全 文 ：　２０１２，３８（３）：９０－９４ Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
收稿日期：　２０１１－０９－１５　　　修订日期：　２０１１－１０－２３
基金项目：　转基因生物新品种培育重大专项（２００９ＺＸ０８０１２－０２５Ｂ）
＊ 通信作者 Ｔｅｌ：０１０－６２８１５９３７，０５３８－８２４１１１４；Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｊｈｕａｎｇ＠ｗｓｓｃ．ｏｒｇ．ｃｎ，ｗａｎｇｊｘ＠ｓｄａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
牛筋草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
张　杨１，　张朝贤２，　王金信１＊，　魏守辉２，　黄红娟２＊
（１．山东农业大学植物保护学院，泰安　２７１０１８；
２．中国农业科学院植物保护研究所，中国农业科学院杂草鼠害生物学与治理重点开放实验室，北京　１００１９３）
摘要　以牛筋草地上组织为材料，采用正交优化和单因子试验两种方法对影响牛筋草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系的 Ｍｇ２＋浓
度、ｄＮＴＰ浓度、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶浓度、引物浓度和ＤＮＡ模板浓度５个因素进行优化试验，建立适合牛筋草ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ的反应体系。结果表明，牛筋草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的最佳条件为：Ｍｇ２＋１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ　０．４ｍｍｏｌ／Ｌ，
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶１Ｕ／２５μＬ，引物０．３μｍｏｌ／Ｌ，模板ＤＮＡ　８０ｎｇ／２５μＬ，１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ／２５μＬ。利用优化
体系进行牛筋草的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应，可获得稳定性高、重复性好、背景清晰的电泳结果。
关键词　牛筋草；　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ；　正交设计；　单因子试验
中图分类号：　Ｓ　４５１　　文献标识码：　Ａ　　ＤＯＩ：　１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－１５４２．２０１２．０３．０２０
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｅｌｅｕｓｉｎｅ　ｉｎｄｉｃａ
Ｚｈａｎｇ　Ｙａｎｇ１，　Ｚｈａｎｇ　Ｃｈａｏｘｉａｎ２，　Ｗａｎｇ　Ｊｉｎｘｉｎ１，　Ｗｅｉ　Ｓｈｏｕｈｕｉ　２，　Ｈｕａｎｇ　Ｈｏｎｇｊｕａｎ２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉ’ａｎ　２７１０１８，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｗｅｅｄ　ａｎｄ　Ｒｏｄｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１９３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｅｌｅｕｓｉｎｅ　ｉｎｄｉｃａ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ－
ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰ，Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗｉｔｈ
ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ａｎｄ　ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ　ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｏｗｅｄ：１．７５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋，０．４　ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰ，１　Ｕ／２５μＬ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．３μｍｏｌ／Ｌ　ｐｒｉｍｅｒ，８０　ｎｇ／２５μＬ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ａｎｄ　２．５μＬ／２５μＬ
