全 文 ：收稿日期：2013 - 03 - 17
作者简介：杜虹（1976-），女，汉族，广东省澄海市人，教授. E-mail：hdu@stu.edu.cn
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31000189）；国家海洋局海洋公益性行业专项资助项目（201105008-9）
文章编号：1001 - 4217（2013）04 - 0034 - 07
大型海藻龙须菜蛋白提取及双向电泳体系的优化
王会芳，颜海波，杜 虹
（汕头大学生物系，广东 汕头 515063）
摘 要：本文以龙须菜为材料，比较了尿素/硫脲法，改良丙酮沉淀法，Trizol法 3种不同蛋
白质提取方法；并从胶条长度及 pH范围，上样量，分离胶浓度等因素探讨了双向电泳技术
体系的优化. 结果表明：采用 Trizol法辅以超声破碎提取龙须菜总蛋白效果优于尿素/硫脲法
和改良丙酮沉淀法；同时，采用 pH 4-7，11 cm胶条，上样量为 800 μg，分离胶浓度为 12%
的双向电泳条件可获得背景清晰，分辨率好的二维电泳图谱. 该体系也可以为龙须菜属和江
蓠属其他海藻的蛋白质双向电泳分析提供参考.
关键词：龙须菜；蛋白提取；双向电泳
中图分类号：Q 503 文献标识码：A
0 引 言
龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）隶属红藻（Rhodophyta），是龙须菜属中重要的大型
海藻. 龙须菜所产的琼胶含量高，品质好[1]，同时还具有生长快、能适应较高温度等特
点，因此在南方被大面积养殖. 此外，龙须菜可以作为氮（N）、磷（P）等营养元素的生物
过滤器，对净化海水和防止赤潮发生起到重要作用，因此成为修复富营养化海水的研究
热点[2-3] . 在栽培过程中，营养盐，温度等外界环境条件的变化会影响龙须菜的生长，
所以开展龙须菜抗逆机制的研究有重要意义. 目前已在基因水平开展了有关龙须菜抗逆
机制的研究工作，如顾颖慧[4]探讨了高温胁迫下热激蛋白 hsp70的响应，证实了 hsp70
在耐高温龙须菜品系中有更高的表达量，而在蛋白质水平的有关研究很少. 因此开展逆
境胁迫下龙须菜差异蛋白质组学的研究对龙须菜生理及抗逆机制研究有重要意义. 双向
电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术，但适合龙须菜蛋白质组学的双向电泳体系还未
建立.
文章从龙须菜蛋白抽提方法，双向电泳胶条长度和 pH范围，上样量，分离胶浓度
等方面进行了探讨，为龙须菜逆境蛋白质组学水平的研究奠定基础，同时为龙须菜属和
江蓠属其他大型海藻蛋白质组学研究提供参考.
2013年 11月 汕头大学学报（自然科学版） 第 28卷 第 4期
Nov. 2013 Journal of Shantou University (Natural Science ) Vol.28 No.4
1 材料与方法
1.1 材料预培养
龙须菜由汕头大学南澳实验站提供. 于 20 ± 1℃和 2000 lx光强（光周期为 12 h : 12
h）的条件下用过滤海水（盐度为 30‰、pH8.0），预培养一周，挑选色泽紫红、枝芽完整、
健康匀称的龙须菜藻体备用.
1.2 蛋白样品提取
取龙须菜嫩茎部分适量，加入液氮研磨成粉状，置-80 ℃备用. 采用如下三种方法
提取蛋白：
尿素/硫脲法[5]提取蛋白：取 1.5 g上述龙须菜粉末，加入 1.5 mL尿素/硫脲裂解液，
常规超声破碎，于 4℃，12000 g，离心 15 min，取上清，置-20℃备用.
改良丙酮沉淀法[6]提取蛋白：将 2.5 mL预冷的丙酮加入 500 μL含蛋白提取物的尿
素/硫脲裂解液中，-20℃过夜沉淀蛋白，预冷丙酮清洗 2次，室温下晾干，加入 500 μL
裂解缓冲液重新溶解蛋白.
Trizol[7]提取蛋白：向 1.5 g龙须菜粉末中加入 3 mL Trizol，振荡 1 min，5 s/5 s超声
破碎 5 min，加入 600 μL氯仿，振荡 15 s，室温下放置 5 min，4 ℃，12000 g，离心 15
min，去除上层白色液体，加入 1 mL乙醇，4 ℃，2000 g，离心 5 min，取上清，加入 6
mL异丙醇，室温静置 30 min，4℃，12000 g，离心 20 min，取沉淀，95%乙醇清洗，室
温晾干，置-80℃备用.
