全 文 ：华西药学杂志
W C J·P S 2016，31(4)∶353 ～ 356
基金项目:国家自然科学基金资助项目(批准号:81072636)
作者简介:刘晓娇(1990—)，女，重庆，正攻读药理学专业的硕士学位。Email:xiaojiaoliu614@ 163． com
* 通信作者(Correspondent author)，Email:dujr_1@ 163． com
藁本内酯对脂多糖诱导神经炎症的抑制作用
刘晓娇，周红静，杜俊蓉*
(四川大学华西药学院，四川 成都 610041)
摘要:目的 研究藁本内酯(Lig)对细菌脂多糖(LPS)诱导的神经炎症的抑制作用。方法 用 1、2． 5、5、10、20 μmol·L －1 Lig
作用于小鼠 ＲAW264． 7 巨噬细胞，加 1 μg·mL －1LPS刺激构建细胞炎症反应模型，采用 MTT法检测细胞毒性，一步法检测 NO
的释放量，ELISA法检测 TNF － α、IL － 6 的释放量，免疫细胞化学法检测 iNOS 的水平;将 LPS 注入小鼠侧脑室构建体内神经
炎症模型，术前 30 min及术后 6 h于腹腔注射 30 mg·kg －1Lig，造模后 24 h 取大脑，用免疫组织化学法检测 GFAP、TNF － α 的
蛋白表达。结果 经 Lig处理后，细胞存活率无明显变化，细胞分泌 NO 显著减少(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01)，且呈剂量依赖性，
TNF － α、IL － 6、iNOS的表达均明显下调(P ＜ 0． 05) ;Lig 能显著降低小鼠海马区 GFAP、TNF － α 的表达(P ＜ 0． 01)。结论
Lig能够抑制 LPS诱导的小鼠体内外的炎症反应，提示 Lig对神经炎症相关的多种疾病可能具有潜在的治疗作用。
关键词:藁本内酯;神经炎症;细胞因子;脂多糖;胶质纤维酸性蛋白
中图分类号:Ｒ96 文献标志码:A 文章编号:1006 － 0103(2016)04 － 0353 － 04
DOI:10． 13375 / j． cnki． wcjps． 2016． 04． 007
Inhibitory effect of Z － Ligustilide on lipopolysaccharide － induced neuroinflammtion
LIU Xiaojiao，ZHOU Hongjing，DU Junrong*
(West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu，Sichuan，610041 P． Ｒ． China)
Abstract:OBJECTIVE To investigate the inhibitory effect of Z － Ligustilide(Lig)on lipopolysaccharide (LPS)－ induced neuroin-
flammation．METHODS The ＲAW264． 7 macrophage cells were treated with 1，2． 5，5，10，20 μmol·L －1 Lig，then stimulated with
1 μg·mL －1 LPS to construct inflammatory cell model． The cell viability was determined through MTT assay;the nitric oxide (NO)
release was detected by one － step method;the expression of tumor necrosis factor － α (TNF － α);interleukin 6(IL － 6)were detected
with ELISA;and inducible nitric oxide synthase (iNOS)expression was tested by immunocytochemistry． The neuroinflammatory model
was set up by injecting LPS directly into the right lateral ventricle of mice． 30 mg·kg －1 Lig was intraperitoneally administered，30 min
before and 6 h following LPS injection． Twenty － four hours after LPS administration，the brains were removed，and immunohistochemis-
