全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2016)09 － 2225 － 04 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2016． 09． 037
收稿日期:2015 － 10 － 12
基金项目:林业公益性行业科研专项经费资助项目(2014047
10)
作者简介:王明媚(1989 －)，女，河北唐山人，森林培育硕士研
究生，E-mail:mingmei16@ sina． cn，* 为通讯作者。
天女花与广玉兰杂交 F1 代的 ISSＲ遗传多样性分析
王明媚1，2，Kevin Parris3，ZHANG Dong-lin2* ，金晓玲1* ，李志辉1，杨玉洁4
(1．中南林业科技大学，湖南 长沙 410004;2．佐治亚大学，美国佐治亚州 雅典 30602;3．克莱姆森大学，美国南卡莱罗纳州 克
莱姆森 29634;4．长江大学，湖北 荆州 434025)
摘 要:利用 ISSＲ分子标记技术探讨了天女花与广玉兰杂交后代 9 株幼苗的遗传多样性。9 株 F1 代幼苗根据生长健壮的情况依
次标记为 SA、SB、SC、SD、SE、SF，、SG、SH、SI。选用 10 个 ISSＲ引物对亲本以及 9 株 F1 代幼苗的基因组进行分析。结果表明，11
株植物共扩增出 96 条 DNA条带，其中多态性条带为 85 条，占总条带的 88． 5 %。UPGMA聚类结果表明所有 F1 代幼苗与六倍体
父本更为相似，与二倍体的母本遗传距离较远。其中 SC无论从叶片大小、边缘的形态在 9 株 F1 代幼苗中与父本最相似，SG叶片
为披针形，在 9 株 F1 代幼苗中较为特殊。其余 7 株 F1 代幼苗日渐成熟后再根据 UPGMA聚类树状图进行形态多样性分析。
关键词:F1 代遗传多样性;种间杂交;ISSＲ分子标记技术;天女花;广玉兰;多态性条带
中图分类号:S685． 15 文献标识码:A
Genetic Variation of Magnolia sieboldii K． Koch‘Colossus’and
Magnolia grandiflora L．‘Kay Parris’F1 Seedlings Using ISSＲ Markers
WANG Ming-mei1，2，PAＲＲIS Kevin3，ZHANG Dong-lin2* ，JIN Xiao-ling1，LI Zhi-hui 1，YANG Yu-jie4
(1． Central South University of Forestry and Technology，Hunan Changsha 410004，China;2． University of Georgia，Athens，GA 30602，
USA;3． Clemson University，Clemson，SC 29634，USA;4． Yangtze University，Hubei Jingzhou 434025，China)
Abstract:ISSＲ markers were used to analyze genetic variations and assessed inheritance of nine F1 seedlings． Plants were accessioned and
assigned a letter，with A being the most vigorous and I being the least vigorous individuals． A total of 96 bands were generated from 10 prim-
ers，in which 85 bands (88． 5 %)were polymorphic． UPGMA tree revealed that all the seedlings were much closer to their hexaploid pollen
parent (M． grandiflora‘Kay Parris’)and more distant from their diploid seed parent(M． sieboldii‘Colossus’)，supporting early foliage
morphology． Seedling C is the most similar to the pollen parent，both in regard to foliage proportions，margin undulation，and proximity．
Seedling G is unique among the F1，displaying lanceolate leaves． Other seedlings grouped within the tree have slight morphological variations
that may be analyzed for correlation to the UPGMA tree as they continue to mature and growth habit variations become evident．
Key words:F1 variation;Interspecific hybrid;ISSＲ markers;Magnolia sieboldii‘Colossus’;Magnolia grandiflora‘Kay Parris’;Polymor-
phic bands
