全 文 ： 2007, Vol. 28, No. 11 食品科学 ※生物工程370
收稿日期：2007-08-20 *通讯作者
基金项目：吉林省科技厅应用基础研究项目(20050567)
作者简介：石文娟(1986-)，女，本科生，研究方向为营养与功能食品。
利用纤维素酶提取笃斯越桔花青素的研究
石文娟，林松毅，刘静波*，王二雷
(吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室，吉林 长春 130062)
摘 要：本实验研究纤维素酶法提取笃斯越桔中的花青素的工艺条件，重点考察了料液比、酶用量、温度、pH
及酶解时间等因素对花青素提取率的影响，通过L16(44)正交试验优化出酶法提取的长白山野生笃斯越桔果实中花青
素的最佳工艺参数为：料液比1:50，pH为1.5，加酶量2%，温度60℃，酶解时间1h。在此条件下，花青素
提取率为6.105%。
关键词：笃斯越桔；纤维素酶；花青素
Study on Extraction of Anthocyanins in Vaccinium ulig osumL. with Cellulase
SHI Wen-juan，LIN Song-yi，LIU Jing-bo*，WANG Er-lei
(Laboratory of Nutrition and Functional Food, College of Quartermaster Technology, Jilin University,
Changchun 130062, China)
Abstract ：Cellulase was used to extract anthocyanins in wild Vaccinium uliginosumL. from Changpbai Mountain area, and
then the ratio of solid to liquid, the amount of Cellulase, the temperature, the pH and the time of enzymolysis were investigated
emphatically. Through single factors and L16(44) orthogon l de ig on the extraction process, the optimal parameters were obtained
as follows: the ratio of solid to liquid 1:50, pH 1.5, the amount of Cellulase 2%, temperature 60 ℃ and time of nzymolysis 1 h.
Based on the above conditions, the extraction rate was 6.105%.
Key words：Vaccinium uliginosum L.；cellulase；anthocyanins
中图分类号：Q814.9 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)11-0370-04
国外有专家研究发现：越桔是花青素含量最丰富
的水果，其中所含的花青素具有很强的生物活性，在
抗氧化、抗癌及抗肿瘤等方面具备特别功效，在清除
O2自由基、DPPH自由基、抗小鼠微粒体膜脂氧化等
方面能力优越[1]。此外，笃斯越桔中花青素对促进视网
膜视紫红素的再生成和改善眼睛晶状体混浊方面有神奇
的功效。
目前，国内提取花青素多采用酸性的甲醇、乙
醇、水等极性溶剂提取法、压榨法、CO2超临界萃取
法等，这些方法提取花青素的得率相对较低，效果不
够理想，采用纤维素酶破壁提取花青素提取工艺操作简
便，花青素的得率与传统方法相比有很大的提高。
1 材料与方法
1.1材料
笃斯越桔：长白山野生笃斯越桔，由吉林大学军
需科技学院营养与功能食品研究室提供；纤维素酶 天
津泛弗贸易有限公司；羧甲基纤维素钠盐 天津市博迪
化工有限公司；3,5-二硝基水杨酸显色剂(DNS显色剂)、
2mol/L氢氧化钠溶液、葡萄糖溶液、Na-AC缓冲液、
2%盐酸甲醇溶液等均由吉林大学军需科技学院营养与功
能食品研究室提供。
1.2仪器与设备
超纯水机 美国Millipore公司；752PC型紫外可见
分光光度计 上海光谱仪器有限公司；AG204型电子天
平 瑞士梅特勒-托利多公司；LGJ-50型真空冷冻干燥
机 北京博医康技术公司；FW-200高速万能粉碎机 北
京中兴伟业仪器有限公司；HH-S数显恒温水浴锅 常
州市国立试验设备研究所。
1.3方法
1.3.1纤维素酶活力的测定方法
本实验采用CMC糖化力方法对纤维素酶活力进行
测定。原理是酶对CMC的糖化力水解作用。葡萄糖是
还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸(DNS)]还原为棕红色的
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2.0
1.5
1.0
0.5
0
0 2 4 6 8
吸
光
度
葡萄糖量(μmol)
图1 酶活力测定标准曲线
Fig.1 Standand curve of cellulase activity
5
4
3
2
1
0
1:251:501:751:1001:125
提
取
率
(
%
)
料液比
图2 料液比对花青素总提取率的影响
Fig.2 Relationship between extraction rate and ratio
of [S]/[L]
氨基化合物，在一定浓渡范围内，还原糖的量与该物
质溶液颜色的深浅成比例[2-3]，可用分光光度计进行测
定，该方法可表示纤维素酶的总活力。
1.3.2样品液中花青素的含量测定
称取一定量笃斯越桔果实冻干粉，加入一定pH的
