全 文 ：第 29卷第 6期
2007年 12月　　
　 大 连 医 科 大 学 学 报
JournalofDalianMedicalUniversity　
Vol.29No.6
Dec.2007
高速逆流色谱快速分离制备石椒草中
高纯度芦丁对照品＊
尹连红 ,许丽娜 ,韩　旭 ,王晓娜 ,彭金咏＊
(大连医科大学药学院 药物分析教研室 ,辽宁 大连 116044)
摘要:[目的 ]建立高速逆流色谱法高效 、快速分离制备石椒草中芦丁的新方法。 [方法 ]石椒草的乙醇提取物经大
孔吸附树脂柱初步分离后 , 直接进行高速逆流色谱分离 , 所用两相溶剂体系为乙酸乙酯–正丁醇–水(2∶1∶3, v/v/
v),上相为固定相 , 下相为流动相 ,流速 1.5mL/min,转速 830 r/min, 检测波长 254nm, 所得产物的纯度经 HPLC检
测 , 结构经 UV和 MS鉴定。 [结果 ]经一步分离从 200mg石椒草粗提物中得到纯度高于 99%的芦丁 , 分离时间短
于 2 h。 [结论 ]由该法制备芦丁简便 、快速 ,所得产物纯度高 , 适合于芦丁对照品的大规模制备。
关键词:芦丁;石椒草;HSCCC;HPLC
中图分类号:R917　　　文献标识码:A　　　文章编号:1671-7295(2007)06-0532-03
　　高速逆流色谱(Highspeedcounter-currentchromatogra-
phy, HSCCC)是一种无固相载体的连续液 -液分配色谱技
术。它利用螺旋管分离柱在做行星式运动时所形成的单向
性流体动力平衡体系 ,使不相混溶的两相溶剂不断的混合 ,
保留其中的一相作为固定相 , 另一相在恒流泵压力作用下连
续输入作为流动相。 溶质在两相系统中分配 、传递 , 在短时
间内达到高效 、快速的分离。由于不使用固态支持介质 , 避
免了固定相载体与实验样品发生化学反应变性或不可逆吸
附 , 样品的回收率高 , 具有其它制备色谱技术无可比拟的优
点 , 因此被广泛应用于天然产物的分离制备当中 [ 1～ 4] 。
石椒草(BoenninghausenlasessilicarpaLe vl)是芸香科松
风草属植物石椒草的干燥全草 。具有清热解毒 、活血 、镇痛 、
消炎等功能 [ 5] 。现代研究表明石椒草中含有大量的香豆素
和黄酮类化合物 [ 6] , 通过传统的分离纯化技术 ,如硅胶柱 、聚
酰胺 、氧化铝等柱色谱法制备该药用植物的化学成分 ,不仅
费时 、费力 ,而且所得产物纯度低。本研究中首次采用 HSC-
CC技术对石椒草的化学成分进行了分离制备 , 经一步洗脱
就得到纯度高于 99%的芦丁 。分离时间短于 2 h, 制备快
速 , 制备量大 ,适合于大规模芦丁对照品的制备。 具有分离
效率高 、产物纯度好 、速度快 、成本低等优点 , 是分离纯化芦
丁的有效手段。目前还未见 HSCCC用于分离制备石椒草中
的芦丁的研究报道。
1　试药与仪器
1.1　药材与试剂
石椒草购于云南千草源药业有限公司 , 经大连医科大学
药物分析教研室徐奇玮教授鉴定为 Boenninghausenlasessili-
carpaLe vl的干燥全草。芦丁标准品购于中国药品生物制
品检定所。
正丁醇 、乙酸乙酯均为分析纯试剂(天津科密欧化学试
剂开发中心), 乙腈 、甲醇为色谱纯试剂(TEDIA, USA),
95%医用酒精(盘锦天源药业有限公司),自制双蒸水。
1.2　实验仪器
TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限
公司)、20mL进样圈 、8823B–紫外检测仪(北京市新技术
应用研究所)、TBP– 50A恒压恒流微量泵(上海同田生化
技术有限公司)、HX-1050恒温循环器(北京博医康实验仪
器有限公司)、N2000色谱数据工作站(浙江大学智达信息工
程有限公司), Agilent1200 HPLC包括 G1322AVD、G1311A
QP、G1329ASPA、G1314BVWD(Agilent, USA), U-3010紫
外 /可见分光光度计(Hitachi, Japan)。
2　方法与结果
2.1　HSCCC分离用两相溶剂系统的制备
采用乙酸乙酯:正丁醇:水(2∶1∶3, v/v/v)的溶剂系统。
＊ 收稿日期:2007-08-03;修回日期:2007-10-25
　作者简介:尹连红(1984 -), 女 ,河北灵寿人 , 硕士。
