全 文 ：基因组学与应用生物学，2013年，第 32卷，第 3期，第 409-412页
Genomics and Applied Biology, 2013, Vol.32, No.3, 409-412
技术专题
Technology Feature
神秘果果实总 RNA提取方法比较研究
谭才邓 1,2* 李静 1,2 邓毛程 1,2
1广东轻工职业技术学院,广州, 510300; 2广东高校特色调味品工程技术开发中心,广州, 510300
*通讯作者, tcdeng@126.com
摘 要 以神秘果果实为材料，以获得高质量 RNA为目的，以针对性地去除多糖、酚类物质为出发点，比较
了 Trizol法、CTAB法，并相应加以改良。结果显示：CTAB粗提法方便快捷，CTAB精提法提取的总 RNA完
整性好、纯度高，RT-PCR反应表明提取的总 RNA都能满足分子生物学实验的要求。
关键词 神秘果,果实, RNA提取
Study on Total RNA Extraction Methods from Miracle Fruit
Tan Caideng 1,2* Li Jing 1,2 Deng Maocheng 1,2
1 Guangdong Industry Technical College, Guangzhou, 510300; 2 Centre of Guangdong Higher Education for Engineering and Technological
Development of Speciality Condiments, Guangzhou, 510300
* Corresponding author, tcdeng@126.com
DOI: 10.3969/gab.032.000409
Abstract In order to extract total RNA form miracle fruit and reduce the influence of polysaccharides and
polyphenolics, we studied and compared four RNA extraction methods such as Trizol method, Trizol improved
method, CTAB crude method and CTAB refined method. The results showed that: The CTAB crude extraction
method was convenient and quick, total RAN from the CTAB refined method was proved to be relatively intact and
high purity, RT-PCR analysis showed that the total RNA from both CTAB methods could be used in further
molecular biology research.
Keywords Miracle fruit, Fruit, RNA isolation
基金项目：本研究由“广东高校特色调味品工程技术开发中心”开放课题项目(GCZX-B1103)资助
神秘果(Synsepalum dulcificum)属于山榄科神秘
果属，原产西非，自 20世纪 60年代引入中国，在海
南、广东、广西等省区种植。神秘果果肉中含有一种
特异的糖蛋白——神秘果素(miraculin)，能够改变人
的味觉，食用酸味食物但感觉是甜味。近年来，科学
工作者开始对其作用机理进行研究。
分子生物学研究中，基因的克隆、Northern杂交、
cNDA文库构建等实验都以获得高质量 RNA为基
础，而从果实中提取高质量的 RNA往往十分困难。神
秘果素只在果实中表达(Hiwasa-Tanase et al., 2012)，
而神秘果果实中含有丰富的酚类物质、色素及多糖，
这些物质往往对 RNA的提取有很大的影响。本试验
以神秘果成熟果实为材料，参考 Trizol 试剂法与
CTAB提取法并加以改进，以探索出一个快捷有效
并能满足分子生物研究的总 RNA提取方法，为对神
秘果素的进一步研究提供参考。
1结果与分析
1.1 RNA样品浓度与纯度分析
采用 4种方法提取神秘果果肉总 RNA，所得样
品在 220~320 nm紫外波长范围内进行扫描以检测
其浓度与纯度，结果见图 1与表 1。
由图 1与表 1可看出，Trizol提取法及其改良法
提取得到的 RNA 样品质量低，OD260/OD280 均小于
1.2，远远达不到 1.8~2.0的标准，而且浓度很低，小于
40 μg/mL，另外 OD230值相对很高，表示多糖等杂质含
量相对较多。而 CTAB法得到的 RNA样品质量较
好，其中粗提法的总 RNA 浓度为 192.5 μg/mL，
OD260/OD280为 1.93，OD260/OD230为 2.51，表示总 RNA
样品纯度高，但有部分被降解；精提法的总 RNA浓度
为 304.5μg/mL，OD260/OD280为 1.94，纯度高，OD260/OD230
为 2.12，表示总RNA样品纯度高，降解度小。
1.2 RNA完整性分析
为了检测提取所得的总 RNA完整性，进行了变
性琼脂糖凝胶电泳，结果见图 2。
由图 2可知，Trizol提取法与 Trizol改良法所得
的 RNA样品没有明显带条，表示含量非常低，可能
图 1 220~320 nm紫外波长范围内总 RNA样品扫描曲线
