全 文 ：组培条件对银叶真藓原丝体发育阶段光合色素含量的影响
汪琛颖 (郑州师范学院生命科学系，河南郑州 450044)
摘要 ［目的］促进银叶真藓原丝体生长，为其植株扩繁奠定物质基础。［方法］研究不同培养基类型、酒石酸铵及 3种植物生长调节剂
的使用及浓度配比对银叶真藓原丝体生长及光合色素含量的影响。［结果］酒石酸铵对银叶真藓原丝体中光合色素含量的增加有一定
作用。6-BA作为细胞分裂素，对于原丝体中叶绿体 a或 b的含量的增加无作用。而 NAA或 IAA作为生长素有促进原丝体生长的作用，
当其达到0． 5 mg /g的浓度时，可考虑选择使用其中任一种。［结论］使用改良 Knop培养基，并添加0． 05 mg /L 6-BA、0． 50 mg /L NAA(或
IAA)、0． 70 mg /L酒石酸铵的效果最为理想。
关键词 银叶真藓;原丝体;光合色素;培养基;植物生长调节剂
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)22 －11167 －02
Influences of in vitro Factors on the Photosynthetic Pigment Content in the Process of Protonema Development in Bryum argenteum
WANG Chen-ying (Department of Life Science，Zhengzhou Normal University，Zhengzhou，Henan 450044)
Abstract ［Objective］To promote the growth of protonema in B． argenteum，and lay foundation for its plants propagation． ［Method］The
impact of different medium types，ammonium tartrate and three plant growth regulators as well as their concentration ratio on the protonema
growth and photosynthetic pigment content in B． argenteum was studied． ［Result］Ammonium tartrate plays an important role in increasing the
content of photosynthetic pigment of protonema in B． argenteum，while 6-BA as cytokinins，has no effect on improving the content of chloro-
plasts a or b，and NAA or IAA as the auxin，can promote the growth of protonema，one of them can be chosen at 0． 5 mg /g concentration．
［Conclusion］The improved medium Knop added with 0． 05 mg /L 6-BA，0． 5 mg /L NAA or IAA，and 0． 7 mg /L ammonium tartrate could
significantly improve the contents of photosynthetic pigment．
Key words Bryum argenteum;Protomata;Photosynthetic pigment;Medium;Plant growth regulator
基金项目 河南省科技计划资助项目(112300410018) ;郑州市科技计
划资助项目(10PTGN449-6)。
作者简介 汪琛颖(1968 －) ，女，河南南阳人，副教授，博士，从事苔藓
植物分子系统发育研究。
收稿日期 2012-03-19
银叶真藓 (Bryum argenteum Hedw．) ，又名垣衣，屋游或
古屋瓦苔，系真藓科(Bryaceae)真藓属(Bryum)的模式植物，
具有清热解毒，治疗细菌性痢疾、鼻窦炎、灼伤、心绞痛等功
效［1 －3］。其分布广泛，在温室、田边、住房周围和人迹所及的
低山坡、具薄土岩面或火烧后的林地均能生长［4］，但其植株
矮小，生物量低。随着中医药现代化发展的进程以及苔藓植
物分子生物学、生物化学、生理学、分类学以及生态学等研究
领域的扩大，野生材料远远不能满足需求。这就需要组织培
养技术。
在苔藓植物的生活史中，原丝体阶段是其从孢子萌发至