1.3 Trizol提取蛋白样品条件的优化
从 Trizol使用体积和是否超声破碎两个方面进行优化，Trizol分别取 2 mL，3 mL，4
mL，按是否超声破碎得到 6个组合. 蛋白用 500 μL水化上样缓冲液溶解，然后用考马
斯亮蓝法测蛋白浓度.
1.4 双向电泳
蛋白样品用考马斯亮蓝法测定浓度，根据上样量取一定体积蛋白样品于聚焦槽，设
置聚焦程序，进行第一向等电聚焦.
等电聚焦结束后，将胶条从聚焦盘中取出，去掉胶条背面的矿物油，然后在水化盘
中对胶条进行平衡，分别于平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ中平衡 15 min.
平衡好的胶条进行第二向 SDS-PAGE分离，先低压 80 V电泳至凝胶 1 cm处，调
电压至 120 V，至指示剂电泳至凝胶底部边缘时停止 . 凝胶用超纯水冲洗，然后用
0.25%考马斯亮蓝 R-250染色液染色 30 min，最后用脱色液进行脱色，直至蛋白点清晰
可见.
1.5 图像分析
用 hp扫描仪 HP ScanJet 5300C扫描脱色后的 2-DE凝胶，分辨率设为 600 dpi. 用
Bio-Rad公司的 PDQuest 8.0.1软件对图像进行处理分析，包括背景消减、斑点检测.
2 结 果
2.1 不同蛋白提取方法对 2-DE图谱的影响
如图 1所示，取 300 μg蛋白质进行电泳，发现三种不同蛋白提取方法的 2-DE效果
王会芳等： 大型海藻龙须菜蛋白提取及双向电泳体系的优化第 4 期 35
（c） Trizol（a）硫脲/尿素 （b）丙酮
图 1 不同蛋白提取方法对龙须菜蛋白质二维电泳结果的影响
有很大不同，其中 Trizol法效果最佳. PDQuest软件分析显示裂解液、丙酮、Trizol分离
到的蛋白点分别约为 78，80，119.
2.2 Trizol法提取龙须菜蛋白条件的优化
如表 1所示，6种处理所得蛋白浓度差异较大，第 6组是最佳组合，约是第 1组的
3倍多. 但第 6组相较于第 4组相差不大，说明随着 Trizol体积的增加，蛋白得率越高，
而且经超声破碎处理蛋白质的得率显著提高.
2.3 不同长度胶条对蛋白质双向电泳结果的影响
如图 2所示，当胶条为 7 cm，pH范围为 3-10时，得到 119个蛋白点，且蛋白点较
集中，有多点重叠的现象，不能检测出尽可能多的蛋白点，而胶条为 11 cm，pH范围为
4-7时，得到 136个蛋白点，且蛋白点在整张胶上分布均匀，得到了更好的分离.
2.4 蛋白质上样量对 2-DE结果的影响
如图 3 所示，上样量不同导致 2-DE 效果存在较大差异. 实验采用 11 cm 胶条，
表 1 Trizol体积和超声破碎对蛋白浓度的影响
*样品编号 Trizol体积（mL） **超声破碎 ***蛋白浓度（μg·μl-1）
1 2 无（No） 1.03 ± 0.12
2 2 有（Yes） 1.24 ± 0.21
3 3 无（No） 2.48 ± 0.47
4 3 有（Yes） 3.14 ± 0.23
5 4 无（No） 2.59 ± 0.37
6 4 有（Yes） 3.21 ± 0.47
*样品均为液氮研磨后的粉末 1.5 g，**超声破碎条件为：3 min，间隔时间为 5 s，***南京建成考
马斯亮蓝试剂盒确定蛋白浓度
汕头大学学报（自然科学版） 第 28 卷
图 2 不同长度胶条对蛋白质双向电泳图谱的影响
（b） 11 cm，pH4-7（a） 7 cm，pH3-10
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图 4 不同浓度分离胶对二维电泳结果的影响
（a） 10 %分离胶 （b） 12 %分离胶
（a） 11 cm 500 μg （b） 11 cm 800 μg
图 3 不同上样量的蛋白质双向电泳图谱比较（11 cm IPG）
王会芳等： 大型海藻龙须菜蛋白提取及双向电泳体系的优化第 4 期
500 μg，800 μg两种上样量. 500 μg的上样量可以检出大约 136个蛋白点，低丰度蛋白
检出的量很少；800 μg的上样量可以检出大约 156个蛋白点，分离到更多的蛋白点.
