全 文 ：中国医科大学学报 J C}l i n Me d U n iv第 32卷 第 l期 2 ) X (3年 2月
白花前胡及前胡甲素对心肌缺血再灌注大鼠 IL一 6水平
及 FS a、 b ax、 b el一 2蛋白表达的影响
常天辉 , 刘晓阳 △ , 章新华 ,邢军 ,王怀 良
(中国医科大学基础医学院临床药理学教研室 , 辽宁 沈阳 fl 仪旧 l )
【摘要】目的 :研究中药白花前胡及其有效成分对缺血再灌注心肌 IL 石 水平及凋亡相关蛋白表达的影响 。 方
法 : 开胸麻醉大鼠左冠状动脉前降枝经 30 m in 缺血及 120 m in 再灌注 ;放射免疫法测定血清 lL 石 水平 ;免疫组化法
和计算机图像分析系统检测心肌 Fas , bax 及 cb -l2 蛋白表达 ; 苏木精一依红染色法于光镜下观察嗜中性白细胞浸润 。
结果 : 白花前胡粗提物及前胡甲素 ( Pd 一 I。 )在降压和 不影响心 率的情况下 ,减少 IL 石 水平及 Fas , bax , 玩 1一2 蛋白的
表达 ,增加 cb l Z b/ ax 的比率 。 lL 一 水平与 F as , bax , bC -2I 蛋白表达之间呈密切的线性正相关 , 而嗜中性白细胞只有
轻微浸润 。 结论 : 白花前胡及 dP 一 I a 在防治缺血后心肌细胞死亡上显现新靶位 , 原因可能与心肌缺血再灌注期 间机
体 自身调控即早基因 IL 石 , aF s , bax , bd 一 的表达有关 。
【关键词 1 白花前胡 ;前胡 甲素 ;心肌 ;缺血 ;再灌注 ;凋 亡 ; 白介素巧 ;蛋白质类
[ 中图分类号 ] 甩 55 . 5 [文献标识码 ] A l 文章编号 1 0 2 5 5 一 464 6 ( 20 3 )0 1 一 0 0 一 0 3
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缺血后再灌注可诱导肿瘤坏死因子 ( tu m二 ne c -
or s i s fa e ot r
,
NT F
一。 )
、 白介素石 ( i n te r l e u k i n石 , I L -
6 )
、 细胞间粘附分子一 l ( i n t e r e e ll u l a : a d h e s i o n m o l e -
cu le
一】, CI A M 一 l) 等炎性细胞因子基因的表达川 ,而
I收稿日期 ] 2 0 1 一 12 一 2 8
【基金项目 l 卫生部重点基金资助 ( 8 84 02 2 57
△ 药理学专 、1卜硕 l 研究生
这些因子的过度表达在心肌缺血再灌注损伤 ( i s c he -
; n i a
一 r e p e fur
s i o n inj u卿 , I R I ) , 血管壁重筑 , 心衰及心
脏肥大等心功不全中起重要作用 。 最 近的研究显
示 , TN F 也能通过诱发细胞凋亡而造成缺血后的心
肌功能不 良〔’ 〕 ,但 IR I 期间调控这些即早基 因表达
的分子学机制仍不清楚 。
我们以前的研究发现 ,从中药白花前胡提取的
毗喃香豆素成分前胡甲素 ( P d 一 aI ) ,作为一种钙内流
·
2
, 中 国 医 科
阻滞 剂川 和 钾通 道开放 剂 [’] 具有 心肌保 护作
用 s[, 6」。 因此推测 , 该药可能对炎性细胞因子和 凋
亡相关蛋白的表达产生有益影响。 本文重点研究白
花前胡粗制剂及 dP 一aI 对心肌缺血再灌注大鼠血清
IL 石水平和凡 s , b ax , cb l一 蛋白表达的影响 , 以便进
一步探讨其心血管活性和作用机制 。
1 材料与方法
1
.
