全 文 ：鸦葱总黄酮抗乙型肝炎病毒的体外实验研究
谢扬，王静，耿艳梅，曲妍霏，张志，王广树Δ
(吉林大学 药学院，吉林 长春 130021)
资助项目:国家科技重大专项重大新药创制(2013ZX09103002 － 007)
作者简介:谢扬，女，硕士，研究方向:中草药有效成分的研究，E-mail:
13514486691@ 163. com;王广树，通讯作者，男，博士、教授、博士生导师，研究
方向:中草药有效成分的研究，E-mail:wgs@ jlu. edu. cn。
［摘要］ 目的 探讨鸦葱总黄酮对乙型肝炎病毒的体外抑制作用。方法 通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察鸦葱总黄酮对
HepG2. 2. 15 细胞的影响;采用酶联免疫吸咐(ELISA)法检测分析鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞分泌表面抗原(HBsAg)和 E 抗原
(HBeAg)的抑制作用;采用荧光定量 PCＲ 法检测鸦葱总黄酮对乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)的影响。结果 鸦葱总黄酮对
HepG2. 2. 15 细胞的半数毒性浓度(TC50)为 0. 603 mg /mL;鸦葱总黄酮高中低 3 个无毒剂量(0. 062、0. 125、0. 250 mg /mL)均能明显降
低 HepG2. 2. 15 细胞培养液中 HBsAg、HBeAg的含量和 HBV-DNA数量，最大抑制率分别为 89%、33%及 43%。结论 鸦葱总黄酮具
有显著的抗乙型肝炎病毒作用。
［关键词］ 鸦葱;黄酮;乙型肝炎病毒
［中图分类号］ Ｒ944. 9 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005 － 1678(2015)08 － 0041 － 04
Experimental studies on inhibitory effects of total flavonoids in
Scorzonera austriaca wild on hepatitis B virus in vitro
XIE Yang，WANG Jing，GENG Yan-mei，QU Yan-fei，ZHANG Zhi，WANG Guang-shuΔ
(School of Pharmaceutical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China)
［Abstract］ Objective To investigate anti-HBV effect of total flavonoids in Scorzonera austriaca wild (TFSA)in vitro． Methods MTT assay was
used to observe the effect of TFSA on HepG2. 2. 15 cells，ELISA assay was used to detect the inhibition on HBsAg and HBeAg secretion from
HepG2. 2. 15 cells and ＲTFQ-PCＲ assay was used to detect the inhibition rates of HBV-DNA． Ｒesults The TC50 of TFSA on HepG2. 2. 15 cells was
0. 603 mg /mL . TFSA significantly reduced the content of HBsAg and HBeAg and the numbers of HBV-DNA in the HepG2. 2. 15 cell cultural
supernatants under nontoxic concentrations (0. 062，0. 125，0. 250 mg /mL)，and the maximal inhibitory rate was 89%，33% and 43%，respectively．
Conclusion TFSA have anti-HBV effects in vitro．
［Keywords］ Scorzonera austriaca wild;flavonoids;hepatitis B virus
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引
起的一种严重危害人类健康及生命安全的常见重大疾病。其发
病率高，病程长，自身免疫系统发生紊乱，部分患者最终发展为
肝硬化、肝癌，且预后极差［1-3］。全世界有 3. 5 ～ 4. 0 亿乙型肝炎
病毒感染者［4］，其中，每年有近 100 万患者死于 HBV 感染引起
的肝硬化和肝癌［5-6］。在我国有 1. 2 亿多 HBV 感染者，约占全
球感染总数的 1 /3，居世界首位，其中慢性乙型肝炎患者 3000 万
例，我国每年有近 30 万患者死于因乙肝诱发的相关疾病［7-10］。
乙肝给患者家庭、社会造成沉重的经济负担，引发一系列社会问
