全 文 ：［收稿日期］ 20140809(001)
［基金项目］ 贵州省中药现代化研究开发专项(黔科合中药字［2013］50191，黔科合重 G字［2013］4001) ;贵州省科学技术基金(黔科合 J
字［2011］2291 号;贵州省高等学校创新能力提升计划(黔科合协同创新字［2013］04)
［第一作者］ 刘晓艳，在读硕士，Tel:18786706750，E-mail:liuxy_25@ 163． com
［通讯作者］ * 王永林，教授，博士生导师，Tel:0851-6908899，E-mail:gywyl@ emc． edu． cn
酢浆草提取物对成骨细胞增殖及分化的影响
刘晓艳1，董莉1，刘亭1，李靖2，刘俊宏2，席晓岚1，王永林1*
(1. 贵阳医学院 药学院 贵州省药物制剂重点实验室，贵阳 550004;
2. 贵阳医学院 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵阳 550004)
［摘要］ 目的:探讨酢浆草水提物对体外培养的成骨细胞增殖、分化和矿化的影响。方法:不同质量浓度酢浆草水提物
(10，100，200 mg·L －1)作用人成骨肉瘤细胞株 SaOS-2 后，MTT法测定细胞增殖情况、磷酸对硝基苯酯(PNPP)法检测碱性磷酸
酶(ALP)活性，酶联免疫吸附法(ELISA)法检测钙离子(Ca2 +)和骨钙素(OTC)的分泌以及用茜素红染色法测定成骨细胞矿化
结节数。结果:与空白组比较，酢浆草水提物能明显促进 SaOS-2 细胞的生长(P ＜ 0. 01) ;ALP 活性呈时间依赖性增加(P ＜
0. 05) ，以 100 mg·L －1剂量组最为显著(P ＜ 0. 01) ;增强了细胞分泌 Ca2 +(P ＜ 0. 05)和 OTC的能力(P ＜ 0. 01) ;并且酢浆草中、
高剂量组可以明显促进矿化结节形成(P ＜ 0. 05)。结论:酢浆草水提物在体外可以促进成骨细胞的增殖、分化和矿化，提示酢
浆草可能具有促进骨形成的能力。
［关键词］ 酢浆草;成骨细胞;增殖;分化;矿化
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2015)01-0117-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2015010117
Effect of Oxalis corniculata on Cell Proliferation and Differentiation Inhuman Osteoblast-like SaOS-2 Cells
LIU Xiao-yan1， DONG Li1， LIU Ting1， LI Jing2， LIU Jun-hong2， XI Xiao-lan1，WANG Yong-lin1*
(1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，School of Pharmacy，Guiyang Medical College，Guiyang
550004，China;2. Engineering Ｒesearch Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and
Traditional Chinese Medicine (Ministry of Education) ，Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China)
［Abstract］ Objective:To investigate in vitro effects of water extract components of Oxalis corniculata on
cell proliferation and differentiation in human osteoblast-like SaOS-2 cells． Method:SaOS-2 cells were treated
with different concentrations (10，100，200 mg·L －1)of water extract components，and then cell proliferation and
alkaline phosphatase (ALP)activity were measured by MTT assay and p-nitrophenyl phosphate (PNPP)method
respectively，secretions of Ca2 +，osteocalcin (OTC) were detected by enzyme-linked immunosorhant assay
(ELISA) ，and osteoblast mineralization nodules were measured by alizarin red staining method． Ｒesult:
