全 文 ：紫花含笑的组织培养技术研究
朱碧华 1 ,黄宝祥 2 ,黄文超 2 ,符树根2＊　(1.江西科技师范学院 ,江西南昌 330013;2.江西省林业科学院 ,江西南昌 330032)
摘要　 [目的]为紫花含笑的开发和大量繁殖提供参考。 [方法]以紫花含笑成年树带芽茎段为材料 ,预处理后接种到诱导培养基上诱
导不定芽 ,然后分别对不定芽进行增殖和生根培养 ,研究不同外植体处理方法、培养基 、激素种类及配比对紫花含笑培养效果的影响。
[结果 ] 4℃低温预处理 5～ 7d可降低外植体的褐化及污染率;紫花含笑的最佳基本培养基为MS培养基 ,激素配比为 6-BA0.5mol/L+
IBA0.1mol/L,继代周期以 25d为宜 ,增殖系数可达 3.5以上;不定芽在培养基 1/2MS+NAA3mg/L+6-BA0.1mg/L上暗培养 15 d,
然后转入不加任何激素的 1/2MS培养基中 , 15d即可出根 ,生根率为 33%;生根苗栽于混合基质中 ,成活率可达 85%。 [结论 ]该研究
建立了紫花含笑的组织培养技术。
关键词　紫花含笑;培养基;激素
中图分类号　S603.6　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)29-14024-04
StudyonTissueCultureTechniqueforMicheliacrassipesLaw
ZHUBi-huaetal　(JiangxiNormalUniversityofScienceandTechnology, Nanchang, Jiangxi330013)
Abstract　[ Objective] TheaimwastoprovidethereferencefordevelopmentandlargescalepropagationofMicheliacrassipesLaw.[ Meth-
od] WiththestemswithtipsfromadultM.crassipestreeasthematerials, theywereinoculatedintotheinducingmediumforadventitiousbud
inductionafterpretreatment, andthentheadventitiousbudsweretakenformultiplicationandrootingculture.Theefectsofdiferenttreatment
methodsoftransplants, mediums, hormonetypesandratiooncultureefectofM.crasipeswerestudied.[ Result] Itcoulddecreasethe
browningrateandcontaminationrateoftransplantsofM.crasipeswhenthetransplantswerepretreatedat4℃for5-7d.Theoptimalbasic
mediumforM.crassipeswasMSmediumandthehormoneratiowas6-BA0.5mol/L+IBA0.1mol/L.Thesuitablesubculturecyclewas25
dwiththemultiplicationcoefficientofabove3.5.Whentheadventitiousbudswereculturedwith1/2MSmediumthatwithouthormonefor15
daftertheyweredarkculturedwiththemediumof1/2MS+NAA3mg/L+6-BA0.1mg/Lfor15d, theycouldrootingwithrootingrateof
33%.Thesurvivalrateoftherootedseedlingscouldreach85%whentheywereplantedintothemixedmatrix.[ Conclusion] Thestudyestab-
lishedthetissueculturetechniqueforM.crasipes.