1 药品与试剂
前胡粗提物 ( B Q , 每克折合 2 . 5 9 生药 ,下同 )
及 dP 一 la ,均由本室从中药白花前胡干燥根中提取分
离 ; ’ 2 5 1一白介素石 放免试剂盒 : 北京 3 01 放免研究中
心生产 ;兔抗大鼠单克隆抗体 (包括 aF s , bc l一 及
b ax 蛋白 ) : S an at C ur z 生物工程公司生产 ; 即用 型链
球菌抗生物素蛋白一生物素 一酶复合物 ( Setr tP 一A vi d i n -
B i o t i n
一 e n z y m e C o m p l e x
,
SA B C ) 免疫组化试剂盒 : 武
汉博士德生物技术公司生产 ;其它药品及试剂为 国
产分析纯 。
1
.
2 实验分组
雄性 W i s t a r 大鼠 4 7 只 , 体重 ( 2 7 4 土 1 6 ) g , 中国
医科大学实验动物部提供 。 按均衡性原则将大鼠随
机分成 10 组 , 即 : ( l) 伪手术组 : 仅穿线不结扎 ; (2) 手
术对照组 : 缺血 3 0 m in ,再灌注 12 0 m i n ,下同 ; (3 ) p d -
al 溶剂对照组 : 聚乙二醇 4 0 , 1 . 0 m F k ;g (4 )阳性药
对照组 , 硝苯地平 s m酬 k ;g (5 ) BQ 低剂量组 0 . 5 岁
kg
,结扎前 3 0 m i n 经十二指肠给药 , 下 同 ; (6 ) BQ 中
剂量组 1 . 0 酬 k g ; (7 ) BQ高剂量组 1 . 5 留 kg ; (8 )p d 一 I a
低剂量组 0 . s m酬 k g ,再灌注同时静注 ,下 同 ; (9 ) P d -
aI 中剂量组 1 . 0 m酬k ;g 叭 P d 一 aI 高剂量组 2 . 0 m扩
k g
。
1
.
3 实验方案
将大鼠禁食过夜后 , 用乌拉坦一氯醛糖麻醉 , 开
胸 ,人工呼吸 ,分离左冠状动脉前降枝并穿线 ,通过
结扎 ( 30 , n in )和松线 ( 12 0 m i n )造成缺血和再灌注
损伤 。 用多导记录仪 ( RM石 0 0 , 日本光电 )监测颈
总动脉血压 ( B p )和心率 ( HR ) 。 再灌注后 12 0 m i n
从右心室腔采血样 , 用放免法测血清 I L 一6 水平 ;剪
取缺血 再灌注损伤区 的部分心 肌 , 迅速冷冻 , 用
o cT 包埋 , 在冰冻切片机上每隔 1 m m 连续切取数
张 7 林m 厚的切片 , 用贴片法将切片粘附于经明胶
防脱片剂处理的载玻片上 。 切片在室温下风干后 ,
用丙 酮 于 室温下 固定 30 m in , 经蒸馏水 冲洗 ( 2
,。 i n x 3 次 ) 、 干燥后冰冻保存 ,分别供 H E 染色 、 F a 、 、
b d 之 和 b ax 蛋白检测用 。
1
.
4 血清 IL 石 测定
大 学 学 报 第 32 卷
在室温下将血 样复融 , 混匀后 4℃ , 3 侧叉〕
r/ m in
,离心 5 m in 。 取上清置于聚苯乙烯试管中 , 按
程序加液 , 放置 24 h ( 4℃ )后加沉淀分离剂 50 闪 ,
充分混匀 ,室温放置 20 m in 后再 4 ℃ , 3 50 r/ m i。 ,
离心 25 m in 。 取上清液 ,在计数仪上测定各标准品
及样本的 cP m 数及样品浓度 。
1
.