Na-AC缓冲液定容到V1体积，然后加入一定量的纤维素
酶进行酶解反应，设定反应时间，到达反应时间后将
样液进行抽滤，精密量取V3体积的滤液到V2体积的容
量瓶中，用2%的盐酸甲醇溶解并定容到刻度。2%的
盐酸甲醇作空白，在546nm处测定其吸光度。根据花
青素含量的标准曲线方程及下列公式计算其含量。
A V2 1
花青素的含量(%) = ——×V1×——×——————×100
K V3 W×10
6
式中，A为吸收峰位置处的吸光度；K为准曲线
斜率；V1为液体积(ml)；V2为定容的滤液总体积ml)；
V3为V2中吸取用于检测的提取液体积(ml)；W为初重
(g)。
1.3.3影响笃斯越桔果实中花青素提取率因素分析
研究笃斯越桔果实冻干粉与pH 4.6醋酸钠缓冲溶液
定容体积的比值(g/ml)分别为1:25、1:50、1:75、1:100、
1:125；加酶量分别为0%、1%、2 %、3%、4%、5%；
酶解温度分别为20、30、40、50、60、70℃；pH
分别为0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5；酶解时
间分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3h等不同试验条件
对笃斯越桔果实中花青素提取率的影响情况，通过测定
吸光度并计算花青素的提取率进行直观对比分析。
1.3.4L16(44)正交试验设计方案
结合单因素试验结果选择料液比、加酶量、温度
及pH为考察因素，以花青素提取率为考察指标，按
L16(44)正交试验设计方案优化纤维素酶法提取花青素的最
佳工艺参数，因素水平如表1所示。
因素
水平
A料液比 B加酶量(%) C温度(℃) D pH
1 1:25 2 30 0.5
2 1:50 2.4 40 1.5
3 1:75 2.8 50 2.5
4 1:100 3.2 60 3.5
表1 L16(44)正交试验因素和水平计表
Table 1 Factors and levels of L16(44) orthogonal test
2 结果与分析
2.1纤维素酶活力测定标准曲线与酶活力
将酶活力测定中制作标准曲线实验中所得的数据进
行回归处理，得到酶活力测定标准曲线(如图1所示)，
线性回归方程y=0.256x+0.0101，(R2=0.9963)，拟和度较
高，曲线线性良好，可信程度较高。
将纤维素酶活力测定实验中测得样品的吸光度带入
标准曲线，得到样品中葡萄糖含量，根据回归方程计
算得到该纤维素酶活力为11267U。
2.2料液比对花青素总提取率的影响情况
在pH为4.6，温度30℃，加酶量2%，酶解时间
1h的条件下进行酶解反应，结果如图2所示，当料液
比在1:25到1:50之间时，提取率呈上升趋势，1:50时
达到最大，当料液比大于1:50时提取率开始下降，下
降趋势明显，故料液比选择1:50最佳。
2.3加酶量对花青素总提取率的影响情况
保持pH4.6，温度30℃、酶解时间1h、料液比为
1:50的条件，选择不同的加酶量进行酶解反应，结果如
图3所示。当加酶量为0%～3%时提取率呈上升趋势，
当加酶量大于3%时提取率开始下降，加酶量为3%时
提取率最好，但经过对提取结果比较，发现加酶量2%
与3%提取率相差为0.155%。从经济方面考虑，认为加
酶量选择2%更加适合。
2.4酶解温度对花青素提取率的影响情况
2007, Vol. 28, No. 11 食品科学 ※生物工程372
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
0 0.51 1.52 2.53 3.5
提
取
率
(
%
)
酶解时间(h)
图6 酶解时间对花青素总提取率的影响
Fig.6 Relationship between extraction rate and time of enzyme
digestion
选择料液比为1:50、加酶量2%、pH4.6、温度
30℃、酶解时间1h的条件进行酶解反应，结果如图4
所示。提取率随温度变化程度不明显，在温度为20～
50℃时提取率上升，当温度超过50℃时，提取率开始
下降， 50℃时提取率最高，所以提取温度选择50℃。
2.5pH对花青素总提取率的影响情况
在物料比为1:50、加酶量2%、温度50℃、酶解
时间为1h的条件下，考察pH对花青素提取率的影响，
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
0 1 2 3 4 5 6
提
取
率
(
%
)
加酶量(%)
图3 加酶量对花青素总提取率的影响
Fig.3 Relationship between extraction rate and amount of
cellulase
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
10 20 30 40 50 60 70 80
提
取
率
(
%
)
酶解温度(℃)
图4 温度对花青素总提取率的影响
Fig.4 Relationship between extraction rate and temperature
从图5可以看出，随着pH的升高提取率呈下降趋势，
pH0.5到pH3.5下降程度特别小，从pH3.5之后下降程
度明显增大，从整个图来看，当pH为0.5时花青素提
取率最高，但pH3.5时的提取率与pH0.5时的提取率相
差只有0.375%，而缓冲液配制到pH为0.5需耗费大量
冰醋酸，同时酸性太大对酶的活力具有一定影响，所
以从经济和酶活力保证两方面综合考虑认为pH选择3.5
更好。
2.6酶解时间对花青素总提取率的影响情况
选择料液比为1:50、pH3.5、加酶量2%、温度50℃，
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.00
0
.