天女花，原产于中国、日本以及朝鲜半岛［1 － 2］，
二倍体(2n = 2x = 38)［3］落叶灌木或小乔木，一年多
个花期，花白色，红色雄蕊。在美国 4 ～ 8 带地域生
长良好。广玉兰，塔形，原产于美国弗吉尼亚州至佛
罗里达州，东至田纳西州，抗寒性极强，六倍体(2n
= 6x = 114)［3］常绿乔木，花白色。根据种间杂交以
及不同倍性间的杂交［2，4］经验，两个品种均具有极
大的育种潜力。具有丰富育种经验的木兰科育种学
家 Dennis Ledvina 是第一个从天女花与广玉兰杂交
后代中选择出具有商业价值产品的人。参照 Ledvi-
na 先生的经验，于 2013 年 5 月在美国南卡莱罗纳
州斯巴坦堡社区学院树木园对天女花和广玉兰进行
杂交。3 个月后收获到杂交种子并通过悬浮法获得
25 颗具有活力的 F1 代种子。去掉假种皮，用 10 %
的次氯酸钠进行冲洗后把种子轻轻放在湿润的泥炭
块中冷处理 5 个月。2014 年 3 月共有 21 颗种子萌
发。萌发后，有 9 株 F1 代幼苗(根据生长健壮的情
况依次标记为 SA，SB，SC，SD，SE，SF，SG，SH，
SI)被移栽到 1 加仑的容器中。通过流式细胞计数
法测得所有的 F1 代育苗的染色体倍性为四倍体(2n
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2016 年 29 卷 9 期
Vol. 29 No. 9
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
=4x = 76)［3］。后期生长表明，所有 F1 代幼苗叶片
均为常绿，同六倍体父本一致。但是，叶片的大小、
形状以及颜色各有不同。且由于 F1 代幼苗树龄小，
其生长习性和花的特征了解不很清楚。因此，有必
要进行 DNA分子鉴定掌握 F1 代的遗传变异。
分子技术，像 cpDNA 分析［5］，已经广泛应用于
木兰科植物的研究中。ISSＲ 分子标记技术是一种
新的植物遗传性研究技术［6 － 7］。分子技术广泛应用
于植物遗传结构、遗传多样性以及遗传关系的研究
中［8］。在此研究中，本文试图分析出 F1 代与亲本之
间的遗传变异以及 F1 代幼苗之间的遗传多样性，为
木兰科 F2 代优良植株的选育提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材 料
本试验选取 2 个亲本和生命力旺盛的 9 株 F1
代幼苗(SA，SB，SC，SD，SE，SF，SG，SH，SI)上
的新鲜叶片提取 DNA。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 总 DNA 提取 从 F1 代 9 株幼苗以及 2 个
亲本植株上均选取 1 片新鲜健康的叶片，用其一小
部分放在液氮中提取 DNA，多余叶片放在 － 80 ℃冰
箱中储存。使用 DNA 提取试剂盒 QIAGEN DNeasy
Plant Mini Kit提取 DNA。
1． 2． 2 DNA 质量检测 提取的 DNA 样品用 spec-
trophotometer (ThermoScientific NanoDrop Lite)紫外
分光光度计测定波长 260 和 280 nm的光吸收值，以
A260 /A280比值判断 DNA 样品的纯度，并直接观测紫
外分光光度计上样品的浓度。检测完毕的 DNA 放
在 － 20 ℃冰箱中储存待用。本试验以 2 个亲本以
及 9 个 F1 代 DNA为模板，从 100 个 ISSＲ 引物中筛
选出 10 个扩增条带清晰的引物用于 11 个植物的
ISSＲ分析。
1． 2． 3 ISSＲ-PCＲ 反应体系及反应循环参数 PCＲ
反应体系(20 μl)为:Ampli Taq Gold 360 Master Mix
10 μl，模板 DNA 3 μl，引物 1 μl，最后用 ddH2O 补
足至 20 μl。
PCＲ 反应采用如下循环参数定为:预变性 94
℃ 5 min，在变性 94 ℃ 30 s，退火 50 ～ 60 ℃ 45 s，延
伸 72 ℃ 1． 5 min循环 40 次，最后一次延伸为 72 ℃
7 min，然后设置 PCＲ温度为 4 ℃。
1． 2． 4 2 个亲本以及 9 个 F1 代样本的 ISSＲ-PCＲ
扩增 用筛选的引物对 11 个 DNA样本在相应的退
火温度下进行 PCＲ扩增，扩增产物于 1． 2 %琼脂糖
凝胶并加入 2 滴 EB 于 0． 5X 缓冲液中电泳，电压
120 V，约 80 min 后取出。使用 100 bp DNA ladder
作为参照标准，凝胶在 UV灯下进行观察拍照。
1． 2． 5 数据统计 PCＲ 扩增产物在凝胶的某个相
同迁移率的具体位置上有 DNA条带记为 1，无 DNA
条带记为 0。剔除模糊不清晰的条带。使用 PAUP
4． 0 分析和估计亲代与 F1 之间的基因差异。
2 结果与分析
2． 1 ISSＲ-PCＲ引物退火温度的筛选
ISSＲ对 PCＲ退火温度极为敏感，同一引物对于
不同退火温度不一样，而同一物种不同的引物，退火
温度也不相同。因此，对于 ISSＲ 分析而言，引物的
筛选和退火温度至关重要。本试验从 100 个 ISSＲ
引物中逐步筛选出 10 个扩增条带清晰的引物，这
10 个 ISSＲ引物相应的退火温度在 52 ～ 56 ℃，其中
引物 UBC807，UBC811，UBC812，UBC827，UBC828
退火温度最低，为 52 ℃;引物 UBC834，UBC835 退