ｏｆ　１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ．Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅ　ｇｏｏｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｒｅｐｒｏ－
ｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｌｅａｒ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｅｌｅｕｓｉｎｅ　ｉｎｄｉｃａ；　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ；　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ；　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｅｓｔ
　　牛筋草［Ｅｌｅｕｓｉｎｅ　ｉｎｄｉｃａ（Ｌｉｎｎ．）Ｇａｅｒｔｎ．］俗称
油葫芦草、蟋蟀草、千人踏等，属禾本科属一年生
草本植物，生长于较湿润的农田或路旁，广布全国各
地。对棉花、玉米、大豆、花生等作物危害较重，为近
年来较难防除的杂草之一，灭生性除草剂草甘膦防
除效果不理想。目前，有关牛筋草的研究主要集中
在其对除草剂产生抗性方面［１－２］，针对其遗传多样性
的研究未见报道。
简单重复序列区间扩增（ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）是Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等［３］于１９９４年在微卫
星技术基础上发展起来的分子标记技术。ＩＳＳＲ技
术是一种显性标记技术，结合了ＳＳＲ和ＲＡＰＤ的优
点［３－４］，克服了 ＲＦＬＰ和 ＲＡＰＤ的限制［４－５］，具有引
物序列较长、退火温度较高、重复性较好、稳定性高、
多态性高［６］、成本低、操作简单、所需 ＤＮＡ模板量
少等特点，因而备受青睐。但ＩＳＳＲ是基于ＰＣＲ的
一种分子标记技术，受多种因素的影响，而且反应因
子所需条件不合适会导致扩增产物消失，图谱弥散
等，因此在进行ＩＳＳＲ分子标记时应首先对其反应条
件进行优化［７－８］。
目前，许多领域都已利用ＩＳＳＲ技术进行科学研
究，例如种质资源鉴定、遗传图谱构建、植物进化和
３８卷第３期 张杨等：牛筋草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
遗传多样性分析等领域。国内将ＩＳＳＲ技术用于杂
草相关基因标记的研究报道较少［９－１２］，也未见应用
于牛筋草遗传多样性研究的报道。本文通过研究影
响牛筋草ＩＳＳＲ反应体系的相关因素、建立与优化牛
筋草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，为ＩＳＳＲ标记在杂草遗传
多样性的研究方面提供技术依据。
１　材料与方法
１．１　材料
供试材料：牛筋草，其种子于２００９年采自安徽
阜阳路旁。将饱满的牛筋草种子播在高９．２ｃｍ，直
径１０．５ｃｍ的花盆中。培养土壤为黏土，ｐＨ　６．８，有
机质含量在１．９％左右，土壤与草木炭按体积３∶１混
合使用。室内白天温度为（２８±５）℃，晚上温度为
（２３±５）℃，每天光照１１ｈ，相对湿度为（７５±５）％，
正常水肥管理。取３～４叶期幼苗供试。
供试引物、试剂及仪器设备：用于ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反
应的试剂，ｄＮＴＰ、Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚合酶、Ｍｇ２＋、１０×
ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ，均购自宝生物（ＴａＫａＲａ）工程公司。所
用引物参照哥伦比亚大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｏｌｕｍｂｉａ）
公布的ＩＳＳＲ引物序列，由上海生物工程技术有限公
司合成，试验所用仪器设备均由中国农业科学院杂
草鼠害生物学与治理重点开放实验室提供。
１．２　方法
１．２．１　基因组ＤＮＡ提取
采用新型快速植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（北
京百泰克生物技术有限公司，离心柱型）提取新鲜牛
筋草地上组织ＤＮＡ，方法按照说明书进行。经ｌ％琼
脂糖凝胶电泳分析，核酸蛋白快速检测仪（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
Ｂｉｏ　Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）测定其在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸
