全 文 ：第 43 卷第 23 期
2015 年 12 月
广 州 化 工
Guangzhou Chemical Industry
Vol. 43 No. 23
Dec. 2015
分析测试
马甲子果水提物中几类物质含量的
测定和 DPPH·活性的清除*
赵玉丹，李双君，张 桃，王晓丽，马 怡，杨孝容
(乐山师范学院化学学院，四川 乐山 614004)
摘 要:测定马甲子果水提物中的多糖、蛋白质、总黄酮和灰分含量以及清除 DPPH·自由基的能力。将马甲子果水提液经
适当浓缩，喷雾干燥得马甲子果水提物，用分光光度法测定提取物中的多糖、蛋白质和总黄酮的含量而用重量分析法测定灰分的
含量;同时测定提取物对 DPPH·自由基的清除能力，并与维生素 C 作对比。结果表明马甲子果水提物中多糖、蛋白质、总黄酮
和灰分的含量分别为 22. 68% ～ 26. 37%、3. 36% ～ 4. 60%、5. 41% ～ 8. 17%和 18. 92% ～ 21. 71%，且在一定浓度范围内对 DPPH·
自由基的清除能力有明显的量效关系。马甲子果水提物含有丰富的多糖、蛋白质、黄酮和矿物质，可为马甲子果的进一步研究提
供参考。
关键词:马甲子果;水提物;含量测定;清除 DPPH·自由基
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:A 文章编号:1001－9677(2015)023－0156－03
* 基金项目:国家大学生创新创业训练计划项目 (No. 201410649003)。
第一作者:赵玉丹 (1993－) ，女，乐山师范学院 2012 级应用化学班在读本科生。
通讯作者:杨孝容 (1966－) ，女，教授，主要从事天然产物的研究。
Contents of Several Kinds of Substances and Activity to Scavenge DPPH·
Free Ｒadical on Water Extract from the Fruits of Paliurus Ｒamosissimus
ZHAO Yu－dan，LI Shuang－jun，ZHANG Tao，WANG Xiao－li，MA Yi，YANG Xiao－rong
(College of Chemistry，Leshan Normal University，Sichuan Leshan 614004，China)
Abstract:The contents of polysaccharide，protein，total flavonoids and ash were determined and the activity to
scavenge DPPH· free radical on water extract of the fruits of Paliurus ramosissimus was tested. The water extract was
obtained by spray drying solution of using pure water as solvent to extract components from the fruits of Paliurus
ramosissimus. The contents of polysaccharide，protein，total flavonoids were determined by spectrophotography and the ash
was determined by gravimetric analysis and the activity to scavenge DPPH· free radical was tested and compared with
ascorbic acid on the water extract of Paliurus ramosissimus. The results showed that the contents of polysaccharide，
protein，total flavonoids and ash were 22. 68% ～ 26. 37%，3. 36% ～ 4. 60%，5. 41% ～ 8. 17% and 18. 92% ～
21. 71%，respectively. The water extract had some scavenging effect to DPPH· free radical in a certain concentration
range. The water extract of the fruits of Paliurus ramosissimus was rich in polysaccharide，protein，flavonoid and mineral.
The study can provide reference for the further study of the fruits of Paliurus ramosissimus.
