全 文 ：基金项目:安徽科技学院引进人才专项(ZRC2007147) ;安徽科技学院引进人才专项(ZRC2007135)。
作者简介:赵岩(1978 －) ，女，吉林四平人，硕士，助教，研究方向:生物工程。 收稿日期:2010 － 07 － 11
矮牵牛组培苗 3 种 RNA提取方法的比较
赵 岩1 邓 盾1 孙玉军1 崔广荣2
(1 安徽科技学院生命科学学院，安徽凤阳 233100;2 安徽科技学院植物科学学院，安徽凤阳 233100)
摘 要:为了提取高质量的矮牵牛 RNA，采用改良的异硫氰酸胍方法和 CTAB 法、SDS 法分别提取矮牵牛组培苗
RNA。结果表明:与传统的 CTAB和 SDS方法相比，改进的异硫氰酸胍方法提取的总 RNA电泳条带完整、纯度较高，
是较为理想的提取矮牵牛总 RNA的方法。
关键词:矮牵牛;RNA提取;CTAB法;SDS法;异硫氰酸胍法
中图分类号 Q781 文献标识码 A 文章编号 1007 － 7731(2010)15 － 24 － 02
Comparing of Three Methods for Total RNA Extraction from Petunie hybrida Tissue Culture Plantlet
Zhao Yan1 et al．
(1 College of Life Science，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China;2 College of Botany，Anhui
Science and Technology University，Fengyang 233100，China)
Abstract:In this experiment，three extraction methods had been applied to obtain high level RNA from petunie hybrida，in-
cluding CTAB method，SDS method and Guanidinium isothiocyanate method． The results indicated that the Guanidinium iso-
thiocyanate method was perfect for the highest RNA band’s integrity and RNA purity．
Key words:Petunie hybrida Tissue;RNA extration;CTAB method;SDS method;Guanidinium isothiocyanate method
矮牵牛(Petunia hybrida) ，别名杂种撞羽朝颜、碧冬
茄，为茄科矮牵牛属多年生草本植物。矮牵牛花多而色彩
丰富，花期长，适应性强，是园林中应用较多的花卉，适于
花坛及自然式布置［1］，矮牵牛花型奇特，花色丰富，花期长
达数月之久，又在干热少花的夏季开放，适应性强，因此深
受人们的喜爱，被喻为“世界花坛花卉之王”［2］。RNA 是
植物分子生物学研究的重要对象之一。高质量的 RNA是
后续 RT － PCR、Northern杂交、cDNA文库构建等分子生物
学研究的基础。因此，选择适合某种植物的 RNA 提取方
法有着重要的理论和科研价值［3］。RNA 的提取方法很
多，比如 Trizol 法、异硫氰酸胍法、CTAB 法、尿素法、SDS
法、热硼酸盐法等，这些方法各有优缺点，不同的方法适用
于不同类型的材料，根据材料自身的物理化学特性而
定［4］。本试验对 CTAB 法、SDS 法、异硫氰酸胍法提取矮
牵牛组培苗叶片 RNA 效果进行比较，力图筛选出适合矮
牵牛组培苗 RNA提取的方法。
1 材料与方法
1. 1 材料 矮牵牛组培苗由安徽科技学院生物技术中心
提供。
1. 2 主要化学试剂 碳酸二乙脂、异硫氰酸胍、柠檬酸
钠、十二烷基肌氨酸钠、Tris、酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼
脂糖等均为国产分析纯。
研钵用氯仿润洗消毒后，与枪头、离心管等用具于高
压灭菌锅中灭菌 2h以上，烘干，存于冰箱中冷冻备用。实
验中所用的提取液及各种液态试剂都加 1‰的 DEPC 于
37℃放置过夜以抑制其中 RNA酶活性。
1. 3 总 RNA提取方法
1. 3. 1 异硫氰酸改良法 (1)取 0. 1g 叶片，加液氮研磨
成粉末。(2)迅速将细粉转移至含有 1mL 抽提缓冲溶液
(4mol /L异硫氰酸胍，25mmol /L 柠檬酸钠 pH7. 0)的离心
管中。(3)冰浴 30min，并不时轻摇。(4)4℃下 5000r /min
离心 20min 。(5)上清液转移入另一离心管中，依次加入
0. 2mL 2mol /L NaAc(pH4. 0)、2mL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶
24∶ 1)、0. 5mL 无水乙醇。(6)混匀，冰浴 15min。(7)4℃
下 5000r /min离心 20min。(8)上清液转移入另一离心管
中，加入等体积的 2mol / l KAc(pH4. 8)。(9)冰浴 30min。
(10)4℃下 5000r /min离心 20min 。(11)上清液转移入另