Keywords　Micheliacrassipes;Medium;Hormone
基金项目　江西省科技支撑计划项目(20061B0200200)。
作者简介　朱碧华(1964-),女,江西修水人 ,副教授 ,从事园林技术专
业的教学和科研工作。 ＊通讯作者。
收稿日期　2009-06-16
　　紫花含笑(MicheliacrasipesLaw)是木兰科含笑属一种
优良的园林观赏树种 ,天然分布于湖南中南部 、广东北部 、广
西东北部 、贵州南部和东南部及江西部分地区。紫花含笑叶
面光亮 ,终年青翠 ,花色艳丽 ,花味奇香 ,易栽培 ,耐修剪 ,是
一种优良的观赏树种 。紫花含笑的花还可用于提取具有特
色香气和特殊功能的浸膏 、精油 ,用于调制化妆品 、洗浴用品
和食用香精等。因此 ,紫花含笑具有很大的开发利用价值。
木兰科植物的营养繁殖多以嫁接和压条为主 ,扦插和组
培生根较困难。目前 ,有关木兰科植物的离体培养技术仅有
少量报道 [ 1-8] 。仅江彩华等 [ 9]对紫花含笑进行过扦插试验 ,
马小英等 [ 10]对紫花含笑的光合生理特性进行了研究 ,廖菊
阳 [ 11]对紫花含笑进行了新品种选育试验 ,傅旭阳等 [ 12]对紫
花含笑(♀)×钙土含笑(♂)杂种 F1代进行了组培研究 。
为了尽快实现紫花含笑的开发与大量繁殖 ,并为其他木
兰科植物的组织培养和快速繁殖提供参考 ,笔者开展了紫花
含笑离体繁殖技术研究 ,建立了完整的离体繁殖体系。
1　材料与方法
1.1　材料　紫花含笑成年树带芽茎段 ,母本采自江西省林
科院苗圃 。晴天上午 10:00 ～ 11:00剪取紫花含笑带芽茎段 ,
清洗表面后放入 4 ℃冰箱中保存备用。
1.2　方法
1.2.1　外植体预处理及表面灭菌。一般木本成年大树的嫩
枝具有内含物多 、褐化严重 、污染率高和进瓶诱导率低等特
点 ,其无菌系较难建立。木兰科植物中酚性成分较多 ,解决
其组织褐化问题是组培成功的关键。
1.2.1.1　外植体预处理。该研究采用以下 2种方案对外植
体进行预处理:
方案一:先用自来水将外植体表面冲洗干净 ,剪去老枝
及叶片 ,用洗洁净溶液浸泡 5min,再用棉球蘸洗洁净溶液仔
细轻轻涮洗腋芽及茎段 ,将涮洗后的芽按自然生长方向置于
烧杯中 ,基部用灭菌湿润滤纸包裹 ,套上保鲜袋 ,放入 4 ℃冰
箱中冷藏待用。冷藏时间分别为 3、5、7、9 d。
方案二:先用自来水将外植体表面冲洗干净 ,剪去叶片
留叶柄 ,用洗洁净溶液浸泡 5min,再用棉球蘸洗洁净溶液仔
细轻轻涮洗腋芽及茎段 ,将涮洗后的芽用流水冲洗 3 ～4 h。
1.2.1.2　无菌环境的准备。对装有蒸馏水的三角瓶 、空三
角瓶 、剪刀 、镊子和培养皿进行高压蒸气灭菌 30min;接种前
使用紫外灯对接种室灭菌 30 min。
1.2.1.3　外植体表面灭菌。外植体表面灭菌及接种工作在
超净工作台上进行 ,具体程序是:在每个无菌三角瓶中放置
10 ～20个芽段 ,加入 75%的酒精浸泡 30 ～ 60 s,用无菌水冲
洗 1次 ,之后用 0.1%升汞灭菌 3 ～ 15 min,立即用无菌水冲
洗 5 ～8次 。在药液灭菌过程中 ,轻轻晃动三角瓶 ,使灭菌液
与外植体充分接触。冲洗后将芽置于培养皿中 ,切除叶柄 、
茎段 2端受伤部位 ,将芽接种于灭菌后的诱导培养基上 ,每
瓶接种 1个外植体。
1.2.2　接种培养。将灭菌后的外植体接种于诱导培养基
上 ,每瓶接种 1个。不同处理接种外植体数均为 100瓶左
右 ,接种后 28 d统计外植体的污染率 、褐化 /死亡率和存活
率 。培养基均用 0.7%卡拉胶固化(pH值 5.8),以蔗糖为碳
源 ,含糖量 3%。培养条件为:温度(25±2)℃,光照时间 12
h/d,光照强度 1 000 lx。
责任编辑　常俊香　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(29):14024-14027