光值，计算 ＤＮＡ纯度，稀释至３０ｎｇ／μＬ并保存在
－２０℃冰箱中备用。
１．２．２　ＰＣＲ正交试验设计与单因素处理
采用Ｌ１６（４５）正交试验设计［１３］，对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的
主要影响因素 Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰ、引物、
Ｍｇ２＋浓度及模板ＤＮＡ浓度进行５因素４水平筛选
分析，共１６个处理，每处理３次重复，ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反
应各因素水平及正交试验见表１。反应体系总体积
为２５μＬ，包括１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，其他各成分
按照表１加样，不足体积用ｄｄＨ２Ｏ补足。
表１　ＰＣＲ反应因素水平Ｌ１６（４５）正交试验设计表
编
号
影响因素
Ｍｇ２＋／
ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ｄＮＴＰ／
ｍｍｏｌ·Ｌ－１
Ｔａｑ酶／
Ｕ·（２５μＬ）－１
引物浓度／
μｍｏｌ·Ｌ－１
ＤＮＡ模板／
ｎｇ· （２５μＬ）－１
１　 １．００　 ０．２　 ０．５０　 ０．３　 ２０
２　 １．００　 ０．４　 ０．７５　 ０．４　 ４０
３　 １．００　 ０．６　 １．００　 ０．５　 ６０
４　 １．００　 ０．８　 １．２５　 ０．６　 ８０
５　 １．２５　 ０．２　 ０．７５　 ０．５　 ８０
６　 １．２５　 ０．４　 ０．５０　 ０．６　 ６０
７　 １．２５　 ０．６　 １．２５　 ０．３　 ０
８　 １．２５　 ０．８　 １．００　 ０．４　 ２０
９　 １．５０　 ０．２　 １．００　 ０．６　 ４０
１０　 １．５０　 ０．４　 １．２５　 ０．５　 ２０
１１　 １．５０　 ０．６　 ０．５０　 ０．４　 ８０
１２　 １．５０　 ０．８　 ０．７５　 ０．３　 ６０
１３　 １．７５　 ０．２　 １．２５　 ０．４　 ６０
１４　 １．７５　 ０．４　 １．００　 ０．３　 ８０
１５　 １．７５　 ０．６　 ０．７５　 ０．６　 ２０
１６　 １．７５　 ０．８　 ０．５０　 ０．５　 ４０
单因素试验在正交试验最优体系的基础上，将
单个因子按照一定梯度变化，其他因子保持不变，逐
个筛选出各因子的最优扩增条件，组成适合于牛筋
草的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应体系。各因子浓度梯度处
理见表２。 表２　各因子浓度梯度
浓度
梯度
Ｍｇ２＋／
ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ｄＮＴＰ／
ｍｍｏｌ·Ｌ－１
引物／
μｍｏｌ·Ｌ－１
Ｔａｑ　ＤＮＡ酶／
Ｕ·（２５μＬ）－１
ＤＮＡ模板／
ｎｇ·（２５μＬ）－１
１　 １．００　 ０．２　 ０．３　 ０．５０　 ２０
２　 １．２５　 ０．４　 ０．４　 ０．７５　 ４０
３　 １．５０　 ０．６　 ０．５　 １．００　 ６０
４　 １．７５　 ０．８　 ０．６　 １．２５　 ８０
１．２．３　ＰＣＲ扩增及电泳检测
ＰＣＲ扩增程序为９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性
３０ｓ，５２℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；
７２℃延伸１０ｍｉｎ；４℃保存备用。扩增产物采用
１．８％琼脂糖凝胶电泳，ｌ×ＴＡＥ缓冲液，电压１２０Ｖ，
电泳１．５ｈ，于 ＵＶＰ凝胶成像系统上拍照保存，并对
结果进行直观分析，确定牛筋草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应各影
响因素的最佳水平。
２　结果与分析
２．１　正交试验结果
引物ＵＢＣ８３５对安徽阜阳牛筋草扩增试验结果
见图１。谱带较为丰富清晰的为组合１３、１４、１５和
１６，组合５、１２条带模糊，组合２、３、８、９和１１谱带较
弱主带不明显且出现杂带，组合１、４、７和１０多态性
条带少，而组合６无条带。比较分析发现，组合１４谱
带清晰，且多态性较高，确定为最优组合，即５μＬ的
ＰＣＲ反应体系中含：０．４ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ、０．３μｍｏｌ／Ｌ
·１９·
２０１２
ＩＳＳＲ引物、１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋、１ＵＴａｑ　ＤＮＡ聚合
酶、２．５μＬ　１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｅｒ和８０ｎｇ　ＤＮＡ模板。
为获得理想的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系，在组合１４的基