try was used to detect the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP)and TNF － α． ＲESULTS After Lig treatment，the cell
viability had no significant effect，the secretion of NO was dose － dependent inhibited (P ＜ 0． 05 or P ＜ 0． 01)，and the expression of
TNF － α，IL － 6 and iNOS was down regulated (P ＜ 0． 05)． Lig decreased effectively immunoreactivity of GFAP and TNF － α in the
hippocampus (P ＜ 0． 01)． CONCLUSION Lig exerts a potent inhibitory action on LPS － induce inflammatory responses in in vitro
and in vivo mice，and has therapeutic potential in neuroinflammation － associated disorders．
Key words:Z － Ligustilide;Neuroinflammation;Cytokine;LPS;GFAP
CLC number:Ｒ96 Document code:A Article ID:1006 － 0103(2016)04 － 0353 － 04
炎症是宿主对感染和损伤的一种极为重要的反
应，并且能在细菌入侵和病毒感染时维持机体健康。
然而，过度的炎症反应可能导致关节炎、哮喘、多发
性硬化症、炎性肠病和动脉粥样硬化等多种疾
病［1 － 2］。炎症反应即可大量生成一氧化氮(NO)、前
列腺素 E2(PGE2)和 IL － 6、TNF － α 等细胞因子，因
此，这些炎症介质被认为是基本的抗炎靶点。藁本
内酯(Z － Ligustilide，Lig)是当归、川芎等伞形科植
物特有的苯酞类化合物。课题组前期研究发现:Lig
对细菌脂多糖(LPS)诱导原代小胶质细胞产生的炎
症反应具有抑制作用［3］，表明 Lig 具有良好的神经
保护作用。现以 LPS构建典型的炎症模型，观察 Lig
对神经炎症的抑制作用。
1 实验部分
1. 1 仪器、试药与动物
3111 二氧化碳培养箱(Thermo Forma);SM － 15
小鼠定位仪(Narishige International Ltd)。藁本内酯
(Lig，从当归的根中提取分离而得，纯度 ＞ 99%);细
菌脂多糖(LPS，美国 Sigma);ＲAW264． 7 细胞系(南
京凯基生物科技发展有限公司);ＲPMI － 1640 培养
基(Gibco公司);胎牛血清(民海生物);iNOS、GFAP、
TNF － α抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。SPF
级♂ICＲ小鼠［成都达硕生物科技有限公司，合格证
号:SCXK(川)2013 －24］，体重 28 ～30 g。
1. 2 方法与结果
1. 2. 1 细胞的培养与给药 实验设空白对照组
(仅含 0． 1% DMSO)、LPS 组(含 0． 1% DMSO 和 1
μg·mL －1 LPS)和给药组(含 1 μg·mL －1 LPS 和 1、
2. 5、5、10、20 μmol·L －1Lig)。小鼠的 ＲAW264． 7 巨
噬细胞培养于含 10%胎牛血清、双抗(100 U·mL －1
青霉素，100 μg·mL －1链霉素)的 ＲPMI － 1640 培养
基中，置 37 ℃、5%CO2 培养箱中培养。在倒置显微
镜下观察细胞的生长状态，处于对数生长期即融合
率达 80%以上时，即可传代。给药前弃去孔内培养
基，换为无血清培养基，用 1、2． 5、5、10、20 μmol·L －1
Lig预防 1 h，然后在 LPS 组和给药组细胞培养液中
加入 1 μg·mL －1 LPS，空白对照组加入等量培养基，
于 20 h后进行细胞活性的检测或收集细胞上清液
用于 ELISA测定。
1. 2. 2 Lig细胞毒性的检测 选取处于对数生长期
的 ＲAW264． 7 巨噬细胞，调整细胞密度为 1 × 105·
mL －1，接种于 96孔板中，待细胞贴壁 20 h 后加入 1、
2． 5、5、10、20 μmol·L －1Lig 预防 1 h，再经 1 μg·mL －1
LPS处理 24 h 后，加入 20 μL 5 mg·mL －1MTT 溶液，
继续培养 4 h。弃去上清液，加入 150 μL二甲基亚砜
