全 文 ：215 　高山红景天原生质体培养与植株再生 :将纯化
的原生质体密度调到 2 ×105 个/ mL ,在黑暗条件下
进行液体浅层培养 ,经 3 d 可见第 1 次细胞分裂 (图
322) ,图 323、4 为液体浅层培养 14 d 和 20 d 形成细
胞团的情况。在液体浅层培养约 40 d 时 ,可形成图
325 中肉眼可见的愈伤组织。经过 2～3 d 的弱光培
养锻炼 ,将愈伤组织转移到培养基 MS + 2 mg/ L 62
BA + 015 mg/ L NAA 上进行光照培养。继续培养约
45 d 时 ,愈伤组织生长十分旺盛 ,并有少量芽体萌发
(图 326) 。挑选鲜绿色愈伤组织转入芽分化培养基
MS + 1 mg/ L 62BA + 011 mg/ L NAA 进行芽诱导 ,待
小芽长至 210 cm 左右 ,切下转入 1/ 2MS 生根培养基
上形成完整植株 (图 327) ,再生苗移栽温室 1 个月的
情况见图 328。
3 　结语
目前 ,高山红景天的人工栽培需 4～5 年 ,通过原
生质融合的方式获得多倍体种质是提高其药用成分、
缩短栽培年限的可行性途径之一。高山红景天的原
生质体培养研究在国内外尚未见报道 ,本研究结果为
高山红景天的多倍体育种等研究提供了科学依据。
参考文献 :
[ 1 ] 　刘剑锋 ,阎秀峰 ,程云清 ,等1 高山红景天 ( Rhodiola sachalin2
ensis A1 Bor)茎尖包埋—玻璃化法超低温保存与植株再生
[J ]1浙江大学学报 :农业与生命科学版 , 2007 , 33 ( 3) : 2652
2701
[ 2 ] 　刘剑锋 ,阎秀峰 ,程云清 ,等1 高山红景天愈伤组织的玻璃化
法保存及植株再生[J ]1北京林业大学学报 ,2007 ,29 (2) :1472
1511
[ 3 ] 　石铁源 ,全雪丽 ,张美淑 ,等 1 高山红景天栽培条件探讨 [J ]1
中药材 ,2006 ,29 (2) :10721081
[ 4 ] 　石铁源 ,郑明焕 ,李熙英 ,等 1 高山红景天育苗技术 [J ]1林业
科技 ,2006 ,31 (2) :602621
[ 5 ] 　阎秀峰 ,王　洋 ,于　涛 ,等1 红景天的栽培采收方法[ P]1中
国专利 :CN1579134 ,20042052191
[ 6 ] 　阎秀峰 ,王　洋 ,尚辛亥 ,等1 温室栽培光强和光质对高山红
景天生物量和红景天甙含量的影响 [J ]1生态学报 ,2003 ,23
(5) :84128491
[7 ] 　Kanchanapoom K , Jantaro S , Rakchad D1 Isolation and Fu2
sion of protoplast s f rom mesophyll cells of Dendrobium pom2
padour [J ]1 Sci A sia , 2001 , 27 : 292341
[ 8 ] 　Mandal P , Sikdar S R1 Plant regeneration f rom mesophyll
protoplast s of Rori p pa indica (L1 ) Hiern , a wild crucifer
[J ]1 Curr Sci , 2003 , 85 (10) : 1451214541
[ 9 ] 　刘剑锋 ,阎秀峰 ,程云清 ,等1 高山红景天叶片愈伤组织诱导
与植株再生[J ]1东北林业大学学报 ,2007 ,35 (2) :332341
[ 10 ] 　唐克轩1 中草药生物技术[ M]1上海 :复旦大学出版社 ,20051
夏枯草 ISSR分子标记技术的建立与体系优化
廖 　丽 ,郭巧生 3
(南京农业大学中药材研究所 ,江苏 南京 　210095)
摘 　要 :目的 　建立并优化夏枯草 ISSR2PCR 反应体系和扩增程序 ,为探讨夏枯草种质间遗传多样性奠定基础。
方法 　采用单因子试验和正交设计方法 ,研究 Mg2 + 、dN TP、引物、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA、退火温度及循环
次数对 PCR 扩增的影响。结果 　夏枯草 ISSR2PCR 的最佳反应体系为 :在 20μL 的反应体系中含模板 DNA 30
