全 文 ：研究报告
Research Report
大叶蛇葡萄多种来源组织 RNA 提取效果比较
答国政 杨敏 黄静 尚祥伟 张秀桥*
湖北中医药大学药学院, 武汉, 430065
*通讯作者, qiaoxzh2000@163.com
摘 要 本研究以大叶蛇葡萄为材料，采用 RIN 值作为总 RNA 质量评价的主要标准，并结合凝胶电泳图
谱和 Agilent 2100 电泳图谱进行对照分析，比较了大叶蛇葡萄不同采样时间、器官及个体植株的 RNA 提取
效果差异。结果表明：5 月份采样中提取的 RNA 质量优于 8、10 月份；果实中提取的 RNA 质量优于花和
叶；低海拔植株中提取的 RNA 质量优于高海拔植株。该研究以同一种 RNA 提取方法为基础，对各种来源
的植物材料进行比较分析，为研究植物 RNA 提取效果的影响因素提供了新的参考。
关键词 大叶蛇葡萄, RNA 提取, 采样时间, 器官, 组织
Comparison of the RNA Extraction Effect from Different Tissues of
Ampelopsis megalophylla
Da Guozheng Yang Min Huang Jing Shang Xiangwei Zhang Xiuqiao *
College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan, 430065
* Corresponding author, qiaoxzh2000@163.com
Abstract In this research, Ampelopsis megalophylla was the main material and RIN value was selected as the
main standard to evaluate the total RNA quality. The quality of RNA was also analyzed combining with gel
electrophoresis and Agilent 2100 electrophoresis. The extraction effect of RNA was compared with different
sampling time, organs and individual plant of Ampelopsis megalophylla. The results indicated that the quality of
RNA extracted from the sample collecting in May was better than that in August and October, the quality of RNA
extracted from the fruit was better than that of flower and leaf, and the quality of RNA extracted from the low
altitude plant was better than that of the high altitude plant. The research compared and analyzed different plant
materials with the same RNA extraction method, and it provided a new reference for the research on the influence
factor of extraction in plant RNA.
Keywords Ampelopsis megalophylla, RNA extraction, Sampling time, Organ, Tissue
植物 RNA 提取是分子生物学研究的基础工作，高质量的 RNA 是进行下游实验的必要条件，比如
RT-PCR、Northern 杂交和转录组高通量测序等。目前，关于高质量的 RNA 提取，科研人员在不同植物上
网络出版时间：2016-10-08 10:15:51
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1369.Q.20161008.1015.004.html
进行了大量研究，使用的提取方法较多，常见的有 CTAB 法、Trizol 法、苯酚-SDS 法、异硫氰酸胍法和试
剂盒法，同时还有以上方法的各种改良方法(张晓丽和代红军, 2014)。由于试剂盒法具有操作简便、通用性
好和保存方便的优点，通常作为实验初始研究的首选方法。本研究中采用的 TIANGEN 多糖多酚植物总
RNA 提取试剂盒是国内较为常用的一种试剂盒。
Agilent 2100 生物分析仪在 RNA 质量检测中具有重要作用，通过其分析可直接读取样品含量，并使
RNA 完整性和核糖体比两种指标更加直观准确(Mueller et al., 2004)。目前 Agilent 2100 在高通量测序中应
用较为普遍，与传统的凝胶电泳技术相比，该方法具有操作简便，分析准确的优点，可以严格把控 RNA
质量，以保证后续样品建库和测序的顺利进行。
大叶蛇葡萄(Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg)是葡萄科蛇葡萄属植物，木质藤本，花期 6~8 月，果
期 7~10 月(中国科学院中国植物志编辑委员会, 2004)。其嫩叶炮制品为湖北省西部地区民间常用药“霉
茶”，主要用于治疗高血压。目前对 RNA 不同提取方法的比较研究已获得较多成果，研究技术和方法也
比较成熟，比如柠檬(安振宇等, 2015)和巨桉叶片(杨婕等, 2015)，但尚未见关于大叶蛇葡萄 RNA 提取的研
究报道。本研究选取新的角度，研究了同一种提取方法对于同一种群的不同个体植株的提取效果差异，并
初步表明这种差异在大叶蛇葡萄叶片中是显著的。
1 结果与分析
1.1 RNA 样品质量检测
采用超微量分光光度计和 Agilent 2100 生物分析仪检测总 RNA 质量，得到 11 份样品的浓度、纯度及
完整性(表 1)。
表 1 大叶蛇葡萄总 RNA 样品质量检测
Table 1 Total RNA quality detection of Ampelopsis megalophylla
样品编号
Sample number
浓度(ng/μL)
Concentration (ng/μL)
吸光度比值
Absorbance ratio 25S/18S RIN
OD260/OD280 OD260/OD230
S1-5 195 2.075 0.413 2.8 8.7
S2-5 191 2.025 0.623 2.6 8.7
S3-5 100 2.174 0.164 2.2 8.6
S1-8 30 2.143 0.882 2.7 8.7
S1-8-H 32 2.667 0.151 1.4 6.8
S1-8-G 48 1.846 0.195 1.9 10.0
S2-8 16 1.667 0.109 - -
S3-8 6 3 0.1 - -
S1-10 56 2 0.583 1.6 8.2
S2-10 8 1.333 0.062 - -
S3-10 6 3 0.136 - -