配子体发生过程中的关键环节。研究不同环境因子对藓类
植物原丝体发育的影响，对于缩短其配子体发生时间，建立
苔藓植物的快速体系，具有重要的实践价值。
光合色素是客观反映植物光照能力和判断植物光合生
理能力的重要指标。植物生长调节剂对于苔藓植物孢子萌
发、原丝体发育以及配子体生长的影响已有相关研究［5 －7］，
但其对苔藓植物原丝体发育阶段光合色素的影响鲜见报道。
笔者研究了不同组织培养条件对银叶真藓原丝体发育阶段
光合色素含量的影响，以期为银叶真藓原丝体的快速繁殖及
培养液筛选提供相关参考资料。
1 材料与方法
1． 1 材料 植株采自河北省张家口市涿鹿县东灵山(海拔
1 760 m)带孢蒴的银叶真藓(标本号:201002，河北师范大学
生命科学学院植物标本馆) ，材料备用。
1． 2 方法
1． 2． 1 培养基的制备及灭菌。配制改良 knop培养液，分装
于三角烧瓶中。将实验所需物品及配制好的培养液、蒸馏水
一并放入高压灭菌锅中灭菌(0． 15 MPa，15 min) ，冷却备用。
1． 2． 2 制备孢子悬液。取银叶真藓成熟孢蒴浸入 75%酒精
中消毒 5 min后，用蒸馏水反复冲洗 5次，在超净工作台上用
镊子和解剖针打开孢蒴，将孢子散入适量的培养液中，制成
适当浓度的孢子悬液。
1． 2． 3 接种与培养。在超净工作台上，用微量移液器将稀
释后的孢子悬液接种到分装于三角烧瓶的改良 knop培养液
中。将接种后的三角瓶加膜后置于摇床上悬浮培养，摇床转
速 100 ～110 r /min，室温，漫射光下培养。
1． 2． 4 原丝体片段的制备。用微量移液器吸取在改良
Knop营养液中沉水培养 21 d由孢子萌发而成未长出芽体的
原丝体系统，移入已灭菌的 EP管中。将 EP管放入离心机，
离心机转速调至 8 000 r /min，离心 10 min。离心后弃上清
液，留下底部已离心为团状的绿色原丝体备用。在超净工作
台上，准确称取银叶真藓原丝体，每份 0． 02 g。
1． 2． 5 培养液配制、分装及灭菌。分别配制 knop2，改良
knop、MS、1 /2MS、1 /10MS培养液并分装于 150 ml 三角烧瓶
中，每瓶 40 ml。
1． 2． 6 接种及培养。将银叶真藓原丝体剪碎，分别置于 40
ml不同种类培养液的三角烧瓶中。各重复 2 次。将接种后
的三角烧瓶加膜后于摇床上悬浮培养，摇床转速 100 ～ 110
r /min，室温，漫射光下培养 15 d。
1． 2． 7 正交试验设计。在改良 knop培养液中，按照 4因素
4水平 L16(4
4)正交设计，分别添加 6-苄氨基嘌呤(6-BA) :0、
0． 05、0． 10、0． 50 mg /L;α-萘乙酸(NAA) :0、0． 20、0． 50、0． 70
mg /L;酒石酸铵:0、0． 20、0． 50、0． 70 mg /L;吲哚乙酸(IAA) :
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(22):11167 － 11168，11172 责任编辑 陈红红 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.22.118
0、0． 20、0． 50、0． 70 mg /L。组合设计见表 1。
表 1 正交试验设计 mg /L
编号 6-苄氨基嘌呤 6-BA α-萘乙酸 NAA 酒石酸铵 吲哚乙酸 IAA
1 0 0 0 0
2 0 0． 2 0． 2 0． 2
3 0 0． 5 0． 5 0． 5
4 0 0． 5 0． 7 0． 7
5 0． 05 0 0． 2 0． 5
6 0． 05 0． 2 0 0． 7
7 0． 05 0． 5 0． 7 0
8 0． 05 0． 7 0． 5 0． 2
9 0． 10 0 0． 5 0． 7
10 0． 10 0． 2 0． 7 0． 5
11 0． 10 0． 5 0 0． 2
12 0． 10 0． 7 0． 2 0
13 0． 50 0 0． 7 0． 2
14 0． 50 0． 2 0． 5 0
15 0． 50 0． 5 0． 2 0． 7
16 0． 50 0． 7 0 0． 5
1． 2． 8 试验方法。无菌操作，准确称取银叶真藓原丝体，每
份 0． 01 g，剪碎，分置于各盛有 40 ml 改良 knop培养液并添
加各种激素及酒石酸铵配比的三角烧瓶中。每处理 2 次重
复。将上述培养瓶均放置于(25 ± 1)℃，光照周期 12∶12，光
照强度 3 500 lx条件下的光照培养箱中，培养 30 d。
1． 2． 9 样品数据测量及处理。按文献［8］的方法使用紫外
–可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)比