Key words:fruits of Paliurus ramosissimus;water extract;content determination;scavenge DPPH· free radical
马甲子为鼠李科铜钱树属植物马甲子(Paliurus ramosissimus
(Lour.)Poir. ) ，又名铁篱笆、雄虎刺、铁菱角等。主要功效
祛风散瘀，解毒消肿，用于治疗风湿痹痛，咽喉肿痛，跌打损
伤，痈疽，发表解毒，除寒活血等。马甲子果主治化瘀生新，
吐血，疗痔疮等［1］。马甲子茎和根的化学成分的研究相对较
多，化学成分有三萜类、环肽生物碱等［1－7］，马甲子果化学成
分的研究较少，有三萜类、香豆素类和二氢黄酮类等［8－9］。马
甲子果水提物的主要成分和抗氧化性试验的研究未见报道。本
文将马甲子果水提液喷雾干燥得马甲子果水提物，测定其多
糖、蛋白质、总黄酮和灰分的含量，并测定体外条件下对
DPPH·自由基的清除能力，并与抗坏血酸作对比。可为马甲
子果化学成分的进一步研究提供一些参考。
1 实验部分
1. 1 主要仪器和试剂
仪器:ZN－400A型高速万能粉碎机，吉首市中诚制药机械
厂;ＲE52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;SHZ－III循环
水真空泵，上海亚荣生化仪器厂;微型喷雾干燥实验装置，天
津大学北洋化工实验设备有限公司;V－630 紫外－可见分光光
度计，日本 JASCO公司;LD5－10 型京立离心机，北京京立离
心机有限公司;DF－1 型集热式磁力搅拌器，江苏金坛市金城
第 43 卷第 23 期 赵玉丹，等:马甲子果水提物中几类物质含量的测定和 DPPH·活性的清除 157
国胜实验仪器厂;AUY120 分析天平，日本岛津公司;SX2－5－
12 电阻炉，上海意中电炉有限公司;20 ～ 5000 μL 系列大龙移
液器，杭州陆恒生物科技有限公司。
试剂:无水乙醇，70%乙醇，30%乙醇;5%苯酚溶液(滴
加 NaOH至苯酚刚好溶解) ;浓硫酸;1. 000 mg /mL 葡萄糖溶
液;1. 000 mg /mL牛血清蛋白(BSA)储备液和 0. 100 mg /mL 的
BSA工作液;0. 10 mg /mL. 考马斯亮蓝 G－250 溶液 (50. 0 mg
考马斯亮蓝 G－250 于小烧杯中，加入 25 mL 95%乙醇和 60 mL
85% 的磷酸溶解，用水稀释至 500 mL，混匀) ;0. 500 mg /mL
芦丁 70%乙醇溶液;5% NaNO2 溶液;10% Al(NO3)3 溶液(含
0. 1 mol /L HNO3) ;2% NaOH 溶液;0. 5000 mg /mL 抗坏血酸
(Vc)溶液;40 μg /mL 1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)乙醇
溶液。实验用水为超纯水，实验试剂为分析纯。
马甲子果:1#、2#是 2014. 10 采自乐山土主镇不同果园围
墙铁篱笆的果实，3#是 2013. 10 采自乐山土主镇果园围墙铁篱
笆的果实。除去树叶残肢等杂物，自然阴干后装袋储存。用时
用 ZN－400A型高速万能粉碎机粉碎成粉直接使用。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 马甲子果水提物的提取
分别称取 1#、2#和 3# 马甲子果粉末 250 g 于三个大烧杯
中，分别加水 1000 mL，在 DF－1 型集热式磁力搅拌器 80 ℃恒
温提取 2 h，共提三次。用纱布过滤，滤液用 LD5－10 型京立离
心机 5000 r /min 离心 15 min，合并三次离心液，离心液经
ＲE52AA旋转蒸发器减压浓缩至 800 mL左右。用微型喷雾干燥
装置干燥浓缩液得马甲子果水提物。条件设定为电流 10 A，温
度 200 ℃，喷嘴压力 0. 15 MPa，空气流量 15 m3 /h，蠕动泵进
料量 33 r /min。
1. 2. 2 多糖含量的测定
硫酸－苯酚法测定多糖:参考文献［10］作适当改进制作糖
的标准曲线。分别量取 0. 10 mL、0. 20 mL、0. 40 mL、0. 60 mL、
0. 80 mL、1. 00 mL 1. 000 mg /mL 葡萄糖溶液于 10 mL 比色管
中，用水定容至刻度，混匀。得葡糖糖标准工作液的浓度分别
为 0. 010 mg /mL、0. 020 mg /mL、0. 04 mg /mL、0. 060 mg /mL、
0. 080 mg /mL、0. 100 mg /mL。分别量取葡萄糖标准工作液和浓
度为 0. 100 mg /mL样品工作液 2. 00 mL于 10 mL比色管中，加
入 1. 00 mL 5%苯酚溶液和 5. 00 mL浓硫酸。沸水浴 15 min，冷