2.5 不同分离胶浓度对 2-DE结果的影响
实验设置了两种不同浓度分离胶 10%分离胶和 12%分离胶进行 2－DE分析，结果如
图 5所示，当分离胶浓度为 10%时，可见约 125个左右的蛋白点，低分子量蛋白无法分
离到；当分离胶浓度为 12%时，可见约 161个蛋白点.
3 分析与讨论
3.1 关于蛋白质提取方法
蛋白质组学能否成功的首要关键因素就是蛋白质样品的制备[8-9] . 合适的蛋白质制
备方法是获得良好 2-DE图谱的前提[10-11] .
常见的植物蛋白质提取方法有：尿素-硫脲提取法，TCA丙酮沉淀法等[12-13]，但没
有一种方法是适用于所有植物的. 文章也开展了裂解缓冲液，TCA丙酮对龙须菜蛋白质
样品制备的研究，同时尝试了 Trizol法提取龙须菜蛋白质，但发现不同提取方法特点不
同. 裂解液中含有变性剂、表面活性剂和还原剂. 其中变性剂可避免蛋白质被分解，表
面活性剂和还原剂可促进蛋白质的溶解. 虽然裂解液法步骤简单，但蛋白损失较多，所
得蛋白质点数少，如图 1-a. 丙酮沉淀法是一种传统且有效的蛋白质提取方法，主要通
过沉淀蛋白而提取蛋白质，但最大缺点是得到的蛋白质重新溶解较困难，而且样品中的
多糖等干扰成分很难除去，最终导致 2-DE图谱上有明显的横纵条纹[14]，如图 1-b，丙
酮沉淀法得到的二维图谱背景不清晰，蛋白点弥散且拖尾 . 相比于裂解液、丙酮，
37
Trizol法得到的 2-DE图谱如图 1-c所示，得到的蛋白点多，低丰度蛋白得到很好的分
离，图谱背景更为清晰. 除此之外，Trizol试剂还有两个优点. 首先，操作简单，耗时
短，一般只需几个小时，降低了蛋白降解和损失的风险. 其次，可以有效的移除核酸，
糖类等大多数干扰物质，提高蛋白质的纯度，有利于蛋白质重新溶解. 该法在野牛草幼
苗叶片[15]及黄花苜蓿幼苗中[16]也得到了较好的结果. 因此，Trizol法更适合龙须菜总蛋
白的提取.
根据 Bio-rad说明书及实验室预实验，对 7 cm胶条而言，蛋白浓度在 2-4 μg/μL之
间是合适的. 浓度太低，不适宜上样；若浓缩，杂质浓度也升高，且样品变得黏稠，不
适合双向电泳，所以 Trizol法对蛋白质浓度的影响关系到双向电泳样品制备是否成功.
Trizol用量和是否超声破碎都会影响最终的蛋白质浓度，实验结果显示，蛋白质浓度与
Trizol用量成正相关，经过超声破碎处理蛋白质浓度可显著提高. 第 6组与第 4组蛋白
浓度可分别达到 3.14±0.23 μg /μL和 3.21±0.47 μg/μL，但因 Trizol试剂较贵，而两组相
比，蛋白浓度相差不大，因此综合考虑，Trizol 3 mL，经超声破碎处理的提取条件更合适.
3.2 二维电泳条件优化
胶条 pH范围、上样量和 SDS-PAGE胶浓度等因素都会影响双向电泳的分离效果[17-19] .
胶条的长度与 pH范围影响着双向电泳蛋白的分离效果，pH范围较大时，虽然得
到的蛋白种类多，但高丰度蛋白过于集中，会出现蛋白点重叠，不易区分的现象；pH
范围较小时，蛋白有较好的分离效果，且背景清晰，但会丢失一些蛋白[20] . 实验结果显
示当胶条条件为 7 cm，pH 3-10时，蛋白点在凝胶上过于集中，许多蛋白点连在一起没
有达到分离的目的，而且后期软件分析时会带来更多误差；当胶条为 11 cm，pH 4-7
时，蛋白点在整张凝胶上分布均匀，蛋白点彼此界限分明，没有多点连接的现象，在很
大程度上提高了分辨率，分离到更多的蛋白点. 这与陈蕊红[21]王娜[22]的结论一致.