RIN 为 RNA Integrity Number 缩写，即
的好坏，此数值越大表明 RNA 越完整，质量越好
相关参数未达到程序默认最低值而无法检测出数值，表现为
差。
以时间作为变量考察，植株 S1
总 RNA 的 RIN 值：5 月(8.7)>8 月(-
以植株作为变量考察，5月份总RNA
(-)=S3 (-)；10 月总 RNA 的 RIN 值：
的 RIN 值：果实 S1-8-G (10.0)>叶
由以上数据分析可知，同一植株的大叶蛇葡萄
势，即 5 月份提取的 RNA 质量较好；同一时间不同植株的大叶蛇葡萄总
8、10 月份的 RIN 值结果相加可得，
质量明显优于植株 S2 和 S3；同一植株大叶蛇葡萄叶、花、果实的总
提取的 RNA 质量最佳。
1.2 琼脂糖凝胶电泳检测
11 份样品的 RNA 通过琼脂糖凝胶电泳检测
电泳时间：16 min。使用 Trans2K Plus DNA Marker
图 1 5 月份总 RNA 凝胶电泳检测
注: 1, 2, 3 号分别为样品 S1-5, S2-5, S3-5
Figure 1 Electrophoresis of total RNA extracted in May
Note: 1, 2, 3: S1-5, S2-5, S3-5; M: Trans2K Plus
RNA 分子完整数，RIN 值范围为 1~10，
(Mueller et al., 2004)；若样品检测出现无数据，表示样品
RNA 样品粘稠或总量不足，即该
叶片总 RNA 的 RIN 值：5 月(8.7)=8 月(8.7)>10
)=10 月(-)；植株 S3 叶片总 RNA 的 RIN 值：5 月(8.6)>8
的RIN值：S1 (8.7)=S2 (8.7)>S3 (8.6)；8月总RNA
S1 (8.2)>S2 (-)=S3 (-)。以植株部位作为变量考察，不同部位总
S1-8 (8.7)>花 S1-8-H (6.8) (表 1)。
叶片总 RNA 的 RIN 值，随采样
RNA 的
S1 (25.6)>S2 (8.7)>S3 (8.6)，整体而言，植株
RNA 的 RIN
(图 1~3)，凝胶电泳检测参数为胶浓度：
作为片段大小标记。

