全 文 : 收稿日期:2010-04-25
基金项目:新疆兵团科技攻关计划项目(2008 GG34), 科技人员服务企业行动项目(SQ2009GJG4101543), 新疆兵团科技支
疆计划项目(2008ZJ14)
作者简介:张瑜(1985-), 女 ,硕士生 , 专业方向为药物新制剂与新剂型。
通讯作者:陈文(1967-), 男 ,教授 , 从事药物新剂型的研究;e-mail:cw pha@shzu.edu.cn。
第 29卷 第 2期
2011年 4月
石河子大学学报(自然科学版)
Journal of Shihezi University(Natural Science)
Vol.29 No.2
Apr.2011
文章编号:1007-7383(2011)02-0205-05
刺山柑多糖提取及其抗炎镇痛作用研究
张瑜 ,张华 ,韩博 ,陈文
(石河子大学药学院/新疆特种植物药资源省部共建重点实验室 ,石河子 832002)
摘要:本文主要目的是测定刺山柑中多糖的含量并研究其抗炎镇痛活性。采用水提醇沉法提取多糖 ,用 Sevage 法
除蛋白 、双氧水脱色 , 并用透析法富集多糖 ,用苯酚-硫酸显色法测定多糖含量。建立二甲苯致小鼠耳肿胀试验模
型 ,观察多糖的抗炎作用;通过醋酸致小鼠扭体试验和热板试验 , 观察多糖的镇痛作用。经测定 , 纯化后刺山柑多
糖的含量达 36.86%;多糖外敷给药对小鼠耳肿胀的抑制率为 71.6%;热板镇痛抑制率为 50.1%;扭体反应抑制率
为 44.4%。本文建立的测定多糖含量的方法简便 、准确 、重现复好;且刺山柑多糖对急性炎症有明显的抑制作用 ,
对热和化学刺激引起的疼痛具有一定的抑制作用。
关键词:刺山柑;多糖;含量测定;抗炎镇痛
中图分类号:R971 +.1 文献标识码:A
Research on the Extraction of Polysaccharides in Capparis spinosa L.and
anti-inflammatory and Analgesic Effects
ZHANG Yu ,ZHANG Hua ,HAN Bo , CHEN Wen
(Co llege of Pharmacy Shihezi Univer sity/ Key Labo rato ry o f Phy tomedicine Resour ce s
Modernization o f TCM , Shihezi Univer sity , Shihezi 832002 , China)
Abstract:The aim o f this paper is to determine the content of po ly saccharides in Cap paris spinosa L.and the anti-inflamma to ry
and ana lge sic effects of polysacchar ide s.The po ly saccharides we re ext racted by wa ter and precipitated by alcoho l , using sevage
to deprotein and dio xogen to deco lo r , using dialy sis to enrich the po ly saccharides and heno l-sulphuric acid colorimetry to deter-
mine the content o f poly saccharides.Xy lene-induced mouse ea r edema model w as established to obse rve the anti-inflamma to ry
effect;ace tic acid-induced w rithing and ho t-plate methods were used to observe the analg esic effec ts.The poly saccharides con-
tent reached to 36.86% af te r purification;the inhibition rate o f auris sw elling s model in mice , hot-pla te test and body conto rtion
were 71.6%, 50.1% and 44.4% respectiv ely.The e stablished me thod of a ssaying f or poly saccharides is simple , accura te and re-
peatable.The polysaccha rides in Capparis spinosa L.showed obvious anti-inflammato ry effects on acute inflammator y reactions.
The pains induced by heat and chemical stimulus w ere significantly relieved.
Key words:Cap paris spinosa L.;poly saccharides;content measurement;anti-inflamma tion and analg esia
