 　宋凤菊
Optimization of Inter-Simple Sequence Repeats(ISSR)
React ion System for Agaricus blazei
LIN Xinjian
1 , JIANG Xiuhong2 , CAI Haisong1 , ZHENG Yongbiao1 , LIN Chenqiang1
(1 Institute of Soil and Fertilizer , Fujian Academy of Agr icultural Sciences , Fuzhou , Fujian 350013 , China;
2Fujian Inspection and Testing Centre for Agr icultur al Product Quality and Safety , Fuzhou , Fujian 350003 , China)
Abstract:Single fac tor testing was used to determine the optimal concentr ations of DNA templa te , pr imer ,
dNTP , Mg2+and Taq DNA polymerase for PCR amplification of inter-simple sequence r epea ts (ISSR) in
order to establish a stable ISSR-based molecular ma rker system for Agaricus blazei Murr ill.The reaction
mixture for optimum amplif ica tion contained:20 ng DNA template , 0.75 μmol/ L pr imer , 200 μmol/ L
dNTP , 2.0 mmol/ L Mg2+ and 1.5 U Taq DNA polymerase.Six primers suitable for PCR amplif ication of
ISSR markers from A .blazei were selected using this system.Our data has impor tant implica tions for A .
blazei germplasm analysis.
Key words:Agaricus blazei ;Inte r-simple sequence r epeats(ISSR);System optimization;Single f actor test
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