ng ,Mg2 + 212 mmol/ L 、dN TP 175μmol/ L 、引物 0175μmol/ L 、Taq DNA 聚合酶 110 U。在此基础上 ,从 92 条引物
中筛选出 18 条扩增稳定、多态性丰富的 ISSR 引物 ,并通过梯度 PCR 试验 ,确定引物最佳退火温度。结论 　采用
单因子试验和正交设计方法可以快速建立 ISSR2PCR 反应体系 ,经过 24 份夏枯草种质检验 ,证明该体系稳定可靠 ,
可用于夏枯草遗传分析。
关键词 :夏枯草 ; ISSR2PCR ;正交设计 ;单因子试验
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0721131205
Establishment of ISSR marker technology and optimization of its system in Prunella vul ga ris
L IAO Li , GUO Qiao2sheng
( Institute of Chinese Medicinal Materials , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , China)
Abstract : Objective 　To establish and optimize t he ISSR2PCR reaction system for Prunel l a v ul garis
and lay foundation for it s genetic diversity research1 Methods 　The single2factor and ort hogonal design
were applied for optimizing seven factors in t he ISSR2PCR reaction system including Mg2 + , dN TP , p rim2
·1311·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
3 收稿日期 :2008210228　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30772730)
作者简介 :廖　丽 (1981 —) ,女 ,江西乐安人 ,博士研究生。E2mail :fafu301 @yahoo1con1cn3 通讯作者　郭巧生　Tel : (025) 84396591 　E2mail :gqs @njau1edu1cn
ers , T aq DNA polymerase , t he template DNA , annealing temperat ure , and cycles1 Results 　The suitable
PCR reaction system contained 212 mmol/ L Mg2 + , 175μmol/ L dN TP , 0175μmol/ L primer , 110 U T aq
DNA polymerase , and 30 ng template DNA in total 20μL reaction solution1 On this basis , 18 primers
were screened wit h stable amplification and rich polymorp hism f rom 92 ISSR primers1 The optimal annea2
ling temperature for ISSR2PCR reaction was proposed by gradient PCR1 Conclusion 　It is a way to estab2
lisb t he ISSR2PCR system for orthogonal design combining with single2factor test1 And it is p roved to be