1.2.3　继代培养。在诱导培养基上接种外植体 ,待其萌发的
不定芽长至 1 ～ 2cm时 ,切下不定芽转移至继代培养基上进
行培养 ,每瓶接种 1个小单芽 。因木兰科植物含酚性物质较
多 ,为降低其褐化率 ,同时兼顾增殖效果和苗的生长 ,分别于
接种后 14、21、28、35、42 d继代 1次 ,重复进行 ,使材料不断
增殖。直到达到一定基数 ,再进行增殖培养基的筛选(包括
基本培养基和不同激素种类 、浓度的筛选)。
1.2.3.1　基本培养基的筛选。由于木兰科植物组织培养的
相关研究较少 ,可借鉴的资料不多。该研究首先对基本培养
基进行筛选 ,并在此基础筛选最佳增殖培养基。
表 1　基本培养基筛选的单因子试验
Table1　Thesinglefactortestofscreeningthebasalmedium
处理号
No.oftreatments
基本培养基
Basicmedium
激素
Hormones
Ⅰ 1/4MS
Ⅱ 1/2MS
Ⅲ MS 6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L
Ⅳ H
Ⅴ M木
Ⅵ B5
　注:培养基均为基本培养基 +6-BA 0.5mg/L+IBA0.1mg/L+糖 30
g/L+卡拉胶 7g/L, pH值 5.8～ 6.0。
　Note:Culturemediumisalbasicmedium + 0.5 mg/L6-BA + 0.1
mg/LIBA+ 30g/Lsugar+ 7g/Lcarrageenan, pHvalueof5.8
-6.0.
1.2.3.2　激素水平的筛选。在组织培养过程中 ,激素水平是
主要控制因素。该试验选用 6-BA、KT和常用的生长素 IBA
进行 3因素 3水平的正交试验 ,共设置 9个处理 ,每个处理
接种 30瓶 ,每瓶接种 1丛芽 ,进行增殖培养基的激素优化筛
选。接种 28 d后统计增殖情况。
表 2　紫花含笑增殖培养基激素水平正交试验
Table2　Theorthogonaltestofthehormoneleveloftheproliferation
mediaofMicheliacrassipes mg/L
水平
Level
因素 Factor
6BA KT IBA
1 0.5 0.0 0.1
2 1.0 0.5 0.2
3 2.0 1.0 0.5
1.2.4　生根培养 。将继代苗转入壮苗培养基(1/2MS+IBA
0.05mg/L)中 ,培养 20 d左右 。选择长度大于 1.2 cm的不
定芽进行生根培养。
木兰科植物较难扦插繁殖 ,在组培过程中 ,生根更困难。
在增殖培养研究中发现 ,光照强度 、激素浓度 、培养周期均可
不同程度的导致材料褐化 ,并影响瓶苗的生长。综合考虑多
个因子 ,采用 4因素 2水平的正交设计进行生根试验 ,每处
理 30瓶 ,每瓶接种 5个芽。具体试验步骤如下:
(1)将不定芽置于根诱导培养基上进行暗培养 ,暗培养
时间分别为 10、15、20、25、30 d。
(2)将经过诱导培养的芽转入不加任何激素的基本培养
基(MS或 1/2 MS)中进行生根培养(表 3)。
表 3　紫花含笑生根培养基筛选正交试验的因素与水平
Table3　Factorsandlevelsoftheorthogonaltestofscreeningtheroo-
tingmediaofMicheliacrasipes
水平Level
因素 Factor
激素 1(A)∥mg/LHormone1
激素 2(B)∥mg/LHormone2
光照℃Ilumination
生根基本培养基(D)Basicrootingmedium
1 IBA5 6-BA0 暗 MS
2 NAA3 6-BA0.1 光 1/2MS
2　结果与分析
2.1　外植体的选择与处理
2.1.1　表面灭菌时间的选择。将外植体用 75%的酒精浸泡
30 ～60s,再用 0.1%升汞灭菌 2～ 15 min后接种于诱导培养
基上 ,接种后 28 d统计不同灭菌时间外植体的污染率 、褐化 /
