全 文 ：收稿日期:2010-07-05;　修订日期:2011-02-20
基金项目:教育部春晖计划项目(No.Z2008-1-75014);宁夏回族自治
区自然科学基金(No.NZ0892)
作者简介:王培香(1987-),女(汉族),山东青岛人 ,现为宁夏医科大学在
读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事天然产物化学及中药药理学研究工
作.
＊通讯作者简介:王　妍(1958-), 女(汉族),陕西西安人 , 现任宁夏医科
大学教授 ,学士学位 ,主要从事天然产物化学及中药药理学研究工作.
沙枣叶醇提物各组分清除 DPPH自由基的研究
王培香 1 , 王培先2 ,解宁湘 3 ,黄晓会 1 , 张振华1 ,姚　遥 1 ,王基云1 , 王　妍 1＊
(1.宁夏医科大学 ,宁夏 银川　750004;　2.山东省胶南市人民医院　266400;　
3.宁夏医科大学附属医院 ,宁夏 银川　750004)
摘要:目的 通过 DPPH抗氧化活性体外评价体系测定沙枣叶醇提物各组分的抗氧化活性 、清除自由基的能力。方法 将
沙枣叶乙醇提取物依次用石油醚 ,醋酸乙酯 , 正丁醇进行萃取 ,各组分都配置成适当倍数的的水溶液 , 通过 DPPH法测定
各组分的清除自由基的能力 , 并计算各组分的 IC50。结果 萃取后的水层清除自由基的能力最强 , IC50为 0.70 mg/ml, 其
次是正丁醇层(IC50为 3.47 mg/ml),醋酸乙酯层(IC50为 13.9mg/ml)和石油醚层(IC50为 63.6mg/ml)。结论 沙枣叶醇提
物各组分对 DPPH·均具有一定清除作用 , 具有体外抗氧化性 , 可作为有效的天然自由基清除剂 , 具有很大的开发利用
前景。
关键词:沙枣叶;　DPPH·
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.08.021
中图分类号:Q948　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2011)08-1848-02
ScavengingActivityofEachPartofEthanolExtractofLeafofElaeagnusangustifoliaL.
againstDPPH
WANGPei-xiang1 , WANGPei-xian2 , JIENing-xiang3 , HUANGXiao-hui1 , ZHANGZhen-hua1 , YAOYao1 , WANG
Ji-yun1 , WANGYan1＊
(1.NingxiaMedicalUniversity, Yinchuan, 750004 , China;2.ThePeoplesHospitalofJiaonan, Qingdao,
266400, China;3.AfiliatedHospitalofNingxiaMedicalUniversity, Yinchuan750004, China)
Abstract:ObjectiveTostudythescavengingactivityofeachpartofethanolextractofleafofElaeagnusangustifoliaL.against
DPPHfreeradical.MethodsTheethanolextractofleafofElaeagnusangustifoliaL.wasextractedbyligroin, acetidinandn-
butanolinturn, andeachpartwasconfiguredtotheappropriatemultipleofthesolution, andDPPHassaywasusedtomeasurethe
antioxidantactivity.ResultsThewaterlayerextractedhadthestrongestfreeradicalscavengingactivity, IC50 was0.70mg/ml,
folowedbyn-butanollayer(IC50 was3.47mg/ml), acetidinlayer(IC50 forthe13.9mg/ml)andligroin(IC50 forthe63.6mg/
ml).ConclusionEachpartoftheethanolextractofleafofElaeagnusangustifoliaL.hasscavengingactivityagainstDPPH, and
canbeusedasanefectivenaturalfreeradicalscavenger.