题，是我国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。因此，寻找和
研究既具有抗病毒又具有保肝作用的有效天然药物，对慢性乙
肝的治疗具有十分重要的临床意义。前期本研究课题组已证实
了鸦葱总黄酮的保肝作用［11］。本实验旨在通过体外抑制 HBV
药物筛选体系 HepG2. 2. 15 细胞，观察鸦葱总黄酮对细胞分泌
HbsAg、HbeAg和 HBV DNA的影响，探讨鸦葱总黄酮的抗乙肝
病毒作用，为鸦葱总黄酮的进一步开发利用提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验原料:鸦葱药材采自于吉林省四平地区，经吉
林大学药学院生药教研室张静敏教授鉴定为鸦葱 Scorzonera
austriaca Wild。
1. 1. 2 细胞株:HepG2. 2. 15 细胞株，复旦大学附属肿瘤医
院提供。
1. 1. 3 主要药品及试剂:D101 型大孔树脂、D4020 型大孔
树脂(天津农药股份有限公司树脂分公司);四季青胎牛血清(杭
州天杭生物科技有限公司);高糖 DMEM 培养液(Gibco USA);
G418、MTT(Sigma 公司);双抗(青链霉素，Hyclone 公司);胰蛋
白酶(Solarbio公司);HBsAg ELISA检测试剂盒、HbeAg ELISA检
测试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司);乙型肝炎病毒核
酸检测试剂盒(上海浩源生物科技有限公司)。
1. 1. 4 实验仪器:TGL-16C 离心机(上海安亭科学仪器
—14—
中国生化药物杂志 2015 年第 8 期 总第 35 卷 基础研究
厂);DNM-9602 酶标仪(北京普朗有限公司);二氧化碳培养箱、
无菌超净台(上海新苗医疗器械制造有限公司);37XB倒置显微
镜(上海光学仪器五厂);ABI 7500 荧光定量 PCＲ 仪(美国 ABI
公司);EZbead System-32 核酸提取仪(Texas Biogene，Inc.)。
1. 2 方法
1. 2. 1 鸦葱总黄酮(total flavonoids in Scorzonera austriaca
Wild，TFSA)的制备［11］:鸦葱全草，用 70%的乙醇浸泡，减压回收
乙醇，然后上 D-101 大孔树脂色谱柱，用水、60%的乙醇溶液洗
脱，收集 60%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得鸦葱粗制黄酮
提取物。将粗制总黄酮上样到 D4020 大孔树脂色谱柱上，依次
用水、5%乙醇、10%乙醇、30%乙醇洗脱，薄层色谱板检测，收集
含有黄酮部分的洗脱液，减压浓缩，干燥，得到精制鸦葱总黄酮。
1. 2. 2 鸦葱总黄酮的细胞毒性实验:用胰酶消化
HepG2. 2. 15 细胞，轻轻吹打分散成单个细胞悬液，用含 10%胎
牛血清的 DMEM 培养液配成细胞浓度为 5 × 105 个 /mL 的细胞
悬液，按每孔 0. 1 mL分种于 96 孔板，置 37 ℃、饱和湿度、5%CO2
培养箱内培养，待细胞长成单层后每孔加含不同浓度鸦葱总黄
酮培养维持液 0. 1 mL，每个浓度 6 孔。鸦葱总黄酮实验原液以
含 10%胎牛血清、380 μg /mL G418 的 DMEM培养液作系列倍比
稀释，配制成 1. 000、0. 500、0. 250、0. 125、0. 062 mg /mL 5 个浓度
鸦葱总黄酮培养维持液。另设细胞对照组，每孔加 0. 1mL 不含
药液的细胞培养液。将 96 孔板置于 37 ℃、饱和湿度、5% CO2 培
养箱内继续培养，连续培养 3d后，轻轻吸除培养细胞上清液，按
Sargent JM等［12］建立的 MTT法测定鸦葱总黄酮对细胞生长的半
数毒性浓度(TC50):向前述细胞加入 400 μg /mL MTT 0. 1 mL /
孔，置于 37 ℃、饱和湿度、5%CO2 培养箱内孵育 4 h，再每孔加入
100% DMSO 0. 1 mL，37 ℃、5%CO2 培养箱内密闭孵育约 10 min
后，用酶标仪在 490 nm 波长测定各孔 OD 值。TC50细胞破坏率
(%)=(细胞对照组平均 OD值 －给药实验组平均 OD值)/(细
胞对照组平均 OD值 －空白对照组 OD值)× 100%。按照 Ｒeed-
Meuench法［13］计算药物的 TC50 = Antilog［B +(50% － ＜ 50%破
坏率)/(＞ 50% － ＜ 50%破坏率)× C］;A = log ＞ 50%药物浓度，
B = log ＜ 50%药物浓度，C = A － B。
1. 2. 3 培养细胞上清液中 HbsAg、HbeAg、HBV-DNA 的检
测:按照 1. 2. 2 项下，将 HepG2. 2. 15 细胞接种于 96 孔板中，分
为 5 个组，细胞对照组、低剂量鸦葱总黄酮组(0. 062 mg /mL)、
中剂量鸦葱总黄酮组(0. 125 mg /mL)、高剂量鸦葱总黄酮组
(0. 250 mg /mL)、拉米夫定阳性药组(0. 1 mg /mL)。每 3 d更换
一次培养液，同时收集各组 3、6、9 d 后培养板中细胞上清液。
按照 ELISA试剂盒检测说明书操作，酶标仪读取各组 OD450值，