火温度最高，为 56 ℃。
2． 2 ISSＲ-PCＲ 扩增结果及 11 个样本的遗传多态
性
10 个 ISSＲ引物共扩增出 96 条清晰的条带，条
带大小为 200 ～ 1500 bp，其中 85 条具有多态性，比
例为 88． 5 %。不同引物扩增大条带数为 7 ～ 15。
平均每个引物扩增的条带数为 9． 6。其中引物
UBC817 扩增出的具有多态性条带比例最高，为
100． 0 %;引物 UBC817 扩增出的具有多态性条带
比例最低，为 57． 1 %(表 1)。对于每个分类单元，
扩增出的条带数介于 45(XX，Magnolia sieboldii
‘Colossus’)至 58(SG和 SI)之间。
2． 3 遗传距离分析
供试材料的遗传距离在 0． 167 ～ 0． 604。因为
天女花(Magnolia sieboldii‘Colossus’)(XX)为落
叶，叶背没有棕色绒毛，且叶片较大，而广玉兰
(Magnolia grandiflora‘Kay Parris’)(XY)叶片较小
且常绿。经过 ISSＲ 分析，它们之间的遗传距离最
大，为 0． 604。在 F1 代样本之间，遗传距离最小的
两个样本为 SH 和 SI，它们之间的遗传距离为 0．
167;遗传距离最大的 2 个样本为 SA 和 SG，它们之
间的遗传距离为 0． 396。F1 代样本与母本之间的平
均遗传距离为 0． 279，与父本之间的平均遗传距离
为 0． 494。从遗传距离上看，六倍体父本比二倍体
母本的贡献力大。
2． 4 ISSＲ聚类分析树状图
根据 ISSＲ数据结果，按 UPGMA 法构建了亲本
与 9 个 F1 代样本之间的遗传关系聚类分析树状图
(图 1)。从聚类图中可以看出，可将 11 个供试材料
分为 2 类。
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表 1 10 个引物序列、退火温度、扩增条带数以及多态性
Table 1 Sequence of primers successfully used in the ISSＲ analysis and number of amplified bands per primer and their polymorphism
引物
Primer
序列
Sequence
(5’-3’)
退火温度(℃)
Annealing
temperature
扩增条带
Number
of bands
多态性条带
Polymorphic
bands
多态性条带百分比(%)
PPB
UBC807 (AG)8 T 52 7 4 57． 1
UBC811 (GA)8 C 52 10 9 90． 0
UBC812 (GA)8A 52 10 9 90． 0
UBC814 (CT)8A 52 7 6 85． 7
UBC815 (CT)8G 54 15 14 93． 3
UBC817 (CA)8A 54 8 8 100． 0
UBC827 (AC)8G 52 9 8 88． 9
UBC828 (TG)8A 52 7 6 85． 7
UBC834 (AG)8YT 56 14 13 92． 9
UBC835 (AG)8YC 56 9 8 88． 9
均值 － 9． 6 8． 5 88． 5
图 1 ISSＲ分析亲本与 F1 代样本聚类树状图
Fig． 1 Dengrogram of Magnolia parents and F1 siblings based on ISSＲ data
第 1 类为母本。第 2 类为父本及 9 个 F1 代样
本，第 2 类中又分为 4 个亚类(图 1)。父本与 SC之
间遗传距离最近为 0． 219。且从形态学上观察，SC
叶片的形状以及大小最接近父本。SH和 SI均具有
小叶片，生长缓慢，以及相似的树形。两者从遗传角
度分析，也是遗传距离最接近的两个 F1 代样本。这
4 个样本被聚为第 1 个亚类。第 2 个亚类包含生长
最快的 SA，以及亚聚类 SB和 SF。从遗传距离上判
断它们彼此接近，但从目前的生长及形态特征上无
显著差异。第 3 个亚类包含 SD和 SE。且它们也具
有相似的形态特征。第 4 个亚类为 SG，是唯一的具
有可辨别的绒毛叶片的植株。
3 结论与讨论
(1)特异性条带与条带组合类型对将来的研究
至关重要［12］。在此试验中，共获得 17 条特异性条
带，其中 8 条来自母本，只有 1 条来自父本。通过亲
本 DNA 重组，4 个 F1 代样本中出现特异性条带。
分别为 SE和 SG均有 3 条，SC 和 SD各有 1 条。因
为 SG叶片为披针形且有 3 条特异性条带，很可能
控制披针形叶片形状的基因是 3 条特异性条带中的
1 条。但是，此假设还需要进一步证实。由于 F1 代
样本较小，生长程度还不足以去推测带型与生长的
关系，需要进一步的研究。
(2)ISSＲ分析结果表明 SC 与父本之间的亲缘
关系最近，且所有 F1 代样本均与父本相似。这也证
实了 F1 代样本基因组 DNA从母本与父本获得的基
因组 DNA的比例为 1 ∶ 3。通过 ISSＲ 分析，9 个 F1
代样本与父本分享 11 条带，而只有 3 条带是 9 个 F1
代样本从母本获得。待 9 个 F1 代样本成熟将继续
观察其生长习性以及花的特征，为未来木兰科育种
做准备。
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(责任编辑 李 洁)
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