一离心管中，迅速加入等体积的异丙醇。(12)－ 20℃放置
45min。(13)4℃下 5000r /min 离心 20min。(14)弃上清;
用 1mL70 % 乙醇洗涤 2 次。(15)干燥后加入 400μL
DEPC水溶解沉淀，转入 2mL离心管中，加入 100μL10mol /
L LiCl，混匀。(16)4℃放置过夜。(17)4℃下 12000r /min
离心 20min。(18)弃上清，沉淀用 70%乙醇洗涤 2 次，干
燥后加入 100μL 的 DEPC 水溶解，置于 － 20℃ 保存
42 安徽农学通报，Anhui Agri. Sci. Bull. 2010，16(15)
DOI:10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2010.15.080
备用［9］。
1. 3. 2 CTAB法 参照 Fort F等人的方法进行［5］。
1. 3. 3 SDS法 参照 Ikegami H等人的方法进行［6］。
1. 3. 4 RNA 纯度及其完整性检测 取 RNA 样品，用
DEPC 水稀释 30 倍，混匀后用 756 型分光光度计测定
260nm 和 280nm 波长下的吸收值，计算 OD260nm /
OD280nm以检测样品的纯度和浓度。用 1. 0%琼脂糖凝
胶在 0. 5 × TBE 缓冲系统下电泳，电泳后用 Alphalmager
TMIS2200凝胶成像仪成像分析。
2 结果与分析
2. 1 琼脂糖凝胶电泳结果分析 琼脂糖凝胶电泳是提取
总 RNA质量检测的重要方法，结果如图 1所示。
图 1 三种提取方法所得矮牵牛组培苗总 RNA电泳图
注:1 为 CTAB，2 为异硫氰酸胍，3 为 SDS。
从图 1中可以看出 CTAB法和 SDS法提取的 RNA亮度
较低，仅为异硫氰酸胍法提取 RNA条带亮度的 1 /3左右，且
CTAB法提取的 RNA 28S和 18S两条带型模糊不清，没有 5S
条带。SDS法提取的 RNA有拖尾现象，说明 RNA样品有降
解;异硫氰酸胍法所得 RNA 电泳条带尤为清晰，有明亮的
28S、18S的 rRNA条带，而且 28S条带的亮度约是 18S条带亮
度的 2倍，同时还有模糊不清的 5SrRNA的条带，说明提取的
RNA完整性较好，降解少。从图 1还可以看到用异硫氰酸胍
法提取 RNA时，有明亮清晰的 DNA条带，说明此方法适用于
矮牵牛总 DNA的提取。
表 1 不同提取法所得矮牵牛总 RNA的质量比较
提取方法 OD260 OD280 OD260 / OD280
SDS法
CTAB法
异硫氰酸胍法
0. 214
0. 281
0. 431
0. 110
0. 171
0. 230
2. 00
1. 65
1. 87
2. 2 紫外分光光度检测结果分析 用 3 种不同方法提取
的矮牵牛组培苗总 RNA 经紫外分光光度计检测，计算
RNA的纯度，结果见表 1。
从表 1 的结果可以看出，SDS 法提取的总 RNA 的
OD260 /OD280 值为 2. 00，说明 RNA 的纯度不是很高，存
在一定的污染。CTAB法提取的 RNA的 OD260 /OD280值
为 1. 65，说明有蛋白质、酚等污染。异硫氰酸胍法提取的
RNA的 OD260 /OD280 值为 1. 87，说明提取的 RNA 纯度
相对较高，因此异硫氰酸胍法提取的 RNA 可用于矮牵牛
组培苗常规下游分子生物学实验。
3 讨论
CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法是从真核细胞中提取
总 RNA常用的方法，在许多植物中均可得到高质量的
RNA。CTAB法成本低廉，且能够有效地去除样品中的蛋
白质、多糖、多酚等物质，一般提取的 RNA完整性好、纯度
高，但是不适用矮牵牛 RNA的提取。在 RNA 提取的过程
中，糖类物质由于其结构性质与 RNA 类似，易于与 RNA
结合在一起，在实验过程中很难除净，含有高浓度糖的
RNA不易溶于水，很难用于分子生物学实验，根据赵双宜
对 RNA提取方法的研究，在氯仿异丙醇除糖的过程中联
合使用了醋酸钠，高浓度钠离子的存在可以提高酚氯仿除
糖的效率，因此，本实验酚氯仿异戊醇抽提步骤中加入了
醋酸钠［7］，并且有文献报道低浓度的乙醇有很好的除糖效
果，在此步骤中又加入了 1 /10体积的无水乙醇，保证糖类
物质的去除;用氯化锂也可以沉淀 RNA，使糖类物质留在
上清液中，因此在后续步骤中，又加入了氯化锂过夜沉淀
除糖的步骤。结果表明使用改良的异硫氰酸胍法提取的
RNA完整性较好，降解很少，28SrRNA和 18SrRNA条带清
晰可见，OD260 /OD280值相对较高，可为以后的下游实验使
用。本实验的异硫氰酸胍提取法采用小样本提取，在各个
步骤中所需试剂及总体积均较小，使实验便于操作。
分离完整的总 RNA是对矮牵牛进行分子生物学研究
的基础和前提，本研究提取的 RNA，可以用于从分子生物
学的角度分析和研究矮牵牛的一些特性，对矮牵牛的分子
生物学研究打下良好的基础。
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5216 卷 15 期 赵岩等 矮牵牛组培苗 3 种 RNA提取方法的比较