注: A: Trizol提取法; B: Trizol改良法; C: CTAB粗提法; D: CTAB精提法
Figure 1 Scanning curve from 220 nm to 320 nm of total RNA extracted from miracle fruit with different methods
Note: A: Trizol method; B: Trizol improved method; C: CTAB crude method; D: CTAB refined method
表 1不同方法提取神秘果果实总 RNA的浓度和吸光度比值
Table 1 Concentrations and absorbance ratio of total RNA extracted from miracle fruit with different methods
方法
Methods
Trizol提取法
Trizol method
Trizol改良法
Trizol improved method
CTAB粗提法
CTAB crude method
CTAB精提法
CTAB refined method
OD260/OD280
0.82
1.19
1.93
1.94
OD260/OD230
0.21
0.40
2.51
2.12
RNA浓度(μg/mL)
RNA concentrations (μg/mL)
22.7
35.2
192.5
304.5
是提取过程中无法有效防止酚类物质的氧化，导致
此氧化物结合上 RNA从而形成沉淀被除去。CTAB
法的 RNA样品带条明显，并且无 DNA污染，其中精
提法的 28S rRNA带条亮度是 18S rRNA的 2倍，说
明总 RNA完整性好。
1.3 RT-PCR验证
为了检测总 RNA能否满足分子生物学实验，我
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Study on Total RNA Extraction Methods from Miracle Fruit 410
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
们进行了 RT-PCR验证实验。神秘果素存在于果肉
中，在果实成熟的过程中大量表达，我们根据其序列
设计引物进行 RT-PCR反应，PCR产物进行琼脂糖
凝胶电泳，结果见图 3。
图 2神秘果果肉总 RNA电泳图
注 : 1: Trizol 提取法 ; 2: Trizol 改良法 ; 3: CTAB 粗提法 ; 4:
CTAB精提法
Figure 2 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from
miracle fruit
Note: 1: Trizol method; 2: Trizol improved method; 3: CTAB
crude method; 4: CTAB refined method
质显得十分重要。
在现有的总 RNA提取方法当中，Trizol提取法
是非常简捷的方法，操作简单且快速，但本实验证
明，Trizol法并不适合神秘果果实 RNA的提取，就算
在 Trizol改良法中针对性地加入 2步，丙酮去除色
素类与乙二醇丁醚去除多糖类，但提取产物中总
RNA含量非常低，得不到 RT-PCR产物。
CTAB法能有效的提取神秘果果实总 RNA。提
取液中加入高浓度(2%)的 β-巯基乙醇可有效防止
多酚类物质被氧化，PVP能有效结合酚类从而除去；
LiCl能有效地沉淀 RNA而使多糖留在上清液从而
去除多糖。经过粗提法得到的总 RNA 已可满足
RT-PCR反应，所用时间约为 4 h，且操作方便快捷。
在 CTAB精提法中，用 KAc沉淀多糖，使 RNA留在
上清而进一步除去多糖，得到较纯的 RNA样品。另
外本实验还发现，RNA沉淀步骤中，-20℃沉淀过夜
的效果优于-70℃沉淀 1~2 h，可能是温度太低使得
某些物质形成沉淀从而影响 RNA的质量。
3材料与方法
3.1材料
试验材料为神秘果成熟果实，采收后液氨速冻，
于-70℃贮藏备用。
3.2主要试剂
CTAB 提取液：30 g/L CTAB，20 g/L PVP-40，
0.5 g/L 亚精胺，0.02 mol/L EDTA，0.1 mol/L Tris，
2 mol/L NaCl，用盐酸调至 pH 8.0。
配制 10 mol/L LiCl，2 mol/L LiCl，10 mmol/L
Tris-HCl (pH 7.5)，3 mol/L KAc (pH 5.5)。另外，Trizol
试剂、β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、DEPC
处理水备用。吸咀及塑料离心管用 0.1% DEPC水处
理 12 h后高压灭菌，烘干备用。
3.3总 RNA提取
方法一：Trizol提取法，0.2 g材料用 1 mL Trizol
提取液按照操作说明书进行提取。
方法二：Trizol改良法(周波等, 2004)。在加入提取
液 Trizol试剂前，0.2 g材料先用 1 mL丙醇、20 μL β-
巯基乙醇在室温下处理 20 min，4℃ 8 000 r/min 离心
10 min，去上清。另外在加入异丙醇沉淀 RNA前，
加入 1/2体积的乙二醇丁醚，冰上放置 30 min，4℃
8 000 r/min离心 10 min，取上清。其它步骤按操作说