stable and credible for t he result of 24 P1 v ul g aris pop ulations1 This optimized ISSR reaction system
would provide t he basis for t he genetic analysis of P1 v ul g aris1
Key words : Prunel l a v ul garis L1 ; ISSR2PCR ; ort hogonal design ; single factor test
　　夏枯草 Prunel l a v ul garis L1 为唇形科夏枯草
属多年生草本植物 ,其干燥果穗为我国传统大宗药
材。目前夏枯草以野生资源为主 ,广泛分布于江苏、
安徽、浙江、河南等地 ,复杂的野生环境使其产生丰
富的遗传变异。本课题组收集了全国 15 个省 (市)
种质资源 ,开展了夏枯草种子萌发、栽培生理、药材
内在质量等方面研究[1 ,2 ] ,发现其种内植株形态和
内在质量差异显著。因此 ,从分子水平对夏枯草进
行种质鉴定和遗传多样性分析以控制其药材质量变
得日益重要。
简单序列重复区间扩增 (inter simple sequence
repeat s , ISSR)是在微卫星技术上发展起来的一种
新型分子标记技术 ,具有多态性高 ,稳定性好 ,产物
特异性强等特点[3 ] ,已被广泛应用于植物的品种鉴
定、遗传作图、基因定位、分类与进化等诸多领
域[4～7 ] 。但其稳定性易受 PCR 体系中 T aq 酶、
Mg2 + 、引物、dN TP 及扩增程序中退火温度、循环次
数等多个因素的影响。因此 ,本研究采用正交和单
因素相结合实验设计 ,建立夏枯草 ISSR2PCR 最佳
反应体系 ,并对扩增反应中的退火温度、延伸时间以
及循环次数进行筛选 ,获得 ISSR2PCR 反应的最佳
扩增程序 ,为今后夏枯草种源鉴定、遗传多样性、亲
缘关系、优良性状标记等奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料与仪器 :试验所用的 24 份夏枯草采自江
苏、安徽、河南、浙江等主产区 ,经南京农业大学郭巧
生教授鉴定。其中用于体系优化和引物筛选试验源
自江苏南京 ,其他材料均用作体系验证。DNA 扩增
采用的是 MJ Research 公司的 P TC2200 TM PCR 仪。
图像分析采用上海培清科技有限公司 J S2380 自动
凝胶图像分析仪。ISSR 引物购自上海生兴生物工
程公司 ,dN TP、T aq酶和 DNA Marker 购自上海申
能博彩有限公司。
112 　方法
11211 　基因组 DNA 提取 :以夏枯草嫩叶为材料 ,
采用 CTAB 法提取基因组 DNA [8 ] ,用 110 %琼脂糖
电泳和核酸检测仪检测 DNA 质量浓度 ,并稀释至
30 ng/μL 。
11212 　ISSR2PCR 反应体系正交试验设计 :采用
L 16 (45 ) 正交试验设计 ,对 Mg2 + 、dN TP、引物、T aq
酶和模板 DNA 进行 5 因素 4 水平筛选 ,见表 1。根
据表 1 制备总体积为 20μL 的反应体系 ,除表中变
化因素外 ,每管中还含有 2μL 10 ×PCR Buffer ,引
物选用 (AC) 8 TA ,PCR 扩增程序为 :94 ℃预变性 5
min ;94 ℃变性 45 s ,退火 45 s ,72 ℃延伸 90 s ,45
个循环 ;72 ℃延伸 5 min ,4 ℃保存。扩增反应结束
后 ,PCR 产物在 210 %琼脂糖凝胶上电泳 ,凝胶中含
0105 %的溴化乙锭 ,电极缓冲液为 1 ×TA E ,电压 5
V/ cm 电泳结束后在凝胶成像分析仪上观测分析并
照相。
表 1 　ISSR2PCR正交试验设计 L16 ( 45 )
Table 1 　Orthogonal design for ISSR2PCR L16 ( 45 )
处理
组合
因　素
dN TP/
(μmol ·L - 1)
引物/
(μmol ·L - 1)
Mg2 + /
(μmol ·L - 1)
Taq DNA
聚合酶/ U
DNA/
ng
1 125 01 50 11 6 01 5 15