合适的蛋白上样量是双向电泳成功的关键因素. 蛋白上样量太少，分离到的蛋白点
数量少，低丰度蛋白因不易被检测或丢失而不能被分离到；但上样量多也会导致一些问
题出现，如造成胶条不能充分吸收蛋白样品，离子浓度升高，这样在浪费样品的同时也
会导致等电聚焦时电压上升缓慢甚至不能达到设定电压，从而影响聚焦效果[20，23]. 实验
结果显示当上样量为 500 μg时，虽然图谱背景清晰，但蛋白丰度偏低，一些低丰度蛋白
不能被检测出，部分低丰度蛋白点很弱，影响了点的分析与鉴定；上样量 800μg时，蛋白
丰度提高，更多低丰度蛋白得到分离，而且没有发现多点重叠的现象，因此，龙须菜蛋白
质 2-DE第一向等电聚焦在使用 11 cm，pH 4-7的胶条时，800 μg的上样量较合适.
SDS-PAGE胶浓度不同，蛋白质分离的效果也存在差异. 不同物种的最佳分离胶浓
度不同，如在小麦中，较为适宜的分离胶浓度为 12%[21]；但是在水稻中，10%的分离胶
浓度有更好的分离效果[24] . 有时要根据研究目的调整分离胶浓度，如参与逆境胁迫的蛋
白质，它们分子量大小不一，因此要综合考虑. 结果显示，当胶浓度为 10%时，低分子
量的蛋白质被丢失，未能在胶上得到很好地分离，而且蛋白点在胶上的位置偏下；改用
12%胶浓度后，蛋白质点在胶上的分布不再靠近凝胶底端，更多低分子量蛋白获得了分
离. 因此 12%的胶浓度更适合龙须菜全蛋白 2-DE的分离.
本实验通过对龙须菜蛋白质提取及双向电泳一系列条件的优化，建立了一套适合龙
须菜全蛋白分析的双向电泳系统，为龙须菜逆境下蛋白质组的深入研究奠定了基础；同
时为龙须菜属和江蓠属其它大型海藻蛋白质组学研究提供参考.
汕头大学学报（自然科学版） 第 28 卷38
王会芳等： 大型海藻龙须菜蛋白提取及双向电泳体系的优化第 4 期
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Optimization of Extraction Method and Two
Dimensional Electrophoresis Conditions for Proteome of
Macroalgae Gracilaria Lemaneiformis
WANG Hui-fang，YAN Hai-bo，DU Hong*
（Department of Biology，Shantou University，Shantou 515063，Guangdong，China）
Abstract： In order to establish a two-dimensional polyareylamide electrophoresis（2DE）
system for proteomic study of G. lemaneiformis， three different protein extraction
methods（sodium phosphate buffer grinding method，TCA/acetone precipitation and Trizol
method）were compared. Electrophoresis conditions were optimized, including the length of
IPG strip，loading quantity，the concentration of SDS-PAGE gel. The result showed that
Trizol method can display much more protein spots than the other two methods. Based
on the Trizol extracting method， lower backgrounds and higher resolution 2-DE image
were obtained using 800μg protein loading quantity； 11 cm， pH 4 -7IPG strip； 12%
SDS-PAGE gel. A suitable two dimensional electrophoresis system was established for
proteomic analysis of G. lemaneiformis and other macroalgae.
Key words：Gracilaria lemaneiformis；protein extraction；two dimensional electrophoresis
（上接第 39 页）
u.cn/Notice.aspx?id=18fd63f6-bfca-4b92-a7f8-5adb8ce8e374.
Accomplishment of SIP2 Integration and Automatic
Self-determination Function with RFID Self-check
Machine
DONG Chao-feng，MA Qing-zhong
(Library of Shantou University，Shantou 515063，Guangdong，China)
Abstract： In this paper， the accomplishment of SIP2 integration and automatic self -
determination function with RFID self -check machine is discussed. This paper also
analyzes how to use windows batch to solve the following two major problems found in
SIP2 during the process of runing self-check machine---failure to run SIP2 after startup
and abnormity of SIP2 in self-check machine. The key to rightly use footnote depends
on whether or not the system has port 6001 to monitor SIP2.
Key words：RFID；self-check machine；SIP2
汕头大学学报（自然科学版） 第 28 卷80