死亡率及存活率。灭菌时间分为 4个时间段 。(外植体分为
3部分 ,顶芽及以下 2个茎节左右为Ⅰ号外植体 、Ⅰ号外植体以
下 2 ～3个茎节为Ⅱ号外植体 、Ⅱ号外植体以下的茎节为Ⅲ号
外植体)。统计结果见表 4 ～ 6所示。
由表 4可知 ,紫花含笑Ⅰ号外植体灭菌 4 min接种存活率
最高 ,达 58%。
　　由表 5可知 ,紫花含笑Ⅱ号外植体灭菌 8min的接种存活
率最高 ,达 50%。
　　由表 6可知 ,紫花含笑Ⅲ号外植体灭菌 12 min的接种存
活率最高 ,达 37%。
表 4　不同表面灭菌时间对紫花含笑外植体Ⅰ号接种效果的影响
Table4　 EfectofvarioussurfacesterilizationtimeontheinoculatingresultsofMicheliacrassipesexplantNo.1
表面灭菌时间∥minSurfacesteriliz-ationtime
接种芽数∥个No.ofinoculatedbuds
污染芽数∥个No.ofconta-minatedbuds
污染率∥%Contamin-ationrate
褐化 /死亡芽数∥个No.ofbrowningbuds
褐化率∥%Browningrate
存活芽数∥个No.ofsurvivalbuds
存活率∥%Survivalrate
2 100 82 82 7 7 11 11
4 100 33 33 9 9 58 58
6 100 29 29 26 26 45 45
8 100 24 24 60 60 16 16
　　由以上结果可知 ,外植体表面灭菌时 ,应根据外植体的
幼嫩程度 ,分别采用不同的灭菌时间 ,以降低污染率 、减少死
亡率 ,提高进瓶诱导存活率 。
研究结果还表明 ,不同茎节的诱导率表现为Ⅰ号外植体
>Ⅱ号外植体 >Ⅲ号外植体 。可见 ,嫩枝进瓶时 ,顶芽及其以
下 2 ～4个茎节的诱导率较高。
2.1.2　外植体进瓶前的预处理。对Ⅰ号外植体进行预处理 ,
表面灭菌按照 “1.2”的方法进行 ,灭菌时间为 4 min,接种 28
d后统计结果 。
　　由表 7可知 ,紫花含笑外植体清洗后进行 5 ～7 d的低温
1402537卷 29期　　　　　　　　　　　　　　　　朱碧华等　紫花含笑的组织培养技术研究
预处理可降低褐化及污染率。这可能是因为低温处理降低
了紫花含笑外植体的新陈代谢活力和多酚氧化酶活性 ,同时
对内生菌的生长也起到了一定的抑制作用。但低温预处理
时间不宜过长 ,因为低温处理时间过长导致外植体生活力下
降 ,其死亡率及污染率反而增加。
表 5　不同表面灭菌时间对紫花含笑Ⅱ号外植体接种效果的影响
Table5　 EfectofvarioussurfacesterilizationtimeontheinoculatingresultsofMicheliacrassipesexplantNo.1
表面灭菌时间∥minSurfacesteriliz-ationtime
接种芽数∥个No.ofinoculatedbuds
污染芽数∥个No.ofconta-minatedbuds
污染率∥%Contamin-ationrate
褐化 /死亡芽数∥个No.ofbrowningbuds
褐化率∥%Browningrate
存活芽数∥个No.ofsurvivalbuds
存活率∥%Survivalrate
4 100 81 81 9 9 10 10
6 100 63 63 11 11 26 26
8 100 42 42 8 8 50 50
12 100 40 40 29 29 31 31
表 6　不同表面灭菌时间对紫花含笑Ⅲ号外植体接种效果的影响
Table6　 EfectofvarioussurfacesterilizationtimeontheinoculatingresultsofMicheliacrassipesexplantNo.3
表面灭菌时间∥minSurfacesteriliz-ationtime