2 125 01 75 11 9 11 0 30
3 125 11 00 21 2 11 5 45
4 125 11 25 21 5 21 0 60
5 175 01 50 11 9 11 5 60
6 175 01 75 11 6 21 0 45
7 175 11 00 21 5 01 5 30
8 175 11 25 21 2 11 0 15
9 225 01 50 21 2 21 0 30
10 225 01 75 21 5 11 5 15
11 225 11 00 11 6 11 0 60
12 225 11 25 11 9 01 5 45
13 275 01 50 21 5 11 0 45
14 275 01 75 21 2 01 5 60
15 275 11 00 11 9 21 0 15
16 275 11 25 11 6 11 5 30
·2311· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
11213 　ISSR2PCR 反应体系单因子试验 :依据正交
试验结果 ,选择扩增效果较好的反应体系 ,在此基础
上进行单因素实验 ,进一步优化影响扩增效果的因
素。其中 T aq 酶用量设置 015、110、115、210、215、
310 U 6 个梯度 ,dN TP 浓度设置 75、125、175、225、
275、325 μmol/ L 6 个梯度 , Mg2 + 浓度设置 110、
113、116、119、21 2、215 mmol/ L 6 个梯度 ,引物浓度
设置 0125、0150、0175、1100、1125、1150 μmol/ L 6
个梯度 ,DNA 模板设置 5、10、20、30、40、50、60、80、
100、120 ng 共 10 个梯度 ,除 DNA 模板外 ,以上均
为 2 次重复。每一个最佳条件确定后作为后续研究
的一个条件。
11214 　ISSR2PCR 反应程序优化 :在确定最佳反应
体系基础上 ,对退火温度、延伸时间和循环次数进行
优化筛选。根据所选引物序列计算理论退火温度
Tm ,设定退火梯度范围 ,仪器自动形成 1～12 个梯
度 ,确定最佳退火温度 ;延伸时间设 4 个处理 ,分别
为 015、1、115、2 min ;延伸温度为 72 ℃;循环次数
设 5 个处理 ,分别为 25、30、35、40 和 45 次。
11215 　引物筛选与优化体系应用 :选取 6 个模板 ,
根据 ISSR2PCR 的最佳反应体系和扩增条件进行扩
增筛选 ,并随机选取引物 (A GTC) 4 ,对我国 24 份夏
枯草种质材料进行 DNA 扩增 ,检测其稳定性。
2 　结果与分析
211 　PCR 正交设计直观分析 :根据 L 16 (45 ) 正交试
验 PCR 产物电泳结果 (图 1) ,对其从高到低依次打
分。条带数量丰富、清晰度高记为 16 分 ,与此相反 ,
最差则记为 1 分。1～16 组合分数依次为 :4、3、2、
13、7、12、6、5、16、14、11、10、15、9、8、1。以特异谱带
多态性高、背景干扰低、主带清晰、副带明显为原则 ,
同时考虑实验成本 ,确定第 9 组合为夏枯草 ISSR2
PCR 的最佳反应体系。同时 ,对 T aq 酶、Mg2 + 、
dN TP、引物和 DNA 模板 5 因素不同水平间平均值
的极差进行统计分析 ,其分别为 6125、5、7125、
3175、315 ,说明对 PCR 反应的影响从大到小依次
为 :dN TP、T aq酶、Mg2 + 、引物和 DNA 模板。
212 　单因子试验结果分析
21211 　T aq酶用量对 ISSR2PCR 的影响 :如图 2 所
示 ,随着 T aq酶用量的增加 ,扩增谱带的清晰度逐
渐增加且趋于稳定。当 T aq酶用量大于 110 U 时 ,
扩增条带最为清晰 ,同时考虑实验成本 ,确定 110 U
为 ISSR 反应体系中 T aq酶的最佳用量。
21212 　dN TP 浓度对 ISSR2PCR 的影响 :由图 3 可
知 ,dN TP 浓度为 75μmol/ L 时扩增条带弱且不全。
随着浓度的上升 ,谱带数目增多且逐渐变得更加清
晰 ,当浓度为 175μmol/ L 时谱带最清晰 ,随着浓度