计算鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞上清液中 HBsAg、HBeAg
的抗原表达抑制率。按乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒说明书
操作，采用荧光定量 PCＲ 的方法检测各组病毒数量，计算鸦葱
总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞培养液中 3、6、9d 的 HBV-DNA 病
毒抑制率。
1. 3 统计学方法 用 SPSS 20. 0 统计学软件分析，正态计
量数据均以“x ± s”表示，组间两两比较采用 t 检验，以P ＜ 0. 05
为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞的毒性作用 MTT染
色法结果显示:在 0. 250 mg /mL及以下浓度下对 HepG2. 2. 15 细
胞无毒性作用。鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞的 TC50为 0. 603
mg /mL。见表 1。
表 1 鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞的毒性作用(n = 6)
Tab. 1 Cytotoxicity of TFSA on HepG2. 2. 15(n = 6)
组别
浓度 S
(mg /mL)
A值
(x ± s)
细胞破坏率
(%)
TC50
(mg /mL)
空白对照 — 0. 001 ± 0. 001 — —
细胞对照 — 3. 033 ± 0. 163 — —
鸦葱总黄酮 0. 062 3. 141 ± 0. 134 0 0. 603
0. 125 3. 139 ± 0. 172 0
0. 250 3. 148 ± 0. 188 0
0. 500 1. 901 ± 0. 212 37
1. 000 0. 428 ± 0. 042 86
2. 2 鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞上清培养液中
HBsAg、HBeAg、HBV-DNA 的影响 ELISA 结果显示:0. 250 mg /
mL鸦葱总黄酮处理 HepG2. 2. 15 细胞 9 d，对 HBsAg的抑制率为
89%，处理 HepG2. 2. 15 细胞 bd对 HBeAg的抑制率为 33%。见
表 2、表 3。荧光定量 PCＲ结果显示:0. 125 mg /mL鸦葱总黄酮处
理 HepG2. 2H15 细胞 3 d 对 HBV-DNA 的抑制率为 43%。见
表 4。
表 2 鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞分泌 HBsAg的抑制作用(x ± s，n = 6)
Tab. 2 Inhibitory effect of TFSA on HBsAg secreted by HepG2. 2. 15 cell(x ± s，n = 6)
组别
浓度
(mg /mL)
3 d
A值 抑制率(%)
6 d
A值 抑制率(%)
9 d
A值 抑制率(%)
对照组 — 0. 214 ± 0. 018 — 0. 211 ± 0. 018 — 0. 328 ± 0. 019 —
3-TC 0. 100 0. 085 ± 0. 035* 60 0. 112 ± 0. 028* 47 0. 083 ± 0. 012* 75
鸦葱总黄酮 0. 062 0. 148 ± 0. 020* 31 0. 164 ± 0. 022* 22 0. 124 ± 0. 012* 62
0. 125 0. 064 ± 0. 028* 70 0. 150 ± 0. 010* 29 0. 119 ± 0. 021* 64
0. 250 0. 037 ± 0. 013* 83 0. 133 ± 0. 028* 37 0. 037 ± 0. 011* 89
* P ＜ 0. 01，与对照组比较，compared with control group
—24—
基础研究 中国生化药物杂志 2015 年第 8 期 总第 35 卷
表 3 鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞分泌 HBeAg的抑制作用(x ± s，n = 6)
Tab. 3 Inhibitory effect of TFSA on HBeAg secreted by HepG2. 2. 15 cell(x ± s，n = 6)
组别
浓度
(mg /mL)
3 d
A值 抑制率(%)
6 d
A值 抑制率(%)
9 d
A值 抑制率(%)
对照组 — 2. 225 ± 0. 158 — 2. 730 ± 0. 329 — 1. 818 ± 0. 073 —
3-TC 0. 100 1. 764 ± 0. 113* 21 1. 558 ± 0. 387* 43 1. 564 ± 0. 053* 14
0. 062 2. 070 ± 0. 093 7 2. 067 ± 0. 203* 24 1. 559 ± 0. 121* 14