接种芽数∥个No.ofinoculatedbuds
污染芽数∥个No.ofconta-minatedbuds
污染率∥%Contamin-ationrate
褐化 /死亡芽数∥个No.ofbrowningbuds
褐化率∥%Browningrate
存活芽数∥个No.ofsurvivalbuds
存活率∥%Survivalrate
7 100 88 88 8 8 4 4
10 100 80 80 12 12 8 8
12 100 36 36 27 27 37 37
15 100 41 41 33 33 26 26
表 7　不同预处理方法对紫花含笑外植体接种效果的影响
Table7　EffectofvariouspretreatmentmethodsontheinoculatingresultsofMicheliacrassipesexplants
接种芽数∥个No.ofinoculatedbuds
污染芽数∥个No.ofconta-minatedbuds
污染率∥%Contamin-ationrate
褐化 /死亡芽数∥个No.ofbrowningbuds
褐化率∥%Browningrate
存活芽数∥个No.ofsurvivalbuds
存活率∥%Survivalrate
冰箱保存 3d 100 31 31 10 10 59 59
Reserveinfreezer 5d 100 30 30 9 9 61 61
7d 100 25 25 8 8 67 67
9d 100 37 37 11 11 52 52
流水冲洗 100 33 33 9 9 58 58
Washedbyrunningwater
2.2　增殖培养
2.2.1　增殖培养基的筛选。
2.2.1.1　基本培养基的筛选。通过单因子随机区组试验筛
选紫花含笑的最佳基本培养基 , 28 d后分别统计不同培养基
上芽的增殖系数 ,统计结果如表 8所示(表中数据为增殖产
生芽的平均值 ,增殖系数为增殖芽数与接种芽数的比值)。
由表 8可知 , MS培养基的芽增殖效果最好 ,其次为 M木培养
基 ,这 2种培养基中芽的增殖系数分别达 3.68和 2.51。
表 8　基本培养基种类对紫花含笑芽增殖效果的影响
Table8　Effectofvariouskindsofbasalmediumontheproliferationof
Micheliacrassipes
培养基种类Kindsofmedia
增殖系数Proliferationcoeficient
1 2 3
平均值Meanvalue
Ⅰ(1/4MS) 1.55 1.81 1.63 1.66
Ⅱ(1/2MS) 1.62 1.75 2.00 1.79
Ⅲ(MS) 3.78 3.35 3.92 3.68
Ⅳ(H) 2.38 2.12 1.95 2.15
Ⅴ(M木) 2.45 2.68 2.39 2.51
Ⅵ (B5) 1.04 1.05 1.33 1.14
平均值 meanvalue 2.137 2.127 2.203 2.16
2.2.1.2　激素种类的选择 。不同激素种类与水平的正交试
验结果如表 9所示(基本培养基为 MS培养基 ,培养过程中污
染或褐化死亡的瓶苗不计)。由表 9可知 ,植物激素对紫花
含笑丛芽的发生有较大影响。含低浓度激素的培养基上紫
花含笑芽生长较快 ,叶片舒展 、嫩绿 ,茎较长 ,增殖系数较高 ,
有效芽较多。而高浓度激素培养基上 ,苗叶片肥大 、脆化 、并
有玻璃化现象 ,苗基部褐化严重 ,有的甚至出现畸形 ,有效芽
较少。处理 1(即 MS+6-BA0.5 mg/L+IBA0.1 mg/L)芽增
殖效果最好 ,增殖系数和有效苗数分别达到 3.54和 2.01个。
表 9　不同激素种类及配比对紫花含笑芽增殖效果的影响
Table9　Effectofvariouskindsandproportionofhormonesonthe
proliferationofMicheliacrasipes
试验号TestNo.