5 F a s
,
bax 和 b e l一 的免疫组化检测
切片中内源性过氧化酶的活性用 0 . 5% 过氧化
氢一甲醇溶液孵化 30 m in 来抑制 。 蒸馏水多次冲洗
后 ,加人山羊血清封闭液 , 室温下作用 20 m in , 然后
分别加人 兔抗 大 鼠 Fas , b ax , bc l一 单 克隆抗体
( 3 7℃ , 6 0 m i n ) 和生物素山羊抗兔 Ig G ( 3 7℃ , 20
m in )
, 用 0 . 0 1 m o F L 磷酸缓冲液 冲洗 ( 2 m i n x 3
次 ) 。 接着 ,再用 SA B C 液孵化 , 0 . 01 m 0 F L 磷酸缓
冲液冲洗 ( 5 m in x 4 次 ) 。 用二氨基联苯胺显色 ,苏
木素轻度复染 ,脱水 , 透明 , 最后用中性树胶封片 。
光镜下观察 ,胞膜或胞浆着棕黄或棕色者为阳性表
达 。
1
.
6 计算机图像分析
将 SA B C 法免疫组化切片于光镜下放大 10
倍 ,通过图像分析仪和 m e t a m o印h im a g e a n a ly s i s s y s -
et m 系统软件对每张切片随机选择 10 个视野 ,测定
阳性染色的平均光密度与阳性染色面积百分比 (指
所选择视野中阳性染 色面积与总组织面积的百分
比 ) ,按公式 : 蛋白阳性表达指数 ( p o s i ti v e e x p er s s i v e
i n d e x
,
PE I )
= 平均光密度 x 阳性染色面积百分比
“ l 0()
,计算 p E I 值 。
1
.
7 心肌病理学检测
冰冻切片常规 H E 染色 ,光镜观察 。
1
.
8 统计学处理
所有数据以 见 士 s 表示 ,用 s t a t i s t ie a l a n a l y s i s s y s -
et m ( SA S )软件包行统计学分析 , 多组间比较用单因
素方差分析 , 两组间 比较用 s t u d e n t n e w m a n 一 k e u ls t
检验 ,相关性用简单线性相关分析 , 当 尸 < 0 . 05 时
判为有统计学意义 。
2 结果
2
.
1 B Q 和 p d 一 I a 对 IL石 的影响
两药均可不同程度降低 IL 石 水平 , 其中 BQ低 、
中 、高剂量分别使 IL 石 由手术对照组的 ( 巧 1 . 5 土
17
.
7 ) p岁 m l 降至 ( 1 13 . 7 士 12 . 3 ) p留 m l 、 ( 1 12 . 3 土
4
.
8 ) p岁m l 和 ( 10 7 . 9 土 8 . 1 ) p以 : n l ( p 均 < 0 . 0 1 ) 。
p d
一
I a 3 组分别降至 ( 1 2 8 . 5 土 18 . 4 ) p群 lnI ( p >
0
.
0 5 )
、
( 1 19
.
7 土 15
.
7 ) p扩m l 和 ( 1 1 6 . 1 士 10 . 5 ) p酬
m l( 尸均 < 0 . 0 5 ) 。 两药与硝苯地平比较作用相近 ,
第 l期 常天辉等 .白花前胡及前胡甲素对心肌缺血再灌注大鼠I L石 水平及a Fs、 ba x、c b l一 蛋白表达的影响 · 3·
但三者之间比较却无显著差异 (表 1)。 别使c b l一 / ba x由手术对照组的 ( 0. %士 0. 1) 1提高
2
.
B 2Q 和d P一I a 对a Fs, b ax , b e l一 蛋白表达的影响 到 ( 1 . 16 土 0 . 24 ) 、 ( 1 . 2 9 士 0 . 0 9 )和 ( 1 . 4 8 士 0 . 2 1 ) ,
两药均能抑制 F a s , b ax , bc l 一2 的表达 , 提高 bc l 一 尸 < 0 . 01 。 同样 , Pd 一 aI 3 组提高到 ( 1 . 1 6 土 0 . 17 ) 、
2 / bax 的表达比率 ,例如 BQ低 、 中 、高 3 个剂量组分 ( 1 . 2 8 土 0 . 2 3 )和 ( 1 . 2 8 士 0 . 2 3 ) , p < 0 . 0 5 一 0 . 0 1 (后
表 1 白花前胡粗提物及前胡甲素对缺血再灌注麻醉开胸大鼠血清 IL 石 水平和心肌 F as , bax , cb -l2 蛋白表达的影响
( 牙 土 : )
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s e ur m IL一 vle el an d aF s , b ax , bC I一 p or t e i n e x p er s s io n d u ir 雌 m y oc 耐 i al i s e h e m ia 一er p e而 s io n
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n o声 n 一 e h e s t ane s th e t i z e d ar t s ( 无 士 5 )
组 别 阳性表达指数 (% ) bc l一 / b a x剂量
( m『k - ( p扩m l )
伪手术组
硝苯地平
白花前胡
前胡甲素
5
.