(DMSO)，震荡使 MTT与活细胞线粒体反应而形成的
蓝紫色结晶甲瓒完全溶解。用酶标仪在 490 nm处检
测 OD490nm值，计算细胞存活率。结果表明:1、2． 5、
5、10、20 μmol·L －1 Lig 时存活率分别为 93%、95%、
99%、103%、91%，对细胞活力均无明显影响。
1. 2. 3 Lig 对 LPS 诱导 ＲAW264． 7 细胞分泌 NO、
TNF － α、IL － 6 的抑制作用 取对数期 ＲAW264． 7
细胞，调整细胞密度为 5 × 105·mL －1，接种于 96 孔
板中，贴壁 20 h 后，加入 1、2． 5、5、10、20 μmol·L －1
Lig预防 1 h，再经 1 μg·mL －1 LPS处理 20 h［4］，收集
细胞上清液，用 NO 试剂盒检测 NO 的释放量，
ELISA检测 TNF － α、IL － 6 的含量。结果表明:Lig
能显著抑制 LPS 诱导的 ＲAW264． 7 细胞分泌 NO，
并具有剂量依赖性(P ＜ 0． 05、P ＜ 0． 01)，10 μmol·
L －1 Lig 能显著抑制 TNF － α、IL － 6 的分泌(P ＜
0. 05)(图 1)。
NO
/%
150
100
50
Control LPS 1 2.5 5 10 20
Lig/滋mol·L-1
4
3
2
1
Control LPS Lig10
TN
F-
琢/
ng
·
m
L-
1
Control LPS Lig10
150
100
50IL
-6
/p
g·
m
L-
1
A B C
Groups
图 1 Lig对 LPS诱导 ＲAW264． 7 巨噬细胞分泌 NO(A)、TNF － α(B)、IL －6(C)的抑制作用(n =3)
Figure 1 Effect of Lig on the inhibition activity of LPS － induced NO(A)，TNF － α(B)and IL －6 production(C)in ＲAW264． 7 cells(n =3)
1. 2. 4 iNOS表达的测定 实验中设空白对照组、
LPS组和 10 μmol·L －1 Lig 组，调整细胞密度为 8 ×
104·mL －1，接种于 24 孔板中，贴壁 20 h 后分组给
药，经 LPS 作用 20 h 后，弃去孔内培养基，用 0． 01
mol·L －1 PBS 洗涤 3 次、4%多聚甲醛室温固定 30
min，0． 01 mol·L －1 PBS洗涤 3 次、0． 3% Trion － 100
作用 30 min，PBS洗涤 3 次、3% H2O2 于室温下避光
处理 30 min，灭活内源性过氧化物酶，用 PBS 洗涤 3
次，滴加 5%BSA，于 37 ℃处理 1 h，封闭结束后，洗
掉多余 BSA，滴加一抗(iNOS，1∶100)，于 37 ℃孵
育 3 h，置 4 ℃下过夜，用 PBS清洗 3 次，吸干爬片上
多余的液体，滴加二抗，于 37 ℃孵育 1 h，用 PBS 清
洗 3 次，滴加 SABC，于 37 ℃孵育 1 h，用 PBS清洗 3
次，DAB显色、中性树胶封片，置显微镜下观察染色
情况。采用 Image － Pro Plus 6． 0 软件对染色结果进
行定量分析。由图 2 可知:10 μmol·L －1 Lig 能显著
性抑制 LPS诱导的 ＲAW264． 7 细胞 iNOS的生成。
1. 2. 5 LPS神经炎症模型的建立及给药 将 12 只
健康♂ ICＲ 小鼠随机均分为 Sham 组、Model 组和
Lig组。参照文献［5］方法采用侧脑室内注射 LPS 建
立小鼠急性炎症模型:于 ICＲ 小鼠腹腔注射 0． 01
mL·g －13． 5%水合氯醛麻醉，将小鼠俯卧固定于小
鼠定位仪上，暴露前囟、后囟。根据文献及小鼠脑定
位图谱［6］，确定侧脑室的注射位点(即前囟后
0． 2 mm、中线右侧 1． 0 mm、硬脑膜下 2． 5 mm 处)。
小鼠右侧脑室内注入 5 μg 1 μg·μL －1 LPS 溶液，注
453 华 西 药 学 杂 志 第 31 卷
射速度为 1 μL·min －1，注射毕停针 5 min，然后缓慢
退针(避免液体溢出)，用骨蜡封闭进针孔，缝合皮
肤，用碘伏消毒。手术过程中小鼠的体温维持在
37 ℃，手术完成后仍需保持体温直至小鼠苏醒。
LPS注射前 30 min和注射后 6 h于腹腔注射给予 30
mg·kg －1 Lig(Lig 浓度为 3 mg·mL －1，给药体积为
0. 01 mL·g －1)，Sham 组和 Model 组按 0． 01 mL·g －1
给予溶媒。
Control LPS Lig10
8
6
4
2
IO
D/
×1
04
A B C D