　通讯作者:彭金咏(1973 -), 男 ,湖北人 , 教授 ,博士。 Tel:0411-86110411, Email:jinyongpeng2005@163.com
将乙酸乙酯 、正丁醇 、蒸馏水按体积比(2∶1∶3)倒入分液漏
斗内混合 , 充分振摇后 , 静置分层 , 分取上下相 , 上相作为固
定相 , 下相作为流动相 ,分别超声半小时 ,放置至室温 , 备用。
2.2　样品溶液的制备
取干燥的石椒草全草 1kg,粉碎后用 90%乙醇回流提取
3次 ,每次 2 h。合并提取液 , 减压回收提取物得浸膏 1000
mL,浓缩温度为 60℃。将浸膏进行 D101大孔树脂柱(80×6
cm)层析 , 依次用水 , 10%、 40%、 70%、95%乙醇各 1500 mL
梯度洗脱 , 接收 40%乙醇的洗脱液 ,减压浓缩 , 真空干燥 , 得
淡黄色粉末 5.6 g,称取该粉末 200mg,用等量(各 10mL)的
上下相溶解 , 摇匀。
2.3　样品分离
以 9.99 mL/min流速泵入固定相 , 待 HSCCC分离管中
充满上相后 , 即出口端有固定相流出时 , 开启主机 , 转速为
830r/min, 以 1.5 mL/min的流速泵入流动相。打开检测器
与温控装置 , 分别设定为 254 nm与 30℃。当流动相从分离
柱中流出时 , 表明在分离柱中已建立了两相间的动态平衡。
此时通过进样阀口将制备好的样品注入 HSCCC分离管中 ,
并开始采集数据 , 记录色谱图 , 见图 1。根据色谱图吸收峰
接收流份Ⅰ 。
图 1　石椒草粗提物 HSCCC分离色谱图
2.4　HSCCC分离流份的纯度检测
色谱条件 色谱柱:ZORBAXSB-C18 (150 ×4.6 mm,
i.d., 5 μm), 柱温:25℃;检测波长:254 nm, 流速:0.8 mL/
min, 进样量:10 μL, 流动相为乙腈:水:冰醋酸(20∶80∶1,
v/v/v)。在所述色谱条件下 , 分离所得的流份 Ⅰ的 HPLC色
谱图见图 2,由图可知 , 流份Ⅰ为单一成分。
2.5　所得化合物的结构对照
流份Ⅰ 与芦丁对照品在相同 HPLC条件下分析所得色
谱峰保留时间相同 ,经 MS测定分子量为 610,并且二者的紫
外扫描吸收峰完全一致 , 见图 3。因此分离所得化合物 1被
图 2　流份 Ⅰ的 HPLC色图谱
A-芦丁标准品 , B-流分Ⅰ
鉴定为芦丁。
3　讨　论
在用高速逆流色谱法对某中药的化学成分制备时 , 需要
采取一定的前处理方法 , 得到较为干净的提取物 , 便于进一
步分离纯化。大孔吸附树脂具有操作简单 、价格便宜 、适用
范围广 、可重复使用等优点 , 而被广泛应用于天然药物的分
离制备当中 [ 7] 。本研究中首先采用大孔吸附树脂技术对石
椒草的乙醇提取物进行了初分 , 得到了易于进行 HSCCC分
离制备的流份 ,再按照 HSCCC分离的模式进行。
适宜的溶剂系统是 HSCCC分离的关键 , 选择溶剂系统
就意味着选择固定相和流动相。为使目标化合物达到高效
533第 6期　　　　　　　　　　尹连红 , 等:高速逆流色谱快速分离制备石椒草中高纯度芦丁对照品
图 3　流份Ⅰ与芦丁标准品紫外扫描对照图谱
1-分离所得流份Ⅰ , 2-芦丁标准品
的分离 , 就必须对样品在不同的溶剂系统上下相间的分配进
行考察 , 选择最佳溶剂系统。组分的分离依赖于组分在两相
间的分配系数 K值的大小 , K=(VR-Vs)/Vm, 式中 , VR为最
终分离得到的某一部分的保留体积 , Vs为柱内固定相体积 ,
Vm为流动相体积。当 K=0时 , 表示样品完全分配在流动相
中 , 随流动相流出 , 在固定相中没有保留;当 K值接近 1.0
时 , 若固定相与流动相体积相当 , 则组分在流动相与固定相
中 1∶1进行分配 , 该溶剂系统能使组分得到最佳分离。
参考文献:
[ 1] SilvaRS, LeitaoGG, Brum TB, etal.Applicationsof
counter-currentchromatographyinorganicsynthesispuri-
ficationofheterocyclicderivativesoflapachol[ J] .JChro-
matogrA, 2007, 1151(1-2):197-202.
[ 2] RMLiu, LFeng, ALSun, etal.Preparativeisolation