; M: Trans2K Plus DNA Marker

DNA Marker
直接反映了 RNA 质量
RNA 质量较
月(8.2)；植株 S2 叶片
月(-)=10 月(-)。
的RIN值：S1 (8.7)>S2
RNA
月份的推后，呈下降趋
RIN 值差异较大，将 5、
S1 叶片中提取的 RNA
值，差异明显，果实中
1%；电压：180 V；
图 2 8 月份总 RNA 凝胶电泳检测
注: 1, 2, 3, 4, 5 号分别为样品 S1-8, S1-8-
Figure 2 Electrophoresis of total RNA extracted in August
Note: 1, 2, 3, 4, 5: S1-8, S1-8-H, S1-8-G,
图 3 10 月份总 RNA 凝胶电泳检测
注: 1, 2, 3 号分别为样品 S1-10, S2-10, S3
Figure 3 Electrophoresis of total RNA extracted in October
Note: 1, 2, 3: S1-10, S2-10, S3-10; M: Trans2K Plus
电泳检测结果显示，电泳条带均较清晰，无明显污染，但各样品条带亮度差异较大，其亮度强弱与各
样品提取所得 RNA 浓度呈正相关性。
质量较差，RNA 提取难度较大。同样，凝胶电泳图谱结果反映的
一致的。
1.3 Agilent 2100 检测
在 Agilent 2100 电泳图谱中，可以直观看出样品质量的高低，即使是轻微的降解也可以显示出来，
和 18S 的峰面积越高，其余杂峰面积越小，同时
其中 8 份样品的 Agilent 2100 检测结果如下所示

H, S1-8-G, S2-8, S3-8; M: Trans2K Plus DNA Marker

S2-8, S3-8; M: Trans2K Plus DNA Marker

-10; M: Trans2K Plus DNA Marker

DNA Marker
RNA 浓度较低，电泳条带亮度晦暗的样品，表明从中提取的总
RNA 质量高低与
25S 峰面积越接近 18S 的 2 倍，则表明
(图 4)。
RNA
RIN 值显示的结果也是
25S
RNA 质量越好。
图 4 总 RNA 的 Agilent 2100 电泳检测
Figure 4 Agilent 2100 electrophoresis of total RNA
通过 Agilent 2100 检测得到 11 份样品的电泳图谱，其中四份样品(S2-8, S3-8, S2-10, S3-10)因 RNA 质
量太差未能读出合格的谱图，无 RIN 值。以样品 S2-10 为例，25S 和 18S 几乎完全降解为小片段，在出峰
时间约为 23 s 处可以明显看到一条最高峰，而 25S 和 18S 峰面积极小，这与凝胶电泳图谱(图 3)中 S2-10
样品条带晦暗是一致的。其余 7 份样品以 S1-8-G (果实)出峰质量最好，RIN 值最高；S1-8-H (花)出峰质
量最差，RIN 值最低。样品 S1-8-G 具有明显的 25S 和 18S 峰形，且其余杂峰较少，同时其凝胶电泳的结
果显示 25S 和 18S 条带清晰明亮，无弥散现象，两者结果均表明样品降解较少，完整性高。而样品 S1-8-H
图谱中 25S 和 18S 周围出现大量杂峰且峰面积较高，表明有较多降解，同时由图谱可以看出 25S 和 18S 峰
面积分别为 10.1 和 7.3，其值大小接近且均较低，这与其凝胶电泳图谱结果相吻合，即 25S 和 18S 条带有
弥散现象，其亮度接近且较淡。
综合上述，Agilent 2100 电泳图谱结果与凝胶电泳结果对照分析比较，其结果是一致的，同样与 RIN
值结果吻合。
2 讨论
目前关于 RNA 提取的文献报道中，多数是研究不同方法对同一个样本的提取效果差异，本研究选取
新的角度对 RNA 提取方法进行探索研究，选取同一个物种，但不同采样时间、不同器官和不同植株的多
个样本，研究一种常用的方法对多个样本提取效果的差异性，从一个新的角度反映影响植物总 RNA 提取
效果的各种因素，如 1.1 所示，这些因素包括采样时间、采样部位和植物个体差异，但并不限于这些因素。
实验中选取植物总 RNA 的 RIN 值作为评价所提取 RNA 质量的主要标准，同时结合凝胶电泳图谱和
Agilent 2100 电泳图谱进行对照分析，各方法分析所得的结果是一致的。RIN 值作为评价 RNA 质量的一个
综合指标，以直观的数字表达形式，显示出其方便易读，便于比较的优点。同时，RIN 值以计算机软件算
法为基础，对 RNA 质量的评价显得更加客观，避免了凝胶电泳图谱分析的人为差异，有助于建立 RNA 质
量评价的标准。
通过对大叶蛇葡萄总 RNA 的 RIN 值的比较得出：从采样时间的角度考察，5 月份的叶片提取的 RNA
质量最好，8 月其次，10 月最差，这种差异可能是由于叶片在生长过程中积累了酚类化合物，从而导致 RNA
提取困难(李宏和王新力, 1999)；从采样部位的角度考察，果实中提取的 RNA 质量最佳，叶片其次，花最
差，这可能与不同器官代谢产物或组织结构不同有关；从植株个体差异的角度考察，植株 S1 的叶片提取
的 RNA 质量最佳，植株 S2 和 S3 提取的质量近似，均较差，这种差异可能是由于生长环境(比如海拔高度
等)或植物种内变异造成的，或者两者共同作用的结果。
由于大叶蛇葡萄花期和果期较短，在 8 月份花和果实同时存在于一株植物上，故选取 8 月份作为花和
果实的采样时期。实验中选取的大叶蛇葡萄不同植株是来自于同一种群的，其所在经纬度几乎接近，不存
在地理隔离(表 2)。一般而言，同一种群内的植株差异较不同种群间会更小，因而，它们之间 RNA 提取结
果的显著差异是较为反常的，同时也是具有研究意义的。
3 材料和方法
3.1 材料
选取湖北省恩施土家苗族自治州来凤县革勒车镇土家寨村 3 株野生大叶蛇葡萄，共采集 11 份大叶蛇
葡萄样品，样品编号为“Sx-y”形式，x 表示植株编号，y 表示采集月份。所有样品经湖北中医药大学张秀
桥教授鉴定为 Ampelopsis megalophylla，并附有样品详细信息(表 2)。叶片采集后立即放入液氮中速冻，并
于-80℃冰箱保存。
3.1.1 主要仪器
高速冷冻离心机；琼脂糖水平电泳仪；紫外凝胶成像系统；Eppendorf 移液器；Nanodrop 超微量分光
光度计；Agilent 2100 生物分析仪。
3.1.2 主要试剂
焦碳酸二乙酯(DEPC)、无水乙醇、溴化乙锭(EB)、β-巯基乙醇；Trans2K Plus DNA Marker；TIANGEN
多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒。
表 2 大叶蛇葡萄样品信息
Table 2 Sample information of Ampelopsis megalophylla
样品编号
Sample number
采样日期
Sampling date
采样部位
Sampling part
经纬度
Latitude and longitude
海拔高度
Altitude
S1-5