色测定色素，以 95%乙醇作为空白对照，测定在 665、649、470
nm下的吸光度，采用 Arnon法计算叶绿素 a、b及类胡萝卜素
含量。采用 SPSS 18． 0软件，对各组银叶真藓光合色素含量
进行单因素方差分析 (One-way Analysis of Variance，ANO-
VA) ，相关系数差异的显著性检验及多重比较。
2 结果与分析
2． 1 不同种类培养液对银叶真藓原丝体生长的影响 经
相关系数差异的显著性检验，总叶绿素含量与叶绿素 a、b之
间以及与类胡萝卜素之间均存在极显著直线相关关系。在 5
种培养液中，就银叶真藓原丝体总叶绿素含量看(表 2) ，从
高到低依次是改良 Knop、1 /2MS、1 /10MS、Knop2、MS。改良
Knop培养液有助于银叶真藓原丝体总叶绿素含量的增加，
而其中叶绿素 a的增加与 1 /2MS中的差异显著，叶绿素 b的
含量与1 /2MS相比差异不显著。改良 Knop培养液有利于叶
绿素的形成，而叶绿素含量的多少反映植物进行光合作用的
能力强弱，表示植物将无机物转化为有机物的同化作用能
力，也可以说明植物处于生长期还是衰弱期。试验结果表
明，可选择改良Knop培养液作为获得具有进一步分化为大
表 2 不同培养液中银叶真藓叶绿素含量的比较 mg /g
培养液种类 总叶绿素含量 叶绿素 a 叶绿素 b 类胡萝卜素
Knop2 1． 840 664 ±0． 004 973 c 1． 272 072 ±0． 002 058 c 0． 568 593 ±0． 006 617 b 2． 060 365 ±0． 025 921 a
改良 Knop 2． 181 559 ±0． 008 459 a 1． 501 797 ±0． 002 420 a 0． 679 763 ±0． 006 039 a 0． 943 935 ±0． 004 178 c
MS 1． 462 941 ±0． 002 567 d 1． 124 523 ±0． 003 820 fd 0． 338 419 ±0． 001 253 d 0． 442 454 ±0． 003 626 d
1 /2MS 2． 117 543 ±0． 016 780 b 1． 429 493 ±0． 001 133 b 0． 688 050 ±0． 015 647 a 0． 971 128 ±0． 018 291 b
1 /10MS 0． 986 154 ±0． 011 279 e 0． 633 704 ±0． 003 227 e 0． 352 450 ±0． 008 052 c 0． 168 929 ±0． 002 324 e
注:同列相同字母表示差异性不显著(p ＞0． 05) ，不同字母表示差异性显著(p ＜0． 05)。
量配子体的银叶真藓原丝体培养液。
2． 2 不同种类和浓度配比的植物激素及酒石酸铵对银叶真
藓原丝体光合色素含量的影响 经相关系数差异的显著性
检验，总叶绿素含量与叶绿素 a、b之间以及与类胡萝卜素之
间均存在极显著直线相关关系。统计结果(表 3)显示，组合
7、11、3、4、8、13、2的总叶绿素含量均高于不添加任何激素和
酒石酸铵的第 1 个组合。组合 7(6-BA 浓度为 0． 05 mg /L，
NAA浓度为 0． 50 mg /L，酒石酸铵浓度为 0． 70 mg /L)的总叶
绿素含量、叶绿素 a 含量、b 含量分别为 0． 813 011 ±
0． 016 176 mg /g、0． 486 963 ± 0． 003 078 6 mg /g、0． 326 048 ±
0． 013 127 mg /g，均为各组合之首。在不添加 6-BA，NAA 浓
度为 0． 5 mg /L，随酒石酸铵及 IAA浓度增加，总叶绿素及叶
绿素 a含量降低，叶绿素 b含量升高。组合 2 与组合 1、组合
16不含酒石酸铵，总叶绿素、叶绿素 a、b含量均为最低。
表 3 酒石酸铵及三种植物生长调节剂不同配比对银叶真藓原丝体光合色素含量的影响 mg /g
处理号 总叶绿素含量 叶绿素 a 叶绿素 b 类胡萝卜素
1 0． 470 002 ±0． 002 042 g 0． 332 531 ±0． 001 650 k 0． 137 471 ±0． 000 392 cde 0． 122 971 ±0． 000 885 j
2 0． 481 567 ±0． 001 522 g 0． 338 872 ±0． 000 614 l 0． 144 243 ±0． 001 270 cdef 0． 116 076 ±0． 000 574 i
3 0． 611 544 ±0． 020 391 i 0． 446 723 ±0． 006 414 o 0． 164 821 ±0． 013 977 g 0． 160 725 ±0． 002 112 l