图 2 对照组(A)，LPS组(B)，10 μmol·L －1Lig组(C)ＲAW264． 7 细胞的染色图和 Lig对 LPS诱导 ＲAW264． 7 细胞 iNOS表达的抑制作用
(D)(n =3)
Figure 2 Colored graphs of ＲAW264． 7 cells of control group(A)，LPS group(B)，10 μmol·L －1Lig group(C)and inhibitory effect of Lig on
LPS － induced iNOS expression in ＲAW264． 7 cells(D)(n =3)
1. 2. 6 免疫组织化学染色 注射 LPS 24 h 后，用
0. 01 mL·g －13． 5%水合氯醛麻醉小鼠，剪开胸腔，剪
破右心耳，从左心耳先后用约 60 mL 1 × PBS、约 40
mL 4%多聚甲醛灌流。迅速取脑，于 4%多聚甲醛
中固定 24 ～ 48 h，用石蜡包埋，切片，进行免疫组织
化学检测。石蜡切片置 60 ℃烤箱中烤 2 h，用二甲
苯脱蜡，用 3% H2O2 于室温下避光反应 20 min，高
压热修复 3 min，滴加 5% BSA 封闭液于 37 ℃孵育
1 h，分别加不同的一抗(GFAP，1∶100;TNF － α，
1∶100)于 37 ℃孵育 3 ～ 4 h，置 4 ℃下过夜。滴加
生物素化山羊抗小鼠 /兔 IgG 二抗，于 37 ℃孵育
1 h;滴加 SABC，于 37 ℃孵育 1 h;用 DAB 染色，苏
木素复染，自来水返蓝，中性树胶封片，显微镜下观
察染色情况。采用 Image － Pro Plus 6． 0 软件对染色
结果进行定量分析。结果表明:Model 组 GFAP、
TNF － α的表达明显高于 Sham 组，而 Lig 组 GFAP、
TNF － α的表达均有所降低，说明 Lig 能够抑制星形
胶质细胞的激活和神经炎症的产生(图 3)。
3
2
1
0
Sham Model Sham
GFAP
TNF-琢
IO
D/
×1
04
Sham Model Lig
A B
GFAP
TNF-琢
图 3 星形胶质细胞的染色图(A)和 Lig对 LPS诱导海马区的星形胶质细胞激活和炎症反应的作用(B)(n =4)
Figure 3 Colored graphs of astroglia cell(A)and effect of Lig on the LPS － induced astroglia cell activation and inflammatory response in the
hippocampus(B) (n =4)
1. 2. 7 统计分析 采用 GraphPad Prism 5 软件进
行统计分析，用 Image － Pro Plus 6． 0 软件处理免疫
组化图片，组间用单因素方差分析，P ＜ 0． 05 即有显
著性差异。
2 讨论
细菌脂多糖(LPS)是一种内毒素，是 G －菌细胞
壁的主要成分之一，能触发炎症反应，通过多种信号
转导途径诱导核因子 － κB(NF － κB)激活，使 IκB
磷酸化。激活后，NF － κB 的异源二聚体迅速移位
进入细胞核，进而激活靶基因的转录，如促炎因子、
诱导酶等。文中结果表明:LPS 激活小鼠的
ＲAW264. 7 巨噬细胞后，NO、TNF － α、IL － 6 的含量
明显上升，而 Lig通过抑制 iNOS 表达而对其产生了
抑制作用。由小胶质细胞或星形胶质细胞激活介导
的神经炎症在多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默
病和帕金森病中起着重要作用。激活的胶质细胞会
释放促炎介质，如 TNF － α、IL － 6、NO 等。这些细
胞因子都参与了神经炎症的进程，并且最终导致神
经元的死亡。文中研究发现:于小鼠侧脑室注射
553第 4 期 刘晓娇，等。藁本内酯对脂多糖诱导神经炎症的抑制作用
华西药学杂志
W C J·P S 2016，31(4)∶356 ～ 358
LPS后，星形胶质细胞被激活，炎症因子 TNF － α 的
表达增加，而 Lig 能抑制星形胶质细胞激活和神经
炎症的产生。
参考文献:
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收稿日期:2015 － 03 － 02
作者简介:李慧(1975—)，女，博士，副主任医师，从事白血病的临床与基础研究工作。Email:lihui606606@ 163． com
* 通信作者(Correspondent author)，Email:wcs977362@ sina． com
丹参酮类化合物诱导白血病干细胞凋亡的体外研究
李 慧1，向 洪2，王 银3，卿 红3，王春森1*