2015.05.10

叶
Leaf
29°36.32’N, 109°15.98’E

710 m

S2-5

2015.05.10

叶
Leaf
29°36.54’N, 109°16.18’E

735 m

S3-5

2015.05.10

叶
Leaf
29°36.53’N, 109°16.20’E

730 m

S1-8

2015.08.21

叶
Leaf
29°36.32’N, 109°15.98’E

710 m

S1-8-H

2015.08.21

花
Flower
29°36.32’N, 109°15.98’E

710 m

S1-8-G

2015.08.21

果实
Fruit
29°36.32’N, 109°15.98’E

710 m

S2-8

2015.08.21

叶
Leaf
29°36.54’N, 109°16.18’E

735 m

S3-8

2015.08.21

叶
Leaf
29°36.53’N, 109°16.20’E

730 m

S1-10

2015.10.14

叶
Leaf
29°36.32’N, 109°15.98’E

710 m

S2-10

2015.10.14

叶
Leaf
29°36.54’N, 109°16.18’E

735 m

S3-10

2015.10.14

叶
Leaf
29°36.53’N, 109°16.20’E

730 m

3.2 总 RNA 的提取
取 100 mg 植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，参照 TIANGEN 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒操作
方法，提取得到植物总 RNA，并于-70℃中保存。花和果实样品处理方法与叶片相同。
3.3 总 RNA 质量检测
采用琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop 超微量分光光度计和 Agilent 2100 生物分析仪分别检测总 RNA 浓度、
纯度及完整性，以RIN值作为大叶蛇葡萄总RNA质量评价的主要标准，并结合凝胶电泳图谱和Agilent 2100
电泳图谱进行对照分析。
作者贡献
答国政负责全部实验设计、操作和论文撰写，杨敏、黄静、尚祥伟协助完成部分实验，张秀桥负责实
验的设计和指导以及论文的修改和审核。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由湖北省自然科学基金重点项目(2014CFA083)资助。
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