Compared with control group，water extract components of O． corniculata significantly promote proliferation of
SaOS-2 cells (P ＜ 0. 01) ，and it can also increase ALP activity in time-dependent manner (P ＜ 0. 05) ，especially
at the concentration of 100 mg·L －1 (P ＜ 0. 01)． Moreover，it can increase secretion of Ca2 + (P ＜ 0. 05)and
OTC (P ＜ 0. 01) ，and significantly promote formation of osteoblast mineralization nodules (P ＜ 0. 05) at high
and medium concentration． Conclusion:Water extract components of O． corniculata can promote proliferation，
differentiation and mineralization of osteoblast． These results suggest that O． corniculata can promote bone
formation．
［Key words］ Oxalis corniculata;osteoblast;proliferation;differentiation;mineralization
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Vol． 21，No． 1
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骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身性骨
量减少，骨显微结构退变，并伴骨脆性增加，骨强度
下降，易于发生骨折的疾病。近年来，OP 已成为威
胁中老年人健康的问题之一［1］。酢浆草是酢浆草
科酢浆草属多年生宿根草本植物。全草均可入药，
其性寒、味酸，归肝、小肠经。具有清热解毒、平肝定
惊、消炎止痛、利湿消肿、凉血散瘀之功效［2］。酢浆
草主要成分为黄酮、β-谷甾醇、胡萝卜苷、草酸、酒石
酸、苹果酸、柠檬酸等，且其干燥草中的总黄酮含量
高达 2. 22%［3-4］，具有较好的抗炎、抗病毒和抑菌作
用。目前，尚未见酢浆草抗骨质疏松作用的相关报
道。而在前期研究中，笔者发现酢浆草水提物可明
显促进成骨细胞的增殖，这意味着酢浆草可影响成
骨细胞的骨形成过程，可能具有抗骨质疏松的潜力。
因此，本实验用酢浆草水提物作用 SaOS-2 细胞，研
究其是否具有诱导成骨细胞分化成熟的功效，为进
一步研究其抗骨质疏松药效研究提供提供理论和实
验依据。
1 材料
1. 1 细胞系 人成骨肉瘤细胞 SaOS-2(购于武汉
博士德科技生物有限公司)。
1. 2 试剂 McCoys 5a培养基(武汉博士德科技生
物有限公司，批号 PYGOO26) ，胎牛血清(FBS，批号
8199549)、胰蛋白酶(批号 1268598)、青霉素-链霉
素(批号 15140-122)均购自 Gibco公司，碱性磷酸酶
(ALP)试剂盒(南京建成生物科技有限公司，批号
A059-2) ，维生素 D3(批号 318A034) ，MTT(批号
410C057) ，Trition X-100(批号 T8200-100) ，(均购自
Solarbio 公司) ，哺乳动物蛋白抽提试剂盒(批号
CW0889) ，BCA 蛋白定量试剂盒(批号 CW0014) ，
(均为中国康为世纪公司) ，人钙离子(Ca2 +)ELISA
试剂盒(批号 E01C1177) ，人骨钙素 ELISA 试剂盒
(批号 10100001) ，(均为上海蓝基公司) ，茜素红
(Sigma公司，批号 WXBB2120V)。
1. 3 仪器 数显立式压力蒸气灭菌器(上海博讯
实业有限公司医疗仪器厂) ，超净工作台(北京东联
哈尔仪器制造有限公司) ，CO2 细胞培养箱(Thermo
scientific公司) ，Allegra 64Ｒ 冷冻高速离心机(美国
Beckman) ，TS-100F 荧光倒置显微镜(日本尼康公
司) ，D680 酶标仪(Bio-Ｒad，中国)。
2 方法
2. 1 酢浆草水提物的制备 取酢浆草 Oxalis
corniculata 药材，加 8 倍量的水，煎煮 3 次，每次 1 h，
药液过滤，合并煎液后浓缩干燥，即得酢浆草水提
物。用 DMSO配置成每 1 mL含 1 g生药量的溶液，