Keywords:leafofElaeagnusangustifoliaL.;　DPPH·
　　沙枣 ElaeagnusangustifoliaL.属胡颓子科落叶乔木 , 亦称银
柳 、香柳 、桂柳 , 集中分布于我国东北 、华北 、西北等地区 , 自然资
源极为丰富 [ 1] 。沙枣的果实 、枝叶 、花均能供药用 , 临床上多用
于脾胃虚弱 、消化不良 、肠炎腹泻 、肺热咳嗽等疾病的治疗 [ 2] 。
沙枣叶经粗提后制成的总黄酮片 ,能治疗慢性气管炎 ,沙枣叶的
黄酮制剂有缓解冠心病患者的症状 ,减少心绞痛的发病次数及改
善心电图的作用 [ 3] 。近年来对沙枣的研究主要集中在果实方
面 , 对沙枣叶的研究较少。本实验通过体外实验 ,对沙枣叶片醇
提取物抗氧化活性进行了初步检测 ,为沙枣的综合开发利用提供
依据。
1　仪器与材料
1.1　材料 沙枣叶片采自宁夏银川郊区 , 经阴干 、密封 、保存。
1.2　仪器与试剂 VIS-7220N可见分光光度计(北京瑞利分析
仪器公司);AL104电子天平(梅特勒 -托利多仪器有限公司);
旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);SHB-B95型循环水式多
用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DK-S14电热恒温水浴
锅(上海精宏实验设备有限公司)。
1.3　试剂 1, 1-二苯基 -2-苦肼基自由基(DPPH· )(日本东
京化成工业株式会社);甲醇 、乙醇等均为国产分析纯。
2　方法
2.1　DPPH法测定沙枣叶醇提物抗氧化 、清除自由基的原理
1, 1-二苯基 -2-苦肼基自由基(DPPH· )是一种较稳定的自
由基 , 较多的用于抗氧化剂清除自由基实验。由于 DPPH自由基
在 515 nm处有一强吸收 ,当有自由基清除剂存在时 ,与其单电子
配对而使其吸收逐渐消失 ,其褪色程度与其所接受的电子数成定
量关系 , 因此可利用分光光度法有效地测定抗氧化剂清除自由基
的能力 。
2.2　DPPH标准曲线的制作 准确称取 DPPH2.5 mg, 用甲醇定
容到 100 ml, 配制成质量浓度为 2.5×10-2 mg/ml的标准溶液 ,
置冰箱中备用(现用现配)。分别取 0, 2, 4, 6, 8, 10 ml标准溶液 ,
用甲醇定容至 10 ml, 最终质量浓度分别为 0, 5, 10, 15, 20, 25μg/
ml。测定上述标准溶液在 515 nm波长处的吸光度 , 制作标准曲
线(见图 1)。由图 1可得标准曲线的线性方程 Y=0.025 2X+
0.003 2, R2 =0.999 4,标准曲线显示良好的线性。
2.3　沙枣叶清除 DPPH自由基供试品的制备 称取 100g干燥的
·1848·
时珍国医国药 2011年第 22卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.8
沙枣叶 , 置于圆底烧瓶中 ,加入 1 L80%乙醇 ,加热煮沸回流 2 h,
抽滤 , 滤渣同法再提取两次。合并滤液 ,置旋转蒸发仪减压回收
溶剂至干 , 然后溶于 100 ml蒸馏水中 , 即得到相当于原药材 1 g/
ml的水溶液。
将 100 ml的水溶液转移至分液漏斗中 , 加入等量石油醚 ,充
分振荡 , 放置分层后 ,得到下层水液;同法反复萃取至石油醚层的
颜色清淡为止 , 合并石油醚萃取液 , 减压浓缩至干 , 用 100 ml的
蒸馏水溶解 , 即得到相当于原药材 1 g/ml的石油醚层的水溶液。
经石油醚萃取后的水液 , 加入等量醋酸乙酯萃取 , 方法同上 ,
最后得到相当于原药材 1 g/ml的醋酸乙酯层的水溶液。
经醋酸乙酯萃取后的水液 ,加入等量正丁醇萃取 , 方法同上 ,
最后得到相当于原药材 1 g/ml的正丁醇层的水溶液。
保留萃取后的水液 ,加蒸馏水至 100 ml, 得到相当于原药材
1 g/ml的萃后水液。
各试剂稀释成适当倍数进行自由基清除率的实验。