明书进行。
图 3神秘果素基因片段 RT-PCR产物电泳图
注: M: Marker DS2000; 1: Trizol 提取法; 2: Trizol 改良法; 3:
CTAB粗提法; 4: CTAB精提法
Figure 3 Amplification of miraculin gene by RT-PCR
Note: M: Marker DS2000; 1: Trizol method; 2: Trizol improved
method; 3: CTAB crude method; 4: CTAB refined method
由上图可知，Trizol提取法与 Trizol改良法得到
的总 RNA均得不到 RT-PCR产物，因此不适合用于
神秘果果实总 RNA的提取。CTAB粗提法与 CTAB
精提法均得到 RT-PCR产物，并且产物分子量正确，
约 670 bp。由此可得出，CTAB法适合神秘果果实总
RNA的提取，能满足分子生物学实验的要求，并且
CTAB粗提法所需时间约 4 h，方便快捷。
2讨论
得到高质量的 RNA是进行分子生物学研究的最
基础的一步，不同的组织往往需要不同的提取方法。
对于植物果实总 RNA的提取，影响 RNA质量最大的
因素是多糖与酚类物质。多糖的性质与 RNA相似，在
提取过程中易与 RNA一起沉淀，在后继实验中易与
酶结合使酶失活，严重干扰实验的进行；而酚类物质
在细胞破碎时被释放出来且易被氧化，此氧化物易与
RNA不可逆地结合而形成不溶物，使 RNA丧失生物
活性(李宏, 1999)。因此，怎样有效去除多糖与酚类物
411
神秘果果实总 RNA提取方法比较研究
Study on Total RNA Extraction Methods from Miracle Fruit
方法三：CTAB粗提法(何健行等, 2010; 裴嘉博
等, 2012;张玲等, 2012)：材料去核，液氮快速研磨成
粉末，取 0.2 g材料于 2 mL塑料离心管中，加入 1 mL
CTAB提取液和 20 μL β-巯基乙醇，充分混匀，65℃
处理 30 min，15℃ 8 000 r/min离心 10 min，取上清液，
加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，4℃ 12 000 r/min离
心 10 min，取上清，加入 1/3体积 10 mol/L LiCl，混匀
后于-70℃沉淀 RNA 1~2 h (或-20℃沉淀过夜)，4℃
13 000 r/min离心 15 min，吸去上清，沉淀用 200 μL
2 mol/L LiCl悬浮，4℃ 13 000 r/min离心 5 min，沉淀
用 75%乙醇洗涤 2次，4℃ 13 000 r/min 离心 5 min，
小心吸去上清，沉淀在超净工作台中吹干，最后用
20 μLDEPC水溶解 RNA，-70℃保存备用。
方法四：CTAB精提法(何健行等, 2010; 裴嘉博
等, 2012;张玲等, 2012)：方法三得到的 RNA沉淀用
200μL10mmol/LTris-HCl (pH7.5)溶解，加入等体积的
氯仿:异戊醇(24:1)，冰上放置 10 min，4℃ 12 000 r/min
离心 10 min，取上清，加入 1/10体积 3 mol/L KAc
(pH 5.5)，冰浴 30 min，4℃ 12 000 r/min离心 15 min，
取上清，加入 2倍体积的-20℃预冷无水乙醇，混匀
后于-70℃沉淀 RNA 1~2 h (或-20℃沉淀过夜)，4℃
13 000 r/min 离心 15 min，RNA 沉淀用 75%乙醇洗
涤 2次，4℃ 13 000 r/min离心 5 min，小心吸去上清，
RNA沉淀在超净工作台中吹干，最后用 20 μL DE-
PC水溶解，-70℃保存备用。
3.4 RNA检测
浓度测定：总 RNA样品用紫外分光光度计在
220~320 nm波长范围进行扫描，检测其浓度与纯度。
电泳检测：总 RNA样品用甲醛变性琼脂糖凝胶电
泳，检测其完整性。
3.5 RT-PCR验证
以 Oligo(dT)为引物，1 μg 总 RNA，用 TaKaRa
公司的 Reverse Transcriptase XL (AMV)反转录酶进
行反转录，得到 cDNA第一链。根据神秘果素序列
(GenBank accession number AB512278)设计引物(上
游引物 FP: 5-CTCTGCATTGTTGGCAGCAG-3;下
游引物 RP: 5-GGAGCTGATCATACATGAGATG-
3)进行 PCR反应，反应体系为：1 μg DNA模板，各
1μLFP/RP (10mmol/L)，2μLdNTPMix (2.5 mmol/L)，
2.5 μL 10×Buffer，1 U KOD-Plus，ddH2O补充至总体
积 25 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性 4 min；94℃
变性 30 s，56℃退火 30 s，68℃延伸 1 min，35 个循
环；68℃终延伸 10 min。扩增产物进行 1.2%琼脂糖凝
胶电泳检测。
作者贡献
谭才邓主要负责实验的完成及论文写作；李静
和邓毛程参与部分实验并提出部分建议。
致谢
本研究获得广东高校特色调味品工程技术开发
中心开放课题项目(编号: GCZX-B1103)资助。
参考文献
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