于 － 20 ℃保存备用，实验时用培养基稀释至相应终
浓度(DMSO含量 ＜ 0. 5%)。
2. 2 细胞培养 SaOS-2 细胞用含 10%胎牛血清和
1%青霉素-链霉素的 McCoys 5a 培养基于 37 ℃，
5%CO2 培养箱内培养，每隔 1 天换液 1 次，当细胞
汇合至 80% ～90%时进行传代。
2. 3 细胞增殖检测 以 1 × 104 个 /孔将 SaOS-2 细
胞接种于 96孔板中，培养 24 h后换液(100 μL /孔)。
空白组加入不含药培养基，给药组分别加入含有生药
质量浓度为 1，10，100，200，400，500 mg·L －1酢浆草水
提物的培养液。阳性药组为含 30 mg·L －1维生素 D3
的培养液。每个浓度设 5 个复孔。换液继续培养
48 h或 72 h后，每孔加入 20 μL MTT(5 g·L －1) ，继
续培养 4 h 后弃去培养液。每孔再加入 DMSO 100
μL，用酶标仪在 490 nm 波长处检测各组吸光度
值 A。
2. 4 ALP 活性测定 以 10 × 104 个 /孔将 SaOS-2
细胞接种于 24 孔板中，培养 24 h 后，更换为含药的
培养基，各给药组终质量浓度分别为 10 mg·L －1(低
浓度) ，100 mg·L －1(中浓度) ，200 mg·L －1(高浓度)
的酢浆草水提物。空白组为不含药培养基，阳性药
组为含 30 mg·L －1维生素 D3 的培养液。每组设 5
个复孔。继续培养 48 h 或 72 h 后，吸去上清培养
液，用 PBS液洗涤 2 次，加入 200 μL 0. 1% Triton X-
100，冰浴 10 min。取上清液按 ALP 试剂盒中所述
方法测定 ALP 活性，同时采用 BCA 法测定细胞裂
解液中的蛋白质含量，以计算每克蛋白质中 ALP 的
活性。
2. 5 钙离子(Ca2 +)和骨钙素(OTC)的检测 以
10 × 104 个 /孔将 SaOS-2 细胞接种于 24 孔板中，培
养 24 h后，更换为各组含药培养基。每组设 5 个复
孔。分别在培养 48 h 或 72 h 后，吸去培养液，用
PBS液洗涤 2 次，加入 200 μL哺乳动物蛋白抽提试
剂，冰浴 10 min。取上清液用人钙离子 ELISA 试剂
盒和人骨钙素 ELISA 试剂盒分别测定 Ca2 +及 OTC
含量。
2. 6 成骨细胞矿化结节数测定 以 30 × 104 个 /孔
将 SaOS-2 细胞接种于 24 孔板中，培养 24 h 后，更
换为各组含药培养基，隔天换液，连续观察 14 d。待
形成大量的矿化结节后，吸去上清液，用 PBS 洗涤 2
次，95%乙醇固定 10 min，蒸馏水洗涤 3 次，0. 1%茜
素红-Tris-HcL(pH 8. 3)于 37 ℃染色 30 min，再用蒸
馏水洗涤、干燥，最后于显微镜(400 倍)下观察每个
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孔矿化结节的数目。
2. 7 统计学方法 采用 SPSS 13. 0 统计软件对本
实验数据进行处理，各组数据采用 珋x ± s 表示，利用
单因素方差分析进行组间比较。P ＜ 0. 05 为差异有
统计学意义。
3 结果
3. 1 细胞增殖情况及对 ALP 活性的影响 与空白
组比较，1 mg·L －1的酢浆草给药组细胞增殖活性无
明显变化。10，100，200 mg·L －1的酢浆草给药组细
胞增殖活性显著增高(P ＜ 0. 01)。酢浆草质量浓度
至 400 mg·L －1时，SaOS-2 细胞的增殖被明显抑制
(P ＜ 0. 01) ，随着剂量增大产生一定毒性。故以 10，
100，200 mg·L －1为实验组酢浆草水提物的低、中、高
浓度，见表 1。ALP 检测结果表明，10 mg·L －1酢浆
草作用 48 h 后，SaOS-2 细胞中的 ALP 水平明显上
升(P ＜ 0. 05)。其余各给药组在 48 h 或 72 h 后的
ALP 水平均呈现非常显著的升高(P ＜ 0. 01) ，见
表 1。
表 1 酢浆草水提物对 SaOS-2 细胞增殖及 ALP活性的影响(珋x ± s，n = 5)
Table 1 The effects of water extraction of O． corniculata on the proliferation and ALP activity in human osteoblast-like SaOS-2 cells(珋x ± s，
n = 5)
组别
质量浓度
/mg·L －1
细胞增殖 /% ALP /U·g － 1
48 h 72 h 48 h 72 h
空白 － 100. 0 ± 0. 5 100. 0 ± 0. 3 411. 6 ± 15. 5 647. 5 ± 16. 4
维生素 D3 30 119. 0 ± 0. 82) 122. 9 ± 0. 92) 945. 2 ± 25. 62) 1 495. 4 ± 33. 92)
