全 文 ：第 31卷第 3期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vol.31, No.3
2009年 6月 ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis Jun., 2009
文章编号:1000-2286(2009)03-0393-04
巴东木莲雌蕊柱头蛋白的提取
与双向电泳分离
刘国勇1, 2 ,梁宏伟 2 ,陈发菊 2＊
(1.三峡大学 化学与生命科学学院 , 湖北 宜昌 443002;2.三峡大学 生物技术研究中心 , 湖北 宜昌 443002)
摘要:优化巴东木莲雌蕊柱头蛋白的提取方法 ,并用双向电泳方法分离提取蛋白 , 得到分辨率高和重复性较好
的双向电泳图谱。在考马斯亮蓝 R-250染色胶上 ,开花前柱头蛋白有 858个蛋白点 , 开花后的聚合雌蕊柱头
有 865个蛋白点。有 1个蛋白点只在开花前柱头蛋白中表达 , 3个蛋白点只在开花后的聚合雌蕊柱头中表达 。
为分析花粉和柱头间的识别奠定基础。
关键词:巴东木莲;蛋白提取;双向电泳
中图分类号:Q949.781.1　　文献标识码:A
TheEstablishmentofExtractionMethodandTwo-dimensional
ElectrophoresisConditionsforAnalysisofManglietiapatungensisStigma
LIUGuo-yong1, 2 , LIANGHong-wei2 , CHENFa-ju2＊
　　(1.ColegeofChemistry＆LifeScience, ChinaThreeGorgesUniversity, Yichang443002, China;2.Bi-
otechnologyResearchCenterofChinaThreeGorgesUniversity, Yichang443002, China)
　　Abstract:StigmaproteinsofManglietiapatungensiswereextractedwithanoptimizedmethodandsepara-
tedbytwo-dimensionalelectrophesis.StainedwithCoomassieBriliantBlueR-250, 858 and865 protein
spotsweredetectedonthegelsofstigmabeforebloomandafterbloom, respectively.Therewerefourspots,
includingoneexclusiveexpressionproteinspotinstigmabeforebloomandthreeexclusiveexpressionprotein
spotsinstigmaafterbloom, whichwerediferentialyexpressed.Thegelswerehighlyreproducibleamongsepa-
rations, whichmaybehelpfulforanalysisofrecognitionbetweenpolenandstigma.
Keywords:Manglietiapatungensis;proteinextraction;two-dimensionalelectrophoresis
巴东木莲(Manglietiapatungensis)属木兰科的常绿阔叶树种 ,为我国特有种 ,属国家二级保护植
物 [ 1] 。巴东木莲不仅在研究植物系统发育与演化上具有重要的科学意义 ,而且其树形优美 ,花大美丽 ,
具有很高的观赏价值 。现仅分布于我国西南局部狭小区域 ,林下幼苗和幼树极为罕见 ,自然繁殖更新能
力严重衰退 ,处于濒危状态 。目前对巴东木莲的研究仅局限于繁殖技术[ 2, 3] 、种子生物学 [ 4]以及其等位
酶的遗传多样性 [ 5]等方面。
收稿日期:2008-12-29　　修回日期:2009-02-26
基金项目:国家自然科学基金项目(30670202)和三峡大学博士启动基金资助项目
作者简介:刘国勇(1972 -), 男 ,副教授 , 博士 ,主要从事珍稀濒危植物的濒危机制 、发育机理 、保护和利用等方面
研究 , E-mail:gyliuwh@gmail.com;＊通讯作者:陈发菊 , E-mail:chenfj616@163.com。
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 31卷
　　双向电泳作为蛋白质组学研究中最有实用价值的核心技术之一 ,目前已广泛地应用于植物领域。
为了深入研究巴东木莲开花前后的差异表达蛋白和探索授粉相关蛋白 ,其雌蕊总蛋白质的提取及双向
电泳条件的建立是首要环节。由于植物中含有的大量色素 、酚 、醌等物质对等电聚焦有严重影响 ,去除
这些物质是进行研究的前提。因此 ,本文以巴东木莲雌蕊为材料 ,建立以木本植物雌蕊为研究对象的实
验体系 ,不仅能为进行雌蕊蛋白电泳分析提供技术手段 ,同时也能为分析根 、茎和繁殖器官提供参考 。
1　材料和方法
1.1　材料与试剂