4 0． 572 007 ±0． 007 207 h 0． 390 884 ±0． 002 179 m 0． 181 123 ±0． 006 120 h 0． 140 141 ±0． 002 420 k
5 0． 422 297 ±0． 014 822 e 0． 303 527 ±0． 003 533 h 0． 118 770 ±0． 011 326 a 0． 106 309 ±0． 001 915 h
6 0． 443 829 ±0． 002 512 f 0． 311 206 ±0 i 0． 132 623 ±0． 002 501 fg 0． 114 243 ±0． 000 693 i
7 0． 813 011 ±0． 016 176 k 0． 486 963 ±0． 003 079 p 0． 326 048 ±0． 013 127 o 0． 114 709 ±0． 003 663 i
8 0． 559 339 ±0． 007 718 h 0． 320 966 ±0． 001 741 j 0． 238 372 ±0． 006 072 i 0． 079 323 ±0． 001 964 f
9 0． 390 075 ±0． 001 261 d 0． 237 524 ±0． 000 480 d 0． 152 551 ±0． 001 740 ef 0． 086 864 ±0． 000 699 g
10 0． 428 445 ±0． 003 879 e 0． 260 105 ±0． 001 019 f 0． 168 340 ±0． 003 108 g 0． 062 898 ±0． 000 801 d
11 0． 674 572 ±0． 003 747 j 2． 507 170 ±0． 001 878 n 0． 271 283 ±0． 001 869 j 0． 068 015 ±0． 000 537 e
12 0． 394 948 ±0． 000 952 d 0． 249 923 ±0． 002 003 e 0． 145 025 ±0． 001 051 def 0． 068 378 ±0． 000 921 e
13 0． 524 371 ±0． 008 393 h 0． 285 332 ±0． 003 179 g 0． 239 039 ±0． 005 280 i 0． 044 919 ±0． 000 686 a
14 0． 332 034 ±0． 001 802 b 0． 208 814 ±0． 000 812 b 0． 123 220 ±0． 001 804 ab 0． 049 450 ±0． 000 721 b
15 0． 358 345 ±0． 000 674 c 0． 225 250 ±0． 001 419 c 0． 148 865 ±0． 000 745 ef 0． 055 163 ±0． 000 653 c
16 0． 319 352 ±0． 006 201 a 0． 195 264 ±0． 002 542 a 0． 124 088 ±0． 003 704 ab 0． 046 888 ±0． 000 803 a
注:同列相同字母表示差异性不显著(p ＞0． 05) ，不同字母表示表示差异性显著(p ＜0． 05)。
(下转第 11172页)
86111 安徽农业科学 2012 年
discovery mechanisms and exploitation［J］． Philos Trans R Soc London B，
1999，354:659 －664．
［2］李盼，梁慧媛．外壳蛋白介导的病毒抗性［J］．生物学通报，2005，40(5):
61 －62．
［3］REGISTER J C III，BEACHY R N． Resistance to TMV in transgenic plants
results from interference with an early event in infection［J］． Virology，
1988，166:524 －532．
［4］MISE K，TSUGE S，NAGAO K，et al． Nucleotide sequence responsible for
the synthesis of a truncated coat protein of brome mosaic virus strain
ATCC66［J］． Journal of General Virology，1992，73:2543 －2551．
［5］徐丽．马铃薯 Y病毒复制酶基因介导的病毒抗性研究［D］．泰安:山东
农业大学，2010．
［6］GOLEMBOSKI D B，LOMONOSSOFF G P，ZAITLIN M． Plants transformed
with tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the
virus［J］． Agricultural Sciences，1990，87:6311 －6315．
［7］CARR J P，MARSH L E，LOMONOSSOFF G P，et al． Resistance to tobacco
mosaic virus induced by the 54-kD agene sequence requires expression of
the 54-kDa protein［J］． Mol Plant Microbe Interact，1992，5:397 －404．
［8］郦永忠，王钧．植物病毒的运动蛋白［J］．细胞生物学杂志，1994，16(2):
61 －64．
［9］刘晓玲． PVX25kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究
［D］．泰安:山东农业大学，2005．
［10］夏宗良，曹汝菲，王美平．大麦黄矮病毒运动蛋白及其介导的小麦抗
病性研究进展［J］．麦类作物学报，2010，30(1):173 －177．
［11］YANG X C，YE Y，ZHU F，et al． Ribozyme 2 mediated high resistance a-
gainst potato spindle tuber viroid in transgenic potatoes［J］． PNAS USA，
1997，94(10):4861 －4865．
［12］GESSNER S L，IRIVIN K D． Inhibition of clongation factor 2-dependent
translocation by the pokeweed antiviral protein and riein［J］． Biol Chem，
1980，255:3251．
［13］TUMER N E，HWANG D J，BONNESS M． C-terminal deletion mutant of
pokeweed antiviral pro-tein inhibits viral infection but does not depttri-
nate host ribosomes［J］． Proc Nail Acad Sci USA，1997，94(8):3866 －
3871．
［14］HUDAK K A，WANG P，TUMER N E． A novel mechanism for inhibition
of translation by pokeweed antiviral protein:depurination of the capped
RNA template［J］． RNA，2000，6:369 －380．
［15］PESTKA S，KRAUSE C D，WALTER M R． Interferons，interferon-like cy-
tokines，and their receptors［J］． Immunol Rev，2004，202:8 －32．
［16］SHEPPARD P，KINDSVOGEL W，XU W，et al． IL-28，IL-29 and their
classⅡcytokine receptor IL-28R［J］． Nat Immunol，2003，4(1):63 －68．
［17］姚清侠．猪干扰素 α、猪 β扰素与猪 γ干扰素的抗病毒活性及其免疫
佐剂的研究［D］．武汉:华中农业大学，2007．
［18］周琳．干扰素在人神经细胞内的表达调节及抗病毒作用［D］．武汉:华
中科技大学，2009．
［19］NAKAZAWA H，TSUNEISHI E，PONNUVEL K M，et al． Antiviral activity
of a serine protease from the digestive juice of Bombyx mori larvae against
nucleopolyhedrovirus［J］． J Virology，2004，321:154 －162．
［20］姚慧鹏，何芳青，郭爱芹，等．中国野蚕一种强抗病毒蛋白的基因分析
和活性鉴定［J］．中国科学 C辑:生命科学，2008，38(6):521 －526．
［21］张峰，陈秀，赵昀，等．抗NPV-核酶转基因蚕的研究［J］．生物化学与生
物物理学报，1999，31(3):331 －333．
［22］鲁银松．基于转基因 RNAi抑制家蚕杆状病毒增殖研究［D］．苏州:苏
州大学，2009．
［23］薛仁宇，曹广力，王崇龙，等．基于DNA载体的RNA i抑制家蚕核型多
角体病毒复制［J］．蚕业科学，2006，32(3):362 －367．