却，测定 490 nm处的吸光度 A490绘制糖的标准曲线和测定样品
中多糖含量。标准曲线的参比溶液用 2. 00 mL水代替标准工作
液，样品测定的参比溶液用 1. 00 mL 水代替苯酚，其它试剂
一样。
1. 2. 3 蛋白质含量的测定
考马斯亮蓝 G－250 染色法测定蛋白质含量:标准曲线的制
作参考文献［11］。移取 0. 100 mg /mL的 BSA标准工作液 0 mL、
0. 10 mL、0. 20 mL、0. 40 mL、0. 60 mL、0. 80 mL、1. 00 mL于
10 mL 的比色管中，分别补水 1. 00 mL、0. 90 mL、0. 80 mL、
0. 60 mL、0. 40 mL、0. 20 mL、0 mL，使每支管中溶液体积为
1. 00 mL，再分别加入 5. 00 mL 的考马斯亮蓝 G－250 溶液，混
匀。放置 20 min后在 595 nm 处测定吸光度 A595。样品测定量
取 1. 00 mL 0. 500 mg /mL的样品溶液，其余于标准曲线制作相
同。绘制蛋白质染色的标准曲线和测定样品中蛋白质的含量。
1. 2. 4 总黄酮含量的测定
用 NaNO2－Al(NO3)3 －NaOH分光光度法测定总黄酮:参考
文献［12］作适当改进制作黄酮芦丁的标准曲线。分别量取
0. 20 mL、0. 50 mL、1. 00 mL、1. 50 mL、2. 00 mL、2. 50 mL、
3. 00 mL、4. 00 mL的 0. 500 mg /mL的芦丁溶液于 10 mL的比色
管中，用 30%的乙醇定容至刻度，混匀得芦丁标准工作液的浓
度分别为 0. 010 mg/mL、0. 025 mg/mL、0. 050 mg/mL、0. 075 mg/
mL、0. 100 mg /mL、0. 125 mg /mL、0. 150 mg /mL、0. 200 mg /
mL。样品溶液用 30%乙醇配制为 0. 500 mg /mL 溶液。分别量
取 2. 00 mL的标准工作液和样品溶液于 10 mL比色管中，加入
1. 00 mL 5% NaNO2 溶液，振荡，放置 5 min 后加入 0. 50 mL
10% Al(NO3)3 溶液，振荡，放置 5 min 后加入 2. 50 mL 2%
NaOH溶液和 2. 00 mL 30%乙醇溶液，振荡混匀。制作标准曲
线的参比溶液用水代替标准溶液，样品测定的参比溶液用水代
替 NaNO2，其它与标准曲线的制作相同。放置 20 min 测定
495 nm 处吸光度 A495绘制黄酮标准曲线和测定样品中总黄酮的
含量。
1. 2. 5 灰分含量的测定
炽烧残渣法测定灰分含量:参考文献［13］作适当改进。准
确称取 0. 2 ～ 0. 3 g的样品于 750 ℃电阻炉灼烧至恒重的瓷坩埚
中，加 5 滴浓硫酸润湿，在小电炉上灰化完全除尽硫酸蒸气
后，再移入 750 ℃的电阻炉灼烧至恒重。根据样品质量、空坩
埚和灰分及坩埚质量计算灰分的含量。
灰分=灰分及坩埚质量－空坩埚质量
样品质量
×100%
1. 2. 6 清除 DPPH·自由基试验
参考文献［14］作适当改进测定清除 DPPH·自由基能力。
分别量取 500 μg /mL的抗坏血酸和样品溶液 0. 05 mL、0. 10 mL、
0. 20 mL、0. 40 mL、0. 60 mL、0. 80 mL、1. 00 mL、2. 00 mL和
4. 00 mL 于 10 mL 的比色管中，加水定容，得浓度分别为
2. 5 μg /mL、5. 0 μg /mL、10. 0 μg /mL、20. 0 μg /mL、30. 0 μg /mL、
40. 0 μg /mL、50. 0 μg /mL、100. 0 μg /mL、200. 0 μg /mL 9 个浓
度梯度的溶液。样品组:抗坏血酸或样品溶液 3. 00 mL+DPPH
溶液 3. 00 mL;空白组:抗坏血酸或样品溶液 3. 00 mL+乙醇
3. 00 mL;对照组:水 3. 00 mL+DPPH溶液 3. 00 mL。放置 30 min
后在 525 nm处测定吸光度 A525。
DPPH·自由基清除率= 1－
A－Ai
A( )0 ×100%
式中:A———样品组吸光值
Ai———空白组吸光值
A0———对照组吸光值
2 结果与讨论
2. 1 波长的选择
“1. 2. 2”节苯酚－硫酸显色法测定多糖含量，“1. 2. 3”节
考马斯亮蓝 G－250 染色法测定蛋白质， “1. 2. 4”节 NaNO2 －
Al(NO3)3 －NaOH络合法测定总黄酮，“1. 2. 6”节 DPPH·自由
基的清除率均采用可见分光光度法测定。分别扫描各自溶液的
吸收曲线，选择各自溶液的最大吸收波长作为测定波长。多糖
显色、蛋白质染色、黄酮显色和 DPPH 溶液的最大吸收波长分
别为 490 nm、595 nm、495 nm和 525 nm。
2. 2 马甲子果水提物的得率