础上，其他因素保持不变的情况下进行第２轮的单
因素优化筛选试验。
图１　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交设计扩增结果
２．２　退火温度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的影响
在正交试验最佳反应体系基础上，对退火温度
进行梯度试验以确定引物合适的退火温度。根据所
选引物序列计算理论退火温度Ｔｍ，Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋
２（Ａ＋Ｔ）［１４］，在梯度 ＰＣＲ 仪上设定退火温度
（Ｔｍ±５）℃，仪器自动形成１２个温度，在其中的１０
个温度上进行扩增，其他反应程序与ＰＣＲ正交试验
相同。扩增结果显示（图２），退火温度过低情况下，
扩增特异性差，而退火温度过高又会导致引物与模
板结合差，出现电泳条带减弱的现象。为提高反应
的特异性，扩增结果相近时，优先选择相对较高的退
火温度，图２中泳道７、８条带清晰明亮，因此确定引
物ＵＢＣ８３５的退火温度为５２℃。
图２　退火温度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的影响（引物为ＵＢＣ８３５）
２．３　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果
的影响
　　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶的用量是影响ＰＣＲ的一个重
要因素，ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度过低导致ＰＣＲ扩增产
物的合成效率降低。Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚合酶为 ０．５、
０．７５、１．００Ｕ和１．２５Ｕ４个用量下（图３），扩增结
果不一致。当Ｔａｑ酶用量０．５Ｕ和１．２５Ｕ时合成
效率低，条带少且不清晰；用量为０．７５Ｕ和１．００Ｕ
时，所得扩增条带清晰，结合正交试验结果确定Ｔａｑ
酶用量１．００Ｕ。
图３　ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
扩增效果的影响（引物为ＵＢＣ８３５）
２．４　Ｍｇ２＋浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的影响
Ｍｇ２＋浓度也是影响ＰＣＲ结果的重要因素之
一，它是ＴａｑＤＮＡ聚合酶的激活剂，是Ｔａｑ　ＤＮＡ聚
合酶活性重要的影响因素之一。Ｍｇ２＋与反应液中
的引物、ｄＮＴＰ及模板相结合，影响扩增产物的特异
性、引物与模板的结合效率以及引物二聚体的形
成［１５］。从扩增结果（图４）中可以看出，Ｍｇ２＋浓度在
１．５０ｍｍｏｌ／Ｌ和１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ时，所得扩增结果无
显著差异，而在正交试验结果中１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋
浓度扩增结果优于１．５０ｍｍｏｌ／Ｌ，因此确定Ｍｇ２＋最
佳浓度为１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ。
图４　Ｍｇ２＋浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的影响（引物为ＵＢＣ８３５）
·２９·
３８卷第３期 张杨等：牛筋草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
２．５　ｄＮＴＰ浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的影响
ｄＮＴＰ是ＰＣＲ的原料，过高浓度的ｄＮＴＰ会造成
错误掺入，而浓度太低又会导致扩增产率下降。从图
５中可以看出，ｄＮＴＰ浓度为０．８ｍｍｏｌ／Ｌ时扩增条带
弱，多态性差；浓度为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ和０．４ｍｍｏｌ／Ｌ时
扩增所得电泳条带清晰，多态性相对较好。结合正交
试验结果，选择０．４ｍｍｏｌ／Ｌ作为ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体
系中ｄＮＴＰ的最佳浓度。
图５　ｄＮＴＰ浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增
效果的影响（引物为ＵＢＣ８３５）
２．６　引物浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
引物浓度与扩增产物质量相关，浓度偏高产生
错配和非特异性扩增产物几率高，引物二聚体的形
成几率大；浓度太低导致有效扩增条带减少。图６
中各引物浓度扩增产生的电泳条带一致，当浓度为
０．６μｍｏｌ／Ｌ时条带亮度降低，浓度为０．３、０．４、