0
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0
.
5
1
.
0
2
.
0
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.
3 士 5 . 6 3 ) , 5 )
1 5 1
.
5 士 17 . 7 皿)
巧2 . 7 土 1 5 . 0 1 )
12 3
.
6 土 18 . 6 3 ) , 5 )
1 13
.
7 土 12 . 3 4 )
1 12
.
3 士 4 . 8 4 )
10 7
.
9 士 8 . 14 )
12 8
.
5 士 18 . 4
1 19
.
7 士 15
.
7 3 )
·
5 )
1 16
.
1 士 10
.
5 3 )
·
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1
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8 8 土 0 . 4 9 4 ) , 6 )
6
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9 6 士 2 . 3 9 4 )
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7 1 士 1
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3
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2
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3
.
6 3 土 0 . 5 8 4
4
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3 3 士 1 . 09 2
3
.
8 9 土 0 . 74 3
3
.
6 3 士 0 . 34 4
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16 土 0 . 9 2
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35 土 0 . 1 1 4 ) · 6 )
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1
.
1 6 士 0 24
1
.
2 9 土 0 . 0
1
.
4 8 土 0 , 2 1 4 )
1
.
16 土 0 . 17
1
.
2 8 土 0 . 2 3 3 ) · 6 )
1
.
4 2 士 0 .肠 4 ) , 6 )
注 :与伪手术组比较 , 1) 尸 < 0 . 05 , 2) p < 0 . 01 ;与手术组比较 , 3) 尸 < 0 . 05 , 4 ) 尸 < 0 . 01 ;与溶剂组 比较 , 5) 尸 < 0 . 05 , 6) p < 0 . 01
两组 ) ,但与硝苯地平比较 ,作用稍弱 (表 l ) 。
2
.
3 IL 石 与 aF s , bc l一 , b ax 的相关性分析
血清 IL 石水平与心肌 aF s , b ax , cb l 一2 表达的相
关性分析表明 ,三者之间呈密切的线性正相关 ,其相
关系数 ( 厂 ) 分别为 0 . 8 3 24 , 0 . 7 4 2 9 , 0 . 7 4 23 ( 尸 <
0
.
0 1 )
。
2
.
4 BQ及 dP 一 aI 对心肌炎性细胞浸润的影响
BQ及 P d 一 aI 各组均无明显的炎性细胞浸润 , 而
伪手术组 、手术组及溶剂组却大量出现 。
2
.