供试巴东木莲雌蕊于 2007年采集于湖北省巴东县 。分别取开花前的花蕾 、开花后的聚合雌蕊柱
头 ,称重后液氮保存 ,带回实验室 , -80 ℃超低温保存备用 。
十二烷基磺酸钠(SDS)、丙烯酰胺 、亚甲基双丙烯酰胺均为 Sigma公司产品 。两性电解质 Biolyte和
蛋白定量试剂盒为 Bio-Rad公司产品 。尿素 、硫脲 、3-[ (3-胆烷酰胺丙基)-二甲铵 ] -1-丙磺酸
盐(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺 、低熔点琼脂糖 、预制固相 pH梯度胶条(ImmobilineDryStrips
pH3 ～ 10 ,非线性 18 cm)均为通用电气医疗集团生命科学部(GEHealthcareLifeSciences)产品。三氯
乙酸(TCA)、丙酮 、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等为国产分析纯 、交联聚乙烯基吡咯烷酮(Polyvinylpyrroli-
done, cross-linked, PVPP)为 Sigma公司产品 。
1.2　试验仪器
中通量垂直电泳系统 EtanDaltSixElectrophoresisUnit为通用电气医疗集团生命科学部产品。等
电聚焦仪 ProteanIEFCel、垂直稳压电泳仪 PowerPAC1000、PDQuestTM 2-D图像分析软件 、微型垂直
电泳槽 Mini-PROTEAN3等均为 Bio-Rad公司产品 。
1.3　雌蕊柱头蛋白的提取
采用三氯乙酸 /丙酮沉淀法提取巴东木莲雌蕊柱头蛋白 。
方法 1:称取保存在 -80 ℃冰箱中的材料 1 g,加入 100 g/L的 PVP和少量石英砂 ,液氮研磨后将
其悬浮于 15 mL含 100 g/LTCA(丙酮配制)液中 , -20 ℃沉淀 2 h。然后离心(4 ℃、14 000 r/min、
30 min),弃上清。沉淀悬浮于 15 mL冷丙酮 [含体积分数为 0.07% β -巯基乙醇 ] , 4℃下离心 ,
14 000 r/min、30min),重复上述操作 3次。室温风干沉淀 ,置于 -20 ℃下备用。
方法 2:同方法一类似 ,只是用 PVPP代替 PVP。
用样品水化液(7 mol/L尿素 、2 mol/L硫脲 、40 g/LChaps、10 g/LDTT, 2 g/LBiolyte)溶解沉淀 ,
离心(4℃、15 000r/min、30 min),上清液即为蛋白提取液 , -20℃保存。按照 Bradford方法 ,用 Bio-
Rad蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度 。
1.4　双向电泳
第一向等电聚焦是在 ProteanIEFCel上按照操作手册进行 。即雌蕊柱头蛋白提取物用水化液
(7mol/L尿素 、2 mol/L硫脲 、40 g/LCHAPS、 10 g/LDTT、2 g/LBiolyte)溶解 ,离心 (4 ℃、15 000r/
min、30 min),采用 18 cmpH3 ～ 10非线性 pH梯度的预制干胶条胶内水化上样。每根胶条上样体积
350 μL,聚焦至功率达到 60 000伏特小时左右。聚焦完成后 ,将胶条在平衡液 A(50 mmol/LTris-HCl
(pH8.8)、 6 mol/L尿素 、 300 g/L甘油 、 20 g/LSDS、 0.1 g/L溴酚蓝 、10 g/L二硫苏糖醇 )中平衡
15 min,接着在平衡液 B(50mmol/LTris-HCl(pH8.8)、6mol/L尿素 、300g/L甘油 、20 g/LSDS、0.1g/L
溴酚蓝 、25 g/L碘代乙酰胺)中平衡 15min。然后在 EtanDaltSixElectrophoresisUnit上进行第二向的
垂直电泳 ,分离胶浓度为 12.5%。
1.5　凝胶染色
根据上样量的多少 ,分别采用考马斯亮蓝 R-250染色或银染方法对凝胶进行染色 。银染是用 GE
公司的蛋白质银染试验盒按照操作手册进行。
1.6　图像采集与分析
染色后的双向电泳凝胶用 ASCI(AGFA)扫描仪透射扫描 ,光学分辨率采用每英寸 300像素
(PPi), 8位色。将扫描得到的数字化图像文件用 PDQuest软件分析 ,差异显著性分析用 T检验。筛选开
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第 3期 刘国勇等:巴东木莲雌蕊柱头蛋白的提取与双向电泳分离
图 1　雌蕊柱头蛋白的 SDS-PAGE图谱
Fig.1　Theproteinpatternsof
ManglietiapatungensisstigmabySDS-PAGE
　　(注:M为低分子量标准蛋白;1为加入 PVP提取的
蛋白 , 上样量为 10 μg;2为加入 PVP提取的蛋白 , 上样量
为 15 μg;3为加入 PVPP提取的蛋白 , 上样量为 30 μg。)
图 2　方法 1提取雌蕊柱头蛋白的双向电泳图谱
Fig.2　Therepresentative2-DEmaps
oftotalstimgaproteinswithextractionmethod1
花前的花蕾和开花后的聚合雌蕊柱头中的差异表达