酢浆草 1 99. 9 ± 0. 8 99. 4 ± 0. 7 － －
10 104. 6 ± 0. 42) 106. 6 ± 0. 42) 495. 8 ± 11. 41) 971. 9 ± 22. 62)
100 112. 9 ± 0. 82) 118. 7 ± 0. 62) 831. 7 ± 20. 82) 1 453. 6 ± 37. 62)
200 108. 4 ± 0. 42) 110. 3 ± 0. 52) 578. 1 ± 16. 22) 1 399. 3 ± 29. 42)
400 94. 5 ± 0. 32) 92. 9 ± 0. 72) － －
500 92. 1 ± 0. 62) 90. 8 ± 0. 52) － －
注:与空白组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01(表 2 ～ 3 同)。
3. 2 钙离子检测 与空白组比较，低、中、高质量浓
度的酢浆草水提物均对成骨细胞钙离子的分泌有非
常明显的促进作用(P ＜ 0. 01) ，见表 2。
表 2 酢浆草水提物对成骨细胞 Ca2 +分泌的影响(珋x ± s，n = 5)
Table 2 The effects of water extraction of O． corniculata on the
Ca2 + secretion in human osteoblast-like SaOS-2 cells(珋x ± s，n = 5)
组别
质量浓度
/mg·L －1
Ca2 + /μg·L －1
48 h 72 h
空白 － 25. 25 ± 1. 47 36. 78 ± 3. 43
维生素 D3 30 181. 37 ± 3. 352) 243. 05 ± 5. 202)
酢浆草 10 82. 22 ± 3. 132) 120. 61 ± 5. 652)
100 172. 95 ± 5. 452) 184. 95 ± 4. 522)
200 131. 27 ± 4. 172) 154. 61 ± 3. 852)
3. 3 骨钙素检测及对成骨细胞矿化结节数目影
响 与空白组比较，酢浆草低质量浓度组对骨钙素
分泌无明显影响，中、高质量浓度组可增加骨钙素的
分泌(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，见表 3。培养 14 d 后，给
药组矿化结节染色结果呈阳性，与空白组比较，低质
量浓度的酢浆草具有增加成骨细胞矿化结节的趋
势。中、高质量浓度组的矿化结节数目及其所占板
底的表面积明显高于空白组(P ＜ 0. 05) ，见表 3，
图 1。
表 3 酢浆草水提物对成骨细胞 OTC 分泌及矿化结节数目的影响
(珋x ± s，n = 5)
Table 3 The effects of water extraction of O． corniculata on the
OTC secretion and the mineralization nodules in human osteoblast-
like SaOS-2 cells(珋x ± s，n = 5)
组别
质量浓度
/mg·L －1
OTC /μg·L －1 矿化结节 /个
48 h 72 h 14 d
空白 － 11. 4 ± 0. 6 15. 6 ± 0. 6 4. 2 ± 0. 6
维生素 D3 30 16. 5 ± 0. 52) 21. 5 ± 0. 42) 9. 6 ± 0. 51)
酢浆草 10 13. 6 ± 0. 7 16. 7 ± 0. 3 －
100 14. 5 ± 0. 81) 19. 2 ± 0. 51) －
200 15. 1 ± 0. 12) 18. 5 ± 0. 52) 8. 9 ± 0. 41)
4 讨论
骨质疏松是严重威胁中老年人健康的常见病和
多发病，给家庭和社会带来沉重的经济负担。骨质
疏松的发病原因主要是由于骨代谢过程中骨转换的
失衡［5］。成骨细胞和破骨细胞是骨形成与骨重建
过程中两种功能相反却又互相依存的细胞，成骨细
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A．体外培养 3 d后的成骨细胞;细胞成骨诱导培养 14 d后，钙结节
茜素红染色后细胞中出现橘红色矿化结节:B． 空白组;C． 维生素
D3 30 mg·L －1组;D． 酢浆草 10 mg·L －1组;E. 酢浆草 100 mg·L －1
组;F. 酢浆草 200 mg·L －1组
图 1 SaOS-2 细胞形态及成骨诱导(× 400)
Fig． 1 Morphology of SaOS-2 cell as well as osteogenic induction(×
400)
胞数量不足或活力低下，不能有效地填充因破骨细
胞骨吸收而形成的空腔，久之便造成骨质疏松［6］。
因此防治骨质疏松症的关键之一是提高成骨细胞的