的持续上升 ,谱带清晰度稍微下降。故选择 175
μmol/ L 为反应体系中的最佳浓度。
21213 　Mg2 + 浓度对 ISSR2PCR 的影响 :如图 4 所
示 ,随着 Mg2 + 浓度的增加 ,谱带数目越多且更加清
晰 ,当浓度为 212 mmol/ L 时谱带最为清晰 ,与 215
mmol/ L 之间无差异。故选择 212 mmol/ L 为最佳
浓度。
21214 　引物浓度对 ISSR2PCR 的影响 :由图 5 可
知 ,在不同引物浓度下均能扩出条带 ,随着引物浓度
的升高 ,扩增条带由弱到强 ,再由强到弱。当浓度为
0175μmol/ L 时 ,反应稳定且条带清晰 ,故选择此浓
度为最佳。
21 21 5 　模板DNA浓度对 ISSR2PCR的影响 :由图·3311·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
6 可知 ,模板浓度小于 20 ng 谱带有所缺失 ,在 20～
50 ng 时谱带多态性高 ,而超过 50 ng 时 ,谱带强度
减弱 ,故选择 30 ng 为最佳模板浓度。
213 　ISSR2PCR 反应程序优化
21311 　循环次数对 ISSR2PCR 的影响 :图 7 显示随
着循环次数的增加 ,扩增产物的量也增多 ,循环次数
小于 30 时 ,几乎没有谱带 ,而 45 个循环得到的条带
强弱合适 ,清晰可辨 ,为最佳循环次数。
21312 　延伸时间对 ISSR2PCR 的影响 :延伸时间的
长短与扩增片断的长度呈正相关。由图 8 可知 ,30
s 延伸时间过短 ,无法完成扩增造成谱带缺失 ;在
115 min 时 ,获得稳定扩增 ,为最佳延伸时间。
21313 　退火温度对 ISSR2PCR的影响 :图9为引物 (AC) 8 T G的梯度退火 PCR ,退火温度过低时杂带多 ;退火温度过高 ,引物与模板结合差 ,条带较弱 ,故ISSR25 引物的最适退火温度为 5311 ℃。采用同样的方法得到其余引物的最适退火温度 (表 2) 。214 　ISSR2PCR正交反应体系应用 :应用夏枯草 ISSR反应的最佳体系 ,从 92 个 ISSR 引物中筛选出 18 个扩增稳定、多态性高的引物 (表 2) 。图 10 为以 (A GTC) 4为引物运用最优组合对 24 份夏枯草种质材料进行DNA 扩增图。该图 DNA 谱带清晰、重复性好、多态性高 ,表明已确立的 ISSR2PCR反应体系稳定可靠。3 　讨论ISSR2PCR 反应体系的优化方法多采用正交或单因素设计 ,正交设计可以更快更有效地分析不同因素的互相作用 ,但处理水平的设置相对有限 ,单因
·4311· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
表 2 　ISSR引物和最佳退火温度( Tm)
Table 2 　ISSR Primers and optimal annealing temperature ( Tm)
引物 序列 Tm/ ℃ 引物 序列 Tm/ ℃ 引物 序列 Tm/ ℃
ISSR24 (AC) 8 A G 5216 ISSR226 (AC) 8 CC 5419 ISSR261 (A G) 8 GT 521 6
ISSR25 (AC) 8 T G 5311 ISSR233 (A G) 8 A T 5013 ISSR263 (A G) 8 CT 521 6
ISSR210 ( GAA) 6 4518 ISSR242 (AC) 8 CG 5419 ISSR268 ( TC) 7 A G 491 2
ISSR217 ( GACA) 4 4912 ISSR244 (AC) 8 GA 5216 ISSR269 ( TC) 7 T G 491 2
ISSR223 (AC) 8 TA 5013 ISSR246 (AC) 8 GG 5419 ISSR276 (A GTC) 4 491 2
图 10 　优化的 ISSR2PCR反应体系对 24 份夏枯草
种质 DNA扩增结果
Fig110 　Electrophoregram of 24 P1 vulga ris DNA
with optimized ISSR2PCR reaction system