鸦葱总黄酮 0. 125 1. 620 ± 0. 218* 27 2. 038 ± 0. 184* 25 1. 487 ± 0. 103* 18
0. 250 1. 588 ± 0. 122* 29 1. 830 ± 0. 191* 33 1. 447 ± 0. 054* 20
* P ＜ 0. 01，与对照组比较，compared with control group
表 4 鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞分泌 HBV-DNA的抑制作用(x ± s，n = 6)
Tab. 4 Inhibitory effect of TFSA on HBV-DNA secreted by HepG2. 2. 15 cells(x ± s，n = 6)
组别
浓度
(mg /mL)
3 d
病毒数量
(× 105 IU /mL)
抑制率
(%)
6 d
病毒数量
(× 105 IU /mL)
抑制率
(%)
9 d
病毒数量
(× 105 IU /mL)
抑制率
(%)
对照组 — 2. 972 ± 0. 012 — 4. 418 ± 0. 011 — 8. 722 ± 0. 054 —
3-TC 0. 100 1. 293 ± 0. 009* 56 0. 833 ± 0. 007* 81 0. 584 ± 0. 045* 93
0. 062 2. 309 ± 0. 013* 22 3. 782 ± 0. 014* 14 8. 088 ± 0. 048* 8
鸦葱总黄酮组 0. 125 1. 687 ± 0. 008* 43 2. 565 ± 0. 009* 42 5. 798 ± 0. 047* 34
0. 250 1. 936 ± 0. 014* 35 2. 856 ± 0. 012* 35 6. 596 ± 0. 051* 24
* P ＜ 0. 01，与对照组比较，compared with control group
3 讨论
HepG2. 2. 15 细胞株系以重组载体 pDolTHBV-1(含 2 个
HBV头对尾二聚体，以尾对尾方向串联)转染人肝癌细胞株
HepG2，经 G418 筛选后获得的一个表达高水平 HBsAg、HBeAg
的细胞克隆［14］，由美国 The Mount Sinai Medical Center 于 1986
年建立［16］，并且已成功地应用于抗 HBV 药物的筛选［16-17］，作为
抗 HBV 作用的指标，被中国卫生部收载于治疗肝炎的《中药新
药药效学研究指南》［18］。乙型肝炎感染的血清标志物包括 HBV
DNA、HBsAg、HBeAg，特别是 HBV DNA 水平的监测已成为抗
HBV治疗的评价标准［19］。因此，本实验选用 HepG2. 2. 15 细胞
作为细胞模型，以 HBV DNA、HBsAg、HBeAg为指标，研究鸦葱总
黄酮的抗乙肝病毒作用。
本实验首先通过 MTT 染色法，检测鸦葱总黄酮对
HepG2. 2. 15 细胞的毒性作用，结果发现 TC50为 0. 603 mg /
mL，在 0. 250 mg /mL及以下浓度下对 HepG2. 2. 15 细胞没有
毒性作用。然后在无毒浓度下进行药物干预培养。利用
HBsAg、HBeAg ELISA 试 剂 盒，检 测 鸦 葱 总 黄 酮 对
HepG2. 2. 15 细胞分泌 HBsAg、HbeAg 的抑制作用。结果表
明，鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞分泌 HBsAg、HBeAg 有显
著的抑制作用(P ＜ 0. 01)，且抑制率随着鸦葱总黄酮浓度的
升高而增大，呈良好的剂量依赖关系。荧光定量 PCＲ 法结果
表明，鸦葱总黄酮对 HepG2. 2. 15 细胞上清培养液中 HBV-
DNA 的含量有显著降低体用(P ＜ 0. 01)，其中 0. 125 mg /mL
浓度的鸦葱总黄酮干预细胞培养第 3 天后抑制率最大，达到
43%，说明鸦葱总黄酮具有抗乙肝病毒作用。因此鸦葱总黄
酮有望成为治疗慢性乙型肝炎候选药物。本研究为开发抗
乙肝病毒药物提供了实验基础。
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(下转第 47 页)
—34—
中国生化药物杂志 2015 年第 8 期 总第 35 卷 基础研究
3 讨论
大鲵皮肤黏液含有的丰富的药理活性成分，是天然药用资
源开发的宝库。本实验通过柱色谱法对大鲵皮肤黏液糖蛋白样
品进行分离纯化，最终得到一种分子量约为 30 kDa 单一组分的
糖蛋白。
将所得黏液糖蛋白样品利用 MTT 比色法对 A549 肺癌细胞
的活性检测表明，黏液糖蛋白具有良好的抗肺癌活性的作用。
随样品浓度从 1、10、20、40 μg /mL 的增加，黏液糖蛋白对 A549
细胞的增殖抑制作用明显增大，其增殖抑制作用与阳性对照组
比较差异显著(P ＜ 0. 05)，且大鲵黏液糖蛋白对 A549 细胞的抑
制作用，在一定浓度范围内有时间依赖性。大鲵黏液糖蛋白的
抗肺癌细胞作用，可为抗肺癌药物的开发提供理论依据。
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中国生化药物杂志 2015 年第 8 期 总第 35 卷 基础研究