5
1
.
0
1
.
5
2
.
0
2
.
5
3
.
0
3
.
5
4
.
0
4
.
5
5
.
0
5
.
5
6
.
0
6
.
5
7
.
0
提
取
率
(
%
)
pH
图5 pH值对花青素总提取率的影响
Fig.5 Relationship between extraction rate and pH value
表2 L16(44)正交试验结果及极差分析
Table 2 Data of L16(44) orthogonal test
因素
试验号 A B C D
提取率
料液比 加酶量(mg)温度(℃) pH
(%)
1 1 1 1 1 1 5.311
2 1 2 2 2 2 5.090
3 1 3 3 3 3 4.874
4 1 4 4 4 4 4.938
5 2 1 2 3 4 6.002
6 2 2 1 4 3 5.908
7 2 3 4 1 2 6.026
8 2 4 3 2 1 6.017
9 3 1 3 4 2 5.226
10 3 2 4 3 1 5.245
11 3 3 1 2 4 5.354
12 3 4 2 1 3 5.353
13 4 1 4 2 3 5.673
14 4 2 3 1 4 5.229
15 4 3 2 4 1 5.163
16 4 4 1 3 2 5.175
k1 5.0535.5535.4375.485.434T总=86.583
k2 5.9885.3685.4025.5345.379
k3 5.2945.3545.3375.3245.452
k4 5.31 5.371 5.475.3095.381
R 0.9350.1990.1330.2250.073
主次因素 A＞D＞B＞C
最优组合 A2 B1 C4 D2
373※生物工程 食品科学 2007, Vol. 28, No. 11
表3 方差分析表
Table 3 Analysis of variance
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性(α)
料液比 1.94 3 114.1189.28 0.05
加酶量(mg) 0.107 3 6.2949.28
温度(℃) 0.039 3 2.2949.28
pH 0.151 3 8.8829.28
误差 0.02 3
总变异 2.257 15
在不同的酶解时间下进行酶解反应。结果(如图6)表明，
反应时间在0.5h到1h之间提取率略有上升，超过1h时
提取率开始下降，当反应时间超过1.5h时提取率下降比
较明显，综合比较反应时间选择1h比较合理。
2.7L16(44)正交试验结果与分析
考察料液比(A)、加酶量(B)、酶解温度(C)、酶
解pH(D)为四个主要因素，以花青素提取率为衡量指
标， L16(44)正交试验设计结果如表2所示。方差分析
如表3所示。
表2极差分析结果表明，影响纤维素酶提取笃斯越
桔花青素因素依次为料液比＞p H＞加酶量＞酶解温
度；最优组合为A2B1C4D2，即：料液比为1:50，pH
为1.5，加酶量2%，酶解温度60℃，酶解反应时间1h。
由表3方差分析可以看出，料液比对长白山野生笃斯越
桔果实中花青素提取率影响显著(α=0.05)。
由于最优组合为A2B1C4D2没有出现在L16(44)正交试
验的16组试验组合中，对该组合进行验证实验，花青
素提取率为6.105%。
参考文献：
[1] 卢艳花, 邹彦平, 等. 欧洲越桔和笃斯越桔体外抗氧化活性比较[J].
中草药, 2004, 35(6): 674-679.
[2] 王琳, 刘国生, 王林高, 等. DNS法测定纤维素酶活力最适条件研
究[J]. 河南师范大学学报, 1998, 26(3): 66-69.
[3] 刘妙莲, 王洁. 影响纤维素酶活力测定的几个因素[J]. 食品与发酵
工业, 2000, 26(6): 37-39.
收稿日期：2006-09-06
作者简介：李江华(1966-)，男，副教授，硕士，主要从事发酵工程和酶技术的研究。
真菌α-淀粉酶产生菌的筛选及其
固态发酵条件的初步研究
李江华1，房 峻2
(1.江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122；
2.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122)
摘 要：从酒曲和酒药中分离筛选出一株产α-淀粉酶的菌株A019。经形态学初步鉴定为米曲霉。研究了碳源、
氮源、培养温度与时间等因素对A019产酶的影响，并用响应面法对培养基组成进行了优化。最佳的培养基组成
和培养条件为：麸皮8g，豆饼粉2.28g，酵母膏0.1g，K2HPO4·3H2O 1%，MgSO4·7H2O 0.094%，加水量
12.9ml，培养基的起始pH5.0左右，28℃培养48h。在此条件下α-淀粉酶的酶活达到410U/g干曲左右。
关键词：真菌α-淀粉酶；米曲霉；筛选；固态发酵；响应面分析
Preliminary Study on Screening Fungalα-amylas -producing Strain and
Its Solid-state Fermentation Conditions
LI Jiang-hua1，FANG Jun2
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；
2.School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)
Abstract ：An α-amylase-producing strain A019 was screened and isolated from distillers yeast and grain. Strain A019