蛋白点 ,只有在 3次单独制备的样品之间重复性好
的差异蛋白点才作下一步的分析。
2　结果与分析
2.1　PVPP和 PVP对蛋白提取的影响
从图 1可以看出 ,用方法 1提取的雌蕊柱头蛋
白只能分离出 7 ～ 8条清晰的条带 ,且当每个泳道的
蛋白上样量增加到 15 μg时出现了明显的纵条纹;
而用方法 2提取的雌蕊柱头蛋白能分离出约 20条
清晰的条带 ,且每个泳道的蛋白上样量能增加到
30 μg以上 。说明用方法 1提取的雌蕊柱头蛋白种
类少 、蛋白溶解性差 ,样品中有较多的不溶性颗粒 ,
影响了 SDS-PAGE的分离效果。
2.2　不同方法提取雌蕊柱头蛋白的双向电泳图谱
比较分析
图 2为采用方法 1提取雌蕊柱头蛋白的双向电
泳图谱 ,双向电泳后经过银染 、扫描获得 2-DE胶
图像。由于样品中含有的离子等杂质比较多 ,等电
聚焦(IEF)过程中电流比较大 ,所以 2-DE图谱模
糊不清 ,蛋白分离效果差 ,蛋白点有拖尾现象 ,并存
在横竖条纹干扰 ,给软件识别带来很大的困难 。图
3A和图 3B为采用方法 2分别提取开花前的花蕾 、
开花后的聚合雌蕊柱头蛋白的双向电泳图谱 ,双向
电泳后经过考马斯亮蓝 R-250染色 、扫描获得 2-
DE胶图像 。从蛋白点的分离效果 、蛋白点的数量 、
纵向和横向条纹的情况等几个方面考虑 ,所得 2-
DE图谱质量较高。
2.3　蛋白点的检测
开花前的花蕾和开花后的聚合雌蕊柱头的总蛋
白从制备到双向电泳分别重复 3次 ,单独制备的柱
头总蛋白的 2 -DE图谱重复性都很好 。利用
PDQuest7.2.2软件对图 3A和图 3B进行分析 ,开花前和开花后的的 2-DE图谱非常相似 ,表现在蛋白
点的数目 、位置和表达量都非常相似。多数蛋白集中在等电点 4.5 ～ 8.5,分子量 25.0 ～ 88.0 kD的范
围内。在考马斯亮蓝 R-250染色胶上 ,开花前柱头蛋白有(858±4)个蛋白点 ,开花后的聚合雌蕊柱头
有(865±3)个蛋白点。通过 PDQuest软件分析 ,有 1个蛋白点 [图 3(A), p1 ]只在开花前柱头蛋白中表
达 , 3个蛋白点 [图 3(B), p2 ～ p4 ]只在开花后的聚合雌蕊柱头中表达(T检验 , P<0.05)。
3　讨　论
蛋白质样品的制备是 2-DE能否成功的关键 ,直接影响 2-DE的分辨率和重复性 [ 6] 。植物细胞内
含有很多的次生代谢物(如酚类物质)严重影响蛋白的提取和电泳的效果 [ 7] 。本实验采用三氯乙酸 -
丙酮沉淀蛋白 ,在匀浆研磨时加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)来吸附酚 、
醌类物质。通过对比加入 PVP或 PVPP的分离效果发现 ,加入 PVP去除酚 、醌类物质的效果差 ,提取蛋
白的溶解性差;而加入 PVPP去除酚 、醌类物质的效果好。这可能是由于 PVP和 PVPP尽管都能吸附
酚 、醌类物质 ,但是 PVP是可溶性的 ,而 PVPP是不溶性的 ,前者吸附的酚 、醌类不能通过离心的方法去
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 31卷
图 3　方法 2提取的雌蕊柱头蛋白的双向电泳图谱
Fig.3　Therepresentative2-DEmapsoftotal
stimgaproteinswithextractionmethod2
　　(注:A为开花前的雌蕊柱头蛋白;B为开花后的聚合
雌蕊柱头;C为 A和 B中差异蛋白点区域的放大图片。)
除 ,而后者可以通过离心去除吸附的酚 、醌类干扰物
质 。在三氯乙酸 -丙酮沉淀后 ,用预冷的含 0.7 g/Lβ
-巯基乙醇的丙酮将沉淀洗 3遍 ,可更好地去除干扰
物质。在蛋白质裂解液中加入 7 mol/L尿素 、2 mol/L
硫脲 、40 g/LCHAPS以增加样品的溶解性。
实验重复性是应用双向电泳进行研究的重要前
提 。本实验中采用固相 pH梯度预制胶条 ,减少等电
聚焦过程中 pH的漂移;第一向等电聚焦采用能同时
对 12根 IPG胶条聚焦的等电聚焦仪 ProteanIEFCel,
第二向 SDS-PAGE采用能同时运行 6胶的中通量垂
直电泳系统 EtanDaltSixElectrophoresisUnit,从而保
证蛋白质斑点数目 、等电点 、分子量等在多次不同实验
中具有较好的重复性。另外 ,采取分步升压的方法来
到达设定的最终最高聚焦电压 10 000 V,从而能缩短
聚焦时间 ,提高分离效果。
双向电泳分离后用 PDQuest软件分析 ,有 1个蛋白点 [图 3(A), p1 ]只在开花前的柱头蛋白中表达 ,
3个蛋白点 [图 3(B), p2 ～p4 ]只在开花后的聚合雌蕊柱头中表达 ,这些点可能是与巴东木莲授粉相关
的蛋白 。本研究为进一步通过质谱鉴定这些差异蛋白点 ,确定与巴东木莲授粉相关的蛋白和基因克隆
提供了坚实基础 。
致谢:本实验得到了中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室聂品研究员的大力支持 ,特此
致谢。
参考文献:
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