按“1. 2. 1”节实验方法，1#、2#和 3#马甲子果粉经水提，
喷雾干燥得到水提物的粉末在 10 g ～ 13 g，得率为 4. 0% ～
5. 2% (喷雾干燥时有部分产物附在喷雾桶的壁上无法扫下，
提取率比得率大些)。
2. 3 含量测定
按“1. 2. 2”节、“1. 2. 3”节和“1. 2. 4”节实验方法分别
绘制的多糖、蛋白质和黄酮的标准曲线见表 1。从表 1 可知多
158 广 州 化 工 2015 年 12 月
糖、蛋白质和黄酮在其线性范围内吸光度与浓度或质量之间有
良好的线性关系。
表 1 多糖、蛋白质和黄酮的线性关系
Table 1 Linear equations，correlation coefficients and linear
ranges of polysaccharide，protein，total flavonoids
物质 线性回归方程 相关系数 线性范围
多糖 A=0. 005+12. 3c(mg /mL) 0. 9992 0. 010 ～ 0. 100
蛋白质 A=－0. 007+6. 55m(mg) 0. 9994 0. 010 ～ 0. 100
黄酮 A=－0. 009+2. 56c(mg /mL) 0. 9991 0. 010 ～ 0. 200
表 2 马甲子果水提物多糖、蛋白质、总黄酮和
灰分测定结果 (n=4)
Table 2 Ｒesults of polysaccharide，protein，total flavonoids and
ash in the water extract of the fruits of Paliurus ramosissimus (n=4)
物质
1#
测定值 /% ＲSD /%
2#
测定值 /% ＲSD /%
3#
测定值 /% ＲSD /%
多糖 24. 67 1. 3 26. 37 1. 4 22. 68 1. 5
蛋白质 4. 60 0. 86 4. 06 0. 44 3. 36 2. 1
总黄酮 8. 17 1. 2 6. 09 1. 8 5. 41 2. 0
灰分 19. 15 0. 14 18. 92 0. 74 21. 75 0. 04
从表 2 看出，不同年份、不同采摘地点的马甲子果水提物
的多糖、蛋白质、黄酮和灰分的含量有一定的差异。引起这种
差异的原因是多方面的，除与生长的土壤环境、采光、生长时
间等客观原因有关外，还与提取率、测定误差等主观原因
有关。
2. 4 清除 DPPH·自由基分析结果
图 1 马甲子果水提物对 DPPH·自由基的清除率与
浓度之间的关系曲线
Fig. 1 Ｒelationship curve between clearance rate to DPPH· free radical
and concentration of water extract of the fruits of Paliurus ramosissimus.
从图 1可知，随着抗坏血酸和样品浓度的增加，对 DPPH·
自由基的清除率逐渐增大，当对 DPPH·自由基清除率为 50%
时，抗坏血酸和 1#、2#及 3#的浓度 IC50分别为 2. 84 μg /mL、
15. 8 μg /mL、18. 9 μg /mL和 20. 8 μg /mL。在一定的浓度范围
内，对 DPPH·自由基的清除率 P 与浓度 c 具有良好的线性关
系。线性关系见表 3。
表 3 清除 DPPH·自由基与浓度的线性关系
Table 3 Linear equations，correlation coefficients and linear
ranges of clearance rate to DPPH· free radical with concentration
物质 线性回归方程 相关系数 线性范围
1# P=5． 26+2． 59c(μg /mL) 0. 9952 1. 25 ～ 25
2# P=4． 49+2． 43c(μg /mL) 0. 9983 1. 25 ～ 25
3# P=2． 16+2． 28c(μg /mL) 0. 9994 1. 25 ～ 25
抗坏血酸 P=1． 40+16． 4c(μg /mL) 0. 9968 1. 25 ～ 5. 0
3 结 论
马甲子果水提液喷雾干燥物的多糖、蛋白质、总黄酮和灰
分的含量分别为 22. 68% ～ 26. 37%、3. 36% ～ 4. 60%、5. 41% ～
8. 17%和 18. 92% ～ 21. 71%;在一定浓度范围内对 DPPH·自
由基的清除能力具有良好的线性关系，清除率只有抗坏血酸的
清除率的 1 /7. 2 ～ 1 /6. 3。所以，马甲子果水提物含有丰富的多
糖、蛋白质、黄酮和矿物质，并具有一定的抗氧化能力。
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