增殖能力和分化水平。成骨细胞的发育过程分为细
胞增殖、细胞外基质成熟及矿化 3 个阶段。在细胞
增殖阶段，调控细胞周期和生长的基因表达旺盛，同
时分泌细胞外基质;进入细胞外基质成熟阶段后，细
胞中 ALP活性升高。ALP 作为成骨细胞的功能标
记物，其活性的升高是成骨细胞分化的早期标
志［7-9］;在矿化发生阶段，骨钙素表达增加。本文研
究结果发现:酢浆草质量浓度为 10，100，200 mg·
L －1时可促进细胞增殖，1 mg·L －1对细胞增殖无影
响，而 400 mg·L －1时抑制细胞增殖，且随着剂量增
大产生一定细胞毒性。相较于空白组，酢浆草水提
物可显著升高 ALP活性水平，提示酢浆草水提物能
够促进早、中期成骨细胞的分化，并加快其成熟
速度。
有研究报道，Ca2 +浓度的增加会促进成骨细胞
的生长，促进骨保护素的表达，，表明成骨细胞的活
性和成骨细胞内钙离子浓度呈正相关关系［10］。骨
钙素是骨依赖维生素 K蛋白，参与 Ca2 +与羟磷灰石
的结合以及促进骨质矿化过程中不可缺少的必要成
分［11］，其主要生理作用是维持正常骨的矿化速度，
常被视为反映细胞功能活动的重要标志［12-13］。骨
钙素可作为检测成骨细胞的可靠的重要标志之一，
骨更新率越快，骨钙素值越高，反之则越低。矿化结
节的形成是成骨细胞分化的最后阶段，也是成骨细
胞体外成骨的早期标志。本文用酢浆草水提物处理
SaOS-2 细胞，并对其细胞钙含量、骨钙素分泌量和
钙化结节数进行了检测。实验结果发现，酢浆草水
提物可呈一定时间依赖性的促进成骨细胞钙离子和
骨钙素分泌;并且与空白组相比，中、高浓度酢浆草
水提物能促进细胞钙化(P ＜ 0. 05)。
综上所述，我们首次研究了酢浆草水提物对成
骨细胞增殖与分化的作用，发现酢浆草水提物在体
外可以促进成骨细胞的增殖、分化和矿化。这表明
酢浆草水提物中含有促成骨细胞成熟分化的活性物
质，提示酢浆草很可能具有抗骨质疏松的药效。
［参考文献］
［1］ Wang Q，Zhao B，Li C，et al． Decreased proliferation
ability and differentiation potential of mesenchymal stem
cells of osteoporosis rat［J］． Asian Pac J Trop Med，
2014，7(5) :358.
［2］ 丁良，李静，杨慧． 酢浆草提取物体外抗氧化活性研
究［J］．辽宁中医杂志，2011，38(10) :2055-2056.
［3］ 杨红原，赵桂兰，王军宪． 红花酢浆草化学成分的研
究［J］．西北药学杂志，2006，21(4) :156-158.
［4］ 谭萍，赵云婵．黔产酢浆草总黄酮含量的测定及提取
方法研究［J］．山西医药杂志，2006，35(5) :462.
［5］ 许兵，金红婷，刘慧，等．补肾活血颗粒对去势大鼠骨
组织 Wnt /β-Catenin 通路的影响研究［J］． 中华中医
药杂志，2013，28(11) :3400-3404.
［5］ 翟远坤，牛银波，潘亚磊，等．柚皮苷对体外培养乳鼠
颅骨成骨细胞增殖和分化成熟的影响［J］． 中国中药
杂志，2013，38(1) :105-110.
［6］ 崔燎，邹丽宜，刘钰瑜，等．丹参水提物和丹参素促进
成骨细胞活性和防治泼尼松所致大鼠骨质疏松［J］．
中国药理学通报，2004，20(3) :286-291.
［7］ 李大为，秦林林．黄酮类药 Genistei 对原代培养大鼠
成骨细胞增值、分化、钙含量及矿化功能的影响［J］．
中国骨质疏松杂志，2002，8(4) :307-310.
［8］ 郭世绂，罗先正，邱贵兴．骨质疏松基础与临床［M］．
天津:天津科技出版社，2001:384-390.
［9］ 樊秦，赵文君，李应东． 华中五味子含药血清对成骨
细胞增殖分化的影响［J］． 中国实验方剂学杂志，
2009，15(2) :33-35.
［10］ Ma S，Yang Y，Carnes D L，et al． Effects of dissolved
calcium andphosphorous on osteoblast responses［J］．
Oral Implantol，2005，31(2) :61-67.
［11］ 卢建华，王维佳，何昱，等．红曲有效成分对体外培养
成骨细胞增殖分化的影响［J］． 浙江中医药大学学
报，2011，35(4) :552-580.
［12］ Wagner E F． Functions of AP1 (Fos /Jun) in bone
development［J］． Ann Ｒheum Dis，2002，61:40-22.
［13］ 张晓，张国庆，顾伯林，等．丹参对人成骨细胞骨钙素
生成及钙离子浓度的影响［J］．世界科学技术———中
医药现代化，2013，15(2) :274-277.
［责任编辑 聂淑琴］
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