5 BQ 和 P d 一 aI 对血压和心率的影响
两药对大鼠平均颈动脉压均有不同程度降低 ,
降压作用与硝苯地平相近 , 但对心率的影响与对照
组比较均无明显差异 。
3 讨论
本研究首次证明 , BQ及 P d一 aI 在降压和不影响
心率的情况下 , 可抑制缺血再灌注大鼠血清中 IL 石
的表达水平 ,降低凋亡刺激蛋白 aF s 、 凋亡促进蛋白
b ax 及凋亡抑制蛋白 bc l一 的表达 , 提高 bc l一b/ ax
的比率 , 强度与硝苯地平相近 。 另外 ,血清 IL 石 水
平与 aF s , bc l一 , b ax 表达的密切相关性 ,说明两药在
对 IRI 所诱导的心肌细胞凋亡 的调控中起重要作
用 ,也提示它们可能通过抑制某些凋亡相关蛋白表
达来减少炎性细胞浸润和 IRI 的刺激程度 , 这对防
治心肌缺血再灌注损伤无疑是有益的 。
据报道 , IL 石 的释放与心肌中性粒细胞浸润密
切相关 L’ ] , IRI 能引起大鼠血清 IL 石 的高表达 , 而用
贫白细胞血液对缺血心肌再灌注及用 IL 石 单克隆
抗体治疗可缓解 IIR 的发生 , 提示 lL 石 和中性粒细
胞参与了 IRI 过程 。 此外 , IL 石 是 IC A M 一 1 的重要诱
导因子 , 后者能促进中性粒细胞与心肌细胞的粘附 ,
而活性氧 自由基能激活核转录 因子 ( un d ca : fa ct or
K B
,
N F
一 K
)B
,并以氧 自由基为传递信使诱导 IL 石 基
因的表达 ,故推测急性缺血再灌注经由 N F 一 K B 途径
促进中性粒细胞在心肌组织内的聚集与粘附 , 最终
使中性粒细胞通过氧 自由基释放 、微血管阻塞和蛋
白水解酶分泌等机制导致易损区心肌细胞的死亡 。
阻滞 c 扩 ` 内流及开放 A即 敏感钾通道均能缓解缺
血再灌注所引起的胞浆 C a Z 十超载 ,维持细胞内外钙
平衡及线粒体的稳定性 , 从而防止活性氧自由基大
量生成 s1[ 。 已知 BQ及 P d 一 I a 对大鼠氧化还原体系
也产生有益影响 (有抗氧化作用 ) ,故推测它们可能
通过钙拮抗或促 K 于通道开放来抑制氧自由基 的形
成 ,抑制 N F 一` B 激活 , 达到降低缺血再灌注大鼠血
清中 I L石 浓度的作用 。
由于活性氧自由基和 (或 ) 氧化应激是细胞凋
亡的介质 ,经脂质过氧化物而形成 ,故推测两药对缺
血再灌注心肌中凋亡相关蛋 白表达的调控作用还可
能系钙内流拮抗和 (或 ) K 十通道开放 ,抑制 Fas 一 aF s
配体 , 引起线粒体和 ( 或 ) c a Z 十 依赖性细胞凋 亡
.9[ ’ ” 〕所致 ,这也许是其防治 IIR 的机制 。 鉴于 IIR 及
( 下转第 6 页 )
·
6
· 中 国 医 科 大 学 学 报 第 32卷
泛修复损伤的 DNA [g J。 我们 曾经重组并分离 a A k l
基因及其启动子 , 同时进行了人工突变 al k A 基因启
动子及其转录研究 s[, 4〕 。 在 46 个突变株中 ,共发现 3
株 p 一半乳糖昔酶活性超过野生型 的突变株 , 它们分
别为 一科 A* T , 一 2 0 A* C , 和 一 10 T叶 G 。 为我们用
于非血液系统肿瘤化疗和基因治疗提供了抗烷化药
物的基因 。
近来报道 a d a 基因表达的 0 6 一甲基鸟漂吟 一DN A
甲基 转 移 酶 ( 0 6 一m e ht yl 邵 a n i n e 一D N A m e t h y latr n s -
fe ar se )可进一步活化 al k A 基因〔’ ” l , 如果将 a d a 、 alk A
基因重组用 于抗肿瘤化疗的基因治疗会很有意义 ,
为此我们正试图将具有 D N A 广泛修复的基因进行
重组 。
本研究获得的大部分突变株 p 一半乳糖昔酶活性
低于野生型的结果可 以解释 , 但 3 株于启动子上游
区的突变株 卜半乳糖昔酶活性高于野生型 , 还没有
证据解释其原因 。 它们发生在 一 40 区域及 一 20 、 -
10 盒子处 (见图 2 ) 。 发生在上述盒子处的点突变是
有利于 RN A 聚合酶与 DN A 模板结合 , 还是改变模
板电荷影响了 R N A 聚合酶的构象还需进一步研究 。
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本研究有待做进一步的探讨 。
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