(1．四川省医学科学院·四川省人民医院血液科，四川 成都 610072;2． 川北医学院，四川 南充 637000;3． 四川大学华西药
学院，四川 成都 610041)
摘要:目的 探讨丹参酮类化合物对白血病干细胞(LSCs)的促凋亡作用。方法 将二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮与丹
参酮ⅡA等 4 种丹参酮类化合物分别作用于白血病 NB4 细胞，以 CD34 +、CD38 －、CD123 +为标记确定 NB4 细胞中的 LSCs，采
用 Annexin V /PI双标记法检测 LSCs的凋亡率。结果 在 20 μmol·L －1二氢丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅰ条件下作用 24 h后，可显著
诱导 LSCs凋亡，而隐丹参酮和丹参酮ⅡA不能诱导 LSCs凋亡。结论 丹参酮类化合物诱导 NB4 中 LSCs 的凋亡能力与其结
构有关，与课题组前期报道的其对 NB4 细胞的增殖抑制作用基本一致。
关键词:二氢丹参酮Ⅰ;丹参酮Ⅰ;隐丹参酮;丹参酮ⅡA;细胞凋亡;白血病干细胞;CD123 +;NB4;Annexin V /PI双标记法
中图分类号:Ｒ96 文献标志码:A 文章编号:1006 － 0103(2016)04 － 0356 － 03
DOI:10． 13375 / j． cnki． wcjps． 2016． 04． 008
In vitro study of leukemia stem cells apoptosis induced by tanshinone compounds
LI Hui1，XIANG Hong2，WANG Yin3，QING Hong3，WANG Chunsen1*
(1． Departmnt of Hematology，Sichuan Provincial People Hospital ＆ Sichuan Academy of Medical Sciences，Chengdu，Sichuan，610072
P． Ｒ． China;2． North Sichuan Medical College，Nanchong，Sichuan，637000 P． Ｒ． China;3． West China School of Pharmacy，Sichuan
University，Chengdu，Sichuan，610041 P． Ｒ． China)
Abstract:OBJECTIVE To investigate apoptosis － inducing effect on leukemia stem cells(LSCs)treated by tanshinone compounds．
METHODS Tanshinone compounds (dihydrotanshinone I，tanshinone I，cryptotanshinone and tanshinone ⅡA)were acted on NB4
cells，respectively． LSCs in the NB4 cells were determined by CD34 +，CD38 －，CD123 + and Annexin V /PI staining was used to detect
apoptosis rate of the LSCs． ＲESULTS Dihydrotanshinone I and tanshinone I showed significant pro － apoptotic effects on the LSCs，
but neither cryptotanshinone nor tanshinone ⅡA did． CONCLUSION The pro － apoptotic effect of tanshinone compounds on the LSCs
is associated with molecular structure of the compounds，which is basically consistent with their proliferation inhibition effect on NB4
cells reported in our previous study．
Key words:Dihydrotanshinone I;Tanshinone I;Cryptotanshinone;Tanshinone ⅡA;Cell Apoptosis;Leukemia stem cells;CD123 +;NB4;
Annexin V /PI staining
CLC number:Ｒ96 Document code:A Article ID:1006 － 0103(2016)04 － 0356 － 03