图 1　DPPH吸光度 -浓度标准曲线
2.4　测定方法和清除率的计算 对 DPPH· 自由基清除方法的
测定参阅 Brand-Wiliam(1995)[ 4] 。分别取以上不同组分溶液
各 20, 40, 60, 80, 100μl,量取浓度为 2.5×10 -2的 DPPH·溶液至
4 ml,立即混匀 , 用比色皿在 515 nm波长处进行测定 , 在一定时
间间隔内测定吸光度 ,直到读数稳定。
通过公式:清除率(%)=[ 1-A1 /A0] ×100%来计算自由基
清除率。
式中 A0为未加试样的 DPPH·在 515nm处的吸光度 , A1为
抗氧化性物质与 DPPH·反应后的 515 nm处的吸光度。
2.5　清除 50%自由基时样品浓度(IC50)的计算 根据 DPPH·
清除率与沙枣叶醇提物各组分添加量 , 制作二者的关系曲线 ,通
过线性回归分析可以得到回归方程 ,而根据回归方程式可以计算
出 DPPH·清除率为 50%时各组分的添加量即 IC50值 , IC50越小
其清除自由基能力越强。
3　结果
原药材浓度(mg/ml)=加样体积(ml)×1(mg/ml)/[反应体
系总体积(ml)×稀释倍数 ]
由图 2 ～ 5可以看出 , 各组分对 DPPH· 都具有一定的清除
活性。随着各组分加入量 , 即浓度的增加 , 其对 DPPH·的清除
能力增加 , 呈现明显的剂量效应关系。
图 2　沙枣叶石油醚萃取液清除DPPH自由基的剂量 -效应关系
图 3　沙枣叶醋酸乙酯萃取液清除 DPPH自由基的剂量 -效应关系
图 4　沙枣叶正丁醇萃取液清除 DPPH自由基的剂量 -效应关系
各组分的线性回归方程分别为:
石油醚层:Y=0.765 9X+1.275 7 , IC50 =63.6 mg/ml;
醋酸乙酯层:Y=3.608 6X-0.223 8 , IC50 =13.9 mg/ml;
正丁醇层:Y=14.9X-1.7 , IC50 =3.47 mg/ml;
萃后水层:Y=68.983X+1.885 7 , IC50 =0.70 mg/ml。
从结果可以看出 , 沙枣叶醇提物各组分清除 DPPH自由基能
力的强弱顺序为萃后水层 , 正丁醇层 , 醋酸乙酯层 , 石油醚层 , 其
IC50依次为 0.70, 3.47, 13.9, 63.6mg/ml。提示沙枣叶醇提物中清
除 DPPH的主要活性成分为极性大的成分 ,主要分布在水液中。
图 5　沙枣叶萃取水层清除 DPPH自由基的剂量 -效应关系
4　讨论
本文采用 DPPH·法对沙枣叶的乙醇提取物的各组分体外
抗氧化活性进行了较为全面的研究 , 从实验结果可以看出 , 各组
分均有不同程度的清除作用 ,萃后水层和正丁醇的清除率能力最
强 , 可见沙枣叶的抗氧化成分主要集中在极性大的部分 , 这将为
我们以后的有效成分的提取分离提供重要的依据。
同时 ,本文对沙枣叶水提物的各组分清除 DPPH· 进行了定
量研究 ,确定了各组分清除 50%自由基时的样品浓度 , 为以后沙
枣叶在抗氧化剂的应用上提供了基本依据。
参考文献:
[ 1 ] 　中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志 ,第 53卷 , 第 2分
册 [ M] .北京:科学出版社 , 1983:41.
[ 2 ] 　江苏新医学院.中药大辞典 , 上册 [ M] .上海:上海科技出版社 ,
1997:1162.
[ 3 ] 　刘媖心 ,杨喜林 ,姚育英.中国沙漠植物志 ,第 2卷 [ M] .北京:科学
出版社 , 1987:392.
[ 4 ] 　Brand-WiliamsW, CuvelierME, BersetC· Useofafreeradical
methodtoevaluateantioxidantactivity[ J] .LebensmWissTechnol,
1995, 28(1):25.
·1849·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.8 时珍国医国药 2011年第 22卷第 8期