［24］VALDES V J，SAMPIERI A，SEPULVEDA J，et al． Using double-stranded
RNA to prevent in vitro and in vivo viral infections by recombinant bacu-
lovirus［J］． The Journal of Biological Chemistry，2003，278(21):19317 －
19324．
［25］鲁银松，薛仁宇，曹广力，等．表达短 lef-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核
型多角体病毒的抗性［J］．生物化学与生物物理进展，2009，36(10):
1356 －1363．
［26］夏定国，张国政，王文兵，等． gp64基因相应 dsRNA对家蚕核型多角体
病毒(BmNPV)增殖的抑制［J］．中国农业科学，2007，40(12):2882 －
2887．
［27］夏定国． RNA干扰介导抑制家蚕核型多角体病毒BmNPV增殖的研究
［D］．北京:中国农业科学院，2006．
［28］ZHANG Y，ZHANG J W，YI Y Z，et al． Expression of recombinant gene
P1 －2A3C of FMDV Asia I in different Bombyx mori varieties［J］． Agri-
cultural Science ＆ Technology，2011，12(10):1528 －1530．
［29］王更先，司马杨虎，张升祥，等．家蚕 Osiris基因家族的克隆与序列结
构及表达研究［J］．华北农学报，2010(6):1 －8．
［30］ZHAO Y，WU Y C，ZHANG J． The Construction of heat － resistant near
isogenic line (NIL)of Bombyx mori and the development of molecular
marker breeding technique［J］． Agricultural Science ＆ Technology，2010，
11(1):92 －95．
［31］李文学，青学刚，刘俊凤，等．家蚕品种 871C ×872C对 BmNPV抗性鉴
定研究［J］．西南农业学报，2011(2):779 －781．
［32］孔卫青，杨金宏，彭云武，等．家蚕黄酮合酶Ⅰ基因 BmFNSⅠ的克隆与干
涉载体的构建［J］．华北农学报，2009(5):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
26 －30．
(上接第 11168页)
3 结论与讨论
绿色植物的产量形成取决于其叶片的光能利用率，而叶
片的光能利用率高低与叶绿素含量的多少直接相关。因此，
研究植物叶片叶绿素含量具有一定意义。研究表明，酒石酸
铵对银叶真藓原丝体中光合色素含量的增加有一定作用。
6-BA作为细胞分裂素，对于原丝体中叶绿体 a或 b的含量的
增加无作用。而 NAA或 IAA作为生长素有促进原丝体生长
的作用，当其浓度达到 0． 5 mg /g时，可考虑选择使用其中任
一种。使用改良 Knop培养基，并添加 0． 05 mg /L 6-BA，0． 5
mg /L NAA(或 IAA) ，0． 7 mg /L酒石酸铵，有利于获得光合能
力强的银叶真藓原丝体，这将为下一步其分化为大量配子体
奠定坚实的物质基础。
参考文献
［1］丁恒山．中国药用孢子植物［M］．上海:上海科学技术出版社，1982:15．
［2］衣艳君．中国药用苔藓植物资源［J］．中草药，2000，31(8):624．
［3］吴玉环，杨海英，罗昊，等．东北地区药用苔藓植物资源及其开发利用
前景［J］．生态学杂志，2004，23(5):218．
［4］中国科学院昆明植物研究所．云南植物志(第十八卷)［M］．北京:科学
出版社，2002:225．
［5］黄士良，李敏，张秀萍，等．三种植物生长调节剂对密叶绢藓(Entodon
challengeri)孢子萌发、原丝体发育及芽体发生的影响［J］．武汉植物学
研究，2007，25(1):65 －69．
［6］周金川，熊源新，王莉爽，等．几种植物生长调节剂对三种苔藓植物生
长的影响［J］．贵州农业科学，2009，37(11):54 －56．
［7］陈静文．苔藓植物的组织培养———小立碗藓、真藓、小蛇苔［D］．上海:
上海师范大学，2006．
［8］包维楷，冷俐．相同环境下 3种藓类植物光和色素含量的比较［J］．植
物资源与环境学报，2005，14(3):53 －54．
27111 安徽农业科学 2012 年