素设计可以较系统和精细地研究各主要因子的影
响 ,但无法探讨因素间互作效应。本实验首先采用
正交设计筛选出可扩增出条带的 PCR 反应体系 ,然
后结合单因子设计进一步优化体系 ,弥补上述实验
不足 ,可以简单快速地建立夏枯草 ISSR2PCR 反应
体系 ,得到稳定且多态性丰富的扩增谱带。
ISSR 是基于 PCR 反应的分子标记技术 ,在进
行 PCR 扩增反应时 ,引物与模板结合后在 T aq 酶
作用下进行延伸 , T aq DNA 聚合酶是 Mg2 + 依赖性
酶 ,受 Mg2 + 的浓度影响 ,而 Mg2 + 又受 dN TP 的拮
抗作用 ,任何因素浓度过高或过低 ,都将影响扩增产
物的质量 ,引起错配和非特异性产物扩增 ,增加引物
二聚体的形成几率。本研究显示 , ISSR2PCR 反应
对模板和引物浓度要求不十分严格 ,低浓度即有扩
增 ,但对 Mg2 + 和 dN TP 浓度要求较为严格 ,低浓度
根本无法扩出条带。通过极差分析 ,dN TP 对 PCR
反应影响最大 ,DNA 模板影响最小。因此 ,最终建
立夏枯草 ISSR2PCR 的最佳反应体系为 :在 20μL
的反应体系中含2μL 1 0 ×PCRBuffer , Mg2 + 21 2
mmol/ L , dN TP 175 μmol/ L ,引物 0175 μmol/ L ,
T aq DNA 聚合酶 110 U 和模板 DNA 30 ng。
在 ISSR2PCR 反应程序中 ,退火温度、延伸时间
和循环次数对其有显著影响 ,其中退火温度影响最
大 ,温度过低将导致适当的错配 ,从而扩大引物在基
因组上配对的随机性 ,而温度过高虽可以提高引物
与模板结合的专一性 ,却会降低引物与模板的结合
程度[9 ] 。本研究显示 ,夏枯草 ISSR 特异性引物退
火温度以 50～55 ℃为主。通过单因素实验 ,确定
ISSR2PCR 扩增程序为 :94 ℃预变性 5 min ;94 ℃变
性 45 s ,退火 45 s ,72 ℃延伸 90 s ,45 个循环 ;72 ℃
延伸 5 min ,4 ℃保存。
参考文献 :
[ 1 ] 　张贤秀 ,郭巧生 ,王艳茹1 种子引发对夏枯草种子活力影响的
初步研究[J ]1中国中药杂志 ,2008 ,33 (3) :49324951
[ 2 ] 　廖　丽 ,郭巧生 ,刘　丽 ,等1 夏枯草总黄酮提取方法及其在居
群间分布特征研究[J ]1中国中药杂志 ,2008 ,33 (4) :65126531
[ 3 ] 　Ziet kiewicz E , Rafalski A , Labuda D1 Genome fingerprinting
by simple sequence repeat ( SSR) anchored polymerase chain
reaction amplification [J ]1 Genomes , 1994 , 20 (2) : 17621831
[ 4 ] 　钱　书 ,葛　颂 ,洪德元1 采用 RAPD 和 ISSR 标记探讨中国
疣粒野生稻的遗传多样性 [J ]1 植物学报 , 2000 , 42 ( 7) : 7412
7501
[ 5 ] 　周延清 ,景建洲 ,李振勇 ,等1 怀区地黄遗传多样性的 ISSR 鉴
定[J ]1中草药 ,2005 ,36 (2) :25722611
[ 6 ] 　罗玥佶 ,伍贤进 ,彭　帅 ,等112 种翻白草种质资源遗传多样性
的 ISSR 分析[J ]1中草药 ,2008 ,39 (5) :74827511
[ 7 ] 　王　翀 ,周天华 ,杨 　雪 ,等1 ISSR2PCR 鉴别绞股蓝属 7 种植
物[J ]1中草药 ,2008 ,39 (4) :58825911
[ 8 ] 　邹喻苹 ,葛 　颂 ,王晓东 1 系统与进化植物学中的分子标记
[ M]1北京 :科学出版社 ,20011
[ 9 ] 　沈 　颖 ,徐 　程 ,万小凤 ,等1 ISSR2PCR 在石斛种间鉴别中的
应用[J ]1中草药 ,2005 ,36 (3) :42324271
·5311·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月