andpurificationofcoumarinsfromPeucedanumpraerupto-
rumDunnbyhigh-speedcount-currentchromatography
[ J] .JChromatogrA, 2004, 1054:89-94.
[ 3] RMLiu, AFLi, ALSun, etal.Preparativeisolation
andpurificationofpsoralenandisopsoralenfromPsoralea
corylifoliabyhigh-speedcounter-currentchromatogra-
phy[ J] .JChromatogrA, 2004, 1057:225-228.
[ 4] RMLiu, QHSun, ALSun, etal.Isolationandpurifica-
tionofcoumarincompoundsfromCortexfraxinusbyhigh-
speedcounter-currentchromatography[ J] .JChromatogr
A, 2005, 1072:195-199.
[ 5] 吴征镒.新华本草纲要(第二册)[ M] .上海:上海科学
技术出版社 , 1991.240.
[ 6] 云南大学化学系有机组.石椒草化学成分的研究 [ J] .中
草药通讯 , 1977, 6:11.
[ 7] 何宇新 ,于杰 , 李玲.大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺
研究 [ J] .西北农业大学学报 , 2006, 28 (6):957-960.
PreparativeisolationandpurificationofrutinfromBoenninghauseniasessilicarpaLe vl
byhighspeedcounter-currentchromatography
YINLian-hong, XULi-na, HANxu, WAGNXiao-na, PENGJin-yong
(Colegeofpharmacy, DalianMedicalUniversity, Dalian116044, China)
Abstract:[ Objective] TodevelopanefectiveandrapidmethodforpreparativepurificationrutinfromBoenninghausenlasessilicarpa
Levl.[ Methods] Thecrudesamplesaftercleaning-uponmacroporousresincolumnchromatographfromrawmaterialtreatedbyetha-
nolwereseparatedbyhighspeedcounter-currentchromatography(HSCCC).Intheprocess, thesolventsystemcomposedofethyl
acetate-n-butanol-water(2∶1∶3, v/v/v)wasselected, andtheupperphasewasusedasthestationaryphase, andthelowerphase
wasusedasthemobilephase.TheobtainedfractionswereanalyzedbyHPLCandidentifiedbyUVandMS.[ Results] Rutinwithpu-
rityofover99% wasseparationfrom200mgofcrudesamplefromBoenninghauseniasessilicarpaLevl.[ Conclusion] Theestablished
protocolissimple, fast, andsuitableforlarge-scaleisolationandsuitableforseparationrutinfrommedicinalplants.
Keywords:BoenninghausenlasessilicarpaLevl;rutin;HighPerformanceLiquidChromatography;Highspeedcounter-curentchro-
matography
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