０．５μｍｏｌ／Ｌ时，反应稳定，条带清晰，基本一致，扩
增效果无显著差别，综合考虑正交试验结果，选择
０．３μｍｏｌ／Ｌ作为ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中引物的最
佳浓度。
２．７　模板ＤＮＡ浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的影响
ＤＮＡ模板浓度范围由所研究的物种、类群以及
ＤＮＡ模板纯度所决定。浓度过低致使扩增产物不
稳定，过高则可能出现非特异性扩增［１６］，但在一定
浓度范围内ＩＳＳＲ反应对模板含量不甚敏感。大量
的研究表明ＩＳＳＲ－ＰＣＲ对ＤＮＡ模板的要求并不严
格，浓度对ＰＣＲ反应体系的影响，不同的试材获得
的数据不尽相同［１７－２１］。本研究结果表明，ＤＮＡ浓度
在２０～８０ｎｇ范围内对扩增结果的一致性无明显影
响（图７），因此选定Ｌ１６（４５）设计中优势组合１４组中
ＤＮＡ浓度８０ｎｇ。
３　讨论
在ＰＣＲ反应体系中，Ｔａｑ酶、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ和
引物是４个主要的影响因子。物种不同，试验条件
不同，各因子之间相互影响产生的扩增结果也不同。
在本研究中不同处理间存在差异，因此需要对这些
因子的浓度进行优化，选取最佳组合。Ｔａｑ酶用量
是影响试验结果的重要因素之一，Ｔａｑ酶浓度高不
仅容易产生非特异性扩增产物，而且试验成本高；
Ｔａｑ酶浓度过低则容易造成新链的合成效率下降。
ＴａｑＤＮＡ聚合酶还是 Ｍｇ２＋的依赖性酶，对 Ｍｇ２＋浓
度非常敏感。Ｍｇ２＋浓度也是影响ＰＣＲ结果的重要
·３９·
２０１２
变量之一，Ｍｇ２＋浓度能影响反应的特异性和扩增片
段的产率。本试验在 Ｍｇ２＋浓度范围内低浓度下的
扩增效果差于高浓度。底物ｄＮＴＰ浓度过高，造成
延伸时核苷酸错误掺入，引起错配。浓度过低，不仅
会影响扩增效率，而且会因ｄＮＴＰ过早消耗而使产
物单链化，降低了ＰＣＲ产物的产量。引物浓度影响
扩增产物的质量，浓度偏高会引起错配和非特异性
扩增，浓度太低则无法进行有效扩增。
另外，循环次数、退火温度以及延伸时间的确定
也是反应体系建立与优化的重要内容。但在本试验
中，上述３种因子对扩增结果的影响不明显，可能与
引物的特异性较强以及本试验建立的牛筋草ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ扩增体系比较稳定有关，导致反应体系对反应
条件的变化具有较强的承受能力。延伸时间的长短
和扩增片段的长度有关，两者呈正相关。对于低浓
度模板的扩增，则需要稍延长延伸时间，但延伸时间
过长会导致非特异性扩增带的出现。本试验延伸时
间为１ｍｉｎ时，产物稳定且带型丰富适合牛筋草ＩＳ－
ＳＲ－ＰＣＲ体系。
目前主要有单因素水平优化试验和正交优化设
计试验两种方法应用于ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系的建立和优
化。单因子试验主要针对每个影响因子的不同水平
进行分别优化，多被应用于ＰＣＲ反应体系中各因子
情况都有一定了解的体系；正交优化设计试验主要针
对各因子影响程度未知的情况，利用正交设计，综合
考查各种因素及其交互作用，得出体系反应中各影响
因子的最佳组合。本研究同时采用以上两种方法，综
合优化分析，增加了试验结果的可靠性，为后续牛筋
草的遗传多样性分析奠定了技术和理论基础。
正交设计采用直观分析，有的研究还采用方差分
析法对试验结果进行分析［２２］，但这仍不可避免由主观
打分造成试验误差。且ＰＣＲ受制约因素比较多，加
之ＩＳＳＲ大部分情况下是显性标记，不能区分纯合体
与杂合体［２３］，因此尽量在相同的条件下进行扩增反应
是使试验成功的决定因素。建立客观的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
扩增结果评价标准有助于该方法更好地应用。
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ｌａｙｓｉａ［Ｃ］∥Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ（Ｂ）１７ｔｈ　Ａｓｉａｎ－ｐａｃｉｆｉｃ　Ｗｅｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ
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ｎｏｍｅ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，
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ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｔｏ　ＲＦＬＰ　ａｎｄ　ＲＡＰＤ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ
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