增殖系数Proliferationcoeficient
有效苗数∥个No.ofavaila-bleseedlings
苗生长情况Growthstatusofseedlings
1 3.54 2.01 叶片舒展嫩绿 ,茎伸长较好
2 2.43 1.61 长势较好
3 1.77 1.46 叶片有些黄化、肥大 ,基部有褐化
4 1.68 1.43 叶片有些黄化、肥大 ,基部有褐化
5 2.13 1.52 叶片有些脆化
6 1.78 1.17 芽膨大 ,叶片有些脆化
7 1.62 1.00 芽小 ,苗伸长差 ,有效苗少
8 1.51 1.00 芽小 ,苗伸长差 ,有效苗少
9 1.65 0.60 芽伸展不好 ,有些出现畸形 ,叶片肥大 ,水渍化
14026 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
2.3　生根培养
2.3.1　最佳生根培养基及培养方法的选择。由表 10可知 ,
调整紫花含笑的生根培养条件可诱导其生根 ,但生根率较
低 ,最高仅为 33%。当培养基中 NAA浓度提高到 3 mg/L、
IBA浓度提高到 5 mg/L时 ,均可诱导出愈伤组织 ,诱导率达
100%,但愈伤组织不是都能生根。只有基本培养基为
1/2MS,前期暗培养 10 ～ 15 d后 ,转入根形成培养基 1/2MS
中培养 12 ～ 15 d,且培养基中添加低浓度 6-BA的处理愈伤
组织 ,才能生根 ,说明 6-BA可协同生长素促进愈伤组织生
根 ,生长素 NAA比 IBA诱导愈伤组织生根的效果好 ,两者的
根诱导率分别为 33%、15%,且根较粗壮 ,但根数量较少(只
有 1 ～ 2根)。
暗培养有利于诱导愈伤组织生根 ,且暗培养时间以 10 ～
15 d为宜 ,时间过短 ,影响诱导率;时间过长 ,芽出现死亡。
表 10　不同因素与水平对愈伤组织生根的影响
Table10　 Efectofvariousfactorsandlevelsontherooting
试验号TestNo.
根诱导 Rootinduction
培养基Culturemedium
培养条件Cultureconditions
愈伤诱导率∥%Calusindu-ctionrate
出根率%Rootingrate
1 MS+IBA5 暗 100 0
2 1/2MS+IBA5+6-BA0.1 暗 100 15
3 MS+6-BA0.1+IBA5 光 100 0
4 1/2MS+6-BA0.1+IBA5 光 100 0
5 MS+NAA3 光 100 0
6 1/2MS+NAA3 光 100 0
7 MS+NAA3 暗 100 0
8 1/2MS+NAA3+6-BA0.1 暗 100 33
2.4　瓶苗移栽　当试管苗根长至 0.5 ～ 1 cm时可进行移
栽。移栽时将生根苗取出 ,小心洗净根部培养基 ,将苗基部
浸入杀菌剂中 30s,然后将试管苗栽植于消毒后的混合基质
(泥炭∶珍珠岩∶砻糠灰 =3∶2∶1)中 。移栽后浇透水 ,前 30 d注
意保湿和防治病虫害 ,移栽成活率可达 85%。
3　结论与讨论
(1)一般来说 ,木兰科植物组织培养存在增殖芽不易伸
长 、易褐化 、易玻璃化和难生根等问题 。该试验以紫花含笑
成年树嫩枝为外植体 ,通过基本培养基筛选 、不同培养阶段
激素种类选择及配比 、培养条件调控等措施 ,较好的解决了
紫花含笑组培过程中芽不易伸长 、易褐化和易玻璃化等
问题。
(2)以紫花含笑嫩枝为外植体 , 4 ℃低温预处理 5 ～ 7 d,
并采取合适的灭菌时间可降低褐化和污染率 ,提高诱导率 。
(3)该试验结果表明 ,紫花含笑的最佳基本培养基为 MS
培养基 ,激素配比为 6-BA0.5 mg/L+IBA0.1 mg/L,继代周
期以 25 d为宜 ,增殖系数可达 3.5以上。
(4)将分化出的紫花含笑不定芽转入根诱导培养基
1/2 MS+NAA3mg/L+6-BA0.1 mg/L中暗培养 15 d,然后
再转入不加任何激素的 1/2 MS根形成培养基中 , 15 d左右
即可出根 ,但生根率较低 ,只有 33%。其原因有待于进一步
研究。
(5)将紫花含笑生根瓶苗栽植于混合基质(泥炭∶珍珠
岩∶砻糠灰 =3∶2∶1)中 ,移栽成活率可达 85%。
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