刺山柑(Capparis spinosa L.)为白花菜科山柑
属植物 ,又名槌果藤 、老鼠瓜 、野西瓜 ,在我国主要分
布在新疆 、甘肃和西藏等地 ,在国外主要分布在地中
海湾地区 。刺山柑是维吾尔医常用药材 ,具有清除
体内异常体液 、消肿止痛 、祛风 、散寒 、除湿 、畅通阻
滞等功效 。临床主要用于痛风 、风湿性关节炎等骨
关节疾病的治疗 。在土耳其 、印度及中东地区作为
一种传统的草药用于滋补 、抗炎 、抗高血压 、降血糖 、
痛风 、化痰 、驱虫 、利尿 、通便等[ 1-3] 。
刺山柑显著的抗风湿疗效 ,引起人们极大的研
究兴趣 。目前 ,国内外对刺山柑化学成分的研究较
多[ 4-7] ,但究竟是何物质在发挥抗炎镇痛活性尚未可
知。高莹莹等[ 8] 研究了刺山柑醇提液具有抗炎镇痛
作用 ,但其抗炎镇痛活性部位尚不明确 。文献[ 9]报
道 ,植物绿舒筋中的多糖具有抗炎镇痛作用 ,且国内
外未见有关刺山柑中多糖的药理活性报道 ,故本文
对刺山柑中的多糖进行研究 ,期望能够为其治疗风
湿寻找到突破口 。
本文对刺山柑多糖进行了提取及含量测定 ,并
对多糖液 、水提液及醇沉液进行了抗炎镇痛药效比
较。观察上述各部分提取物药效差别 ,试图寻找抗
风湿的活性部位 ,从而为刺山柑多糖的作用机制及
其它潜在的药理作用提供基础实验数据 ,最终为将
刺山柑开发成药用制剂服务。
1 材料与方法
1.1 材料
刺山柑干燥果实 ,购买于石河子济仁堂药店 ,经
石河子大学中药鉴定教研室成玉怀教授鉴定为白花
菜科山柑属植物刺山柑(Capparis spinosa L.),标本
保存于石河子大学药学院。昆明种小鼠(20 ±2)g ,
由石河子大学动物饲养中心提供。TP-300型超声波
清洗器(北京天鹏新技术公司)、电子天平(美国奥豪
斯科技有限公司)、透析袋(美国联合碳化物公司 ,相
对分子截留量 10000)、UV-2401紫外分光光谱仪(日
本岛津)、6 mm 打孔器 、智能热板仪(成都泰盟科技有
限公司)。阴性对照液(0.5%CMC-Na)、双氯芬酸二
乙胺乳胶剂(北京诺华制药有限公司)、多糖液(自
制)、水提液(自制)、醇沉液(自制)、美肤脱毛膏。冰
醋酸 、二甲苯等试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 刺山柑多糖的提取
通过单因素试验确定的最佳方案为:称取过 20
目筛的刺山柑粉末 50.0 g ,用 95%乙醇超声提取 3
次 ,物料比分别为 1∶10 、1∶10 、1∶8 ,提取时间分别
为 40 、30 、20 min。过滤 ,合并滤液 ,弃去。滤渣在
干燥箱内(50 ℃)挥干溶剂 ,称得干燥滤渣 38 .4 g 。
滤渣用水超声提取 3次 ,物料比为1∶10 、1∶10 、1∶8 ,
提取时间分别为 40 、30 、20 min 。用纱布滤过 ,收集
滤液 ,得棕黄色的水取液。将提取液减压浓缩至
166 mL ,加入 95%乙醇调节其浓度至 80 %, 4 ℃冰
箱放置 48 h。抽滤 ,沉淀物依次用适量的无水乙
醇 、丙酮和石油醚抽洗 ,置于干燥箱内(50 ℃)干燥 ,
得灰白色的刺山柑粗多糖 4 .9 g ,得率为 9 .8%。
1.2.2 粗多糖的纯化
将制得的粗多糖 4.9 g 溶于 100 mL 水中 , 加
入 40 mL Sevage液(氯仿∶正丁醇 =4∶1),剧烈振
荡 5 min后 ,5000 r/min离心 10 min。除去蛋白及
有机相 ,剩余水相重复操作 5 次。除蛋白后的多糖
溶液浓缩至 50 mL ,加入 50 mL 10%的 H2O 2溶液 ,
置 4℃冰箱中放置 48 h脱色 。将脱色后的多糖溶液
装入处理好的透析袋(截留相对分子质量 10000),
用流动的蒸馏水透析 72 h ,检测无低聚糖为止。将
透析过的多糖液经 60℃减压浓缩至 25 mL ,待自然
冷却后加入 95 %的乙醇调节其浓度为 80 %,得精制
后的多糖 0.78 g ,得率为 1.56%。
1.2.3 多糖的含量测定
对照品溶液的配制:称取 105℃下干燥至恒重
的无水葡萄糖对照品约 0.10 g ,精密称定。置 250
mL 容量瓶中 ,加水溶解并稀释至刻度 ,摇匀 。即得
416.40 μg/mL 的葡萄糖对照品溶液备用 。
苯酚溶液的配制:称取苯酚 100.0 g ,加铝片
0.1 g ,和碳酸氢钠 0.05 g ,常压蒸馏 ,收集(180 ±
2)℃馏分。取馏分 6.0 g ,用蒸馏水定容至 100 mL
容量瓶中 ,得 6 .0%的苯酚溶液 。
含量测定方法:精密移取对照品溶液 2.0 mL
至具塞试管中 ,加入 1 .0 mL 6%的苯酚溶液摇匀 ,
垂直悬空加入 5.0 mL 浓硫酸 ,室温下放置 20 min ,
取 2.0 mL 的蒸馏水同法做空白。
最大吸收波长及显色时间的考察:在紫外分光光
度计 400~ 800 nm范围内进行扫描 ,确定最大吸收波
长在 489 nm处 ,取葡萄糖对照品溶液按含量测定项下
的方法 ,每隔 10 min测定 1次 ,吸光度在 50 min内稳
定。
标准曲线的制备:精密移葡萄糖取对照品溶液
1.2 、2.0 、2.8 、3.6 、4.4 、5 .2 、6.0 mL ,蒸馏水定容至
50 mL 容量瓶中 ,摇匀 。分别从各容量瓶中精密移
取 2.0 mL 至具塞试管中 ,按含量测定方法项下测
定多糖含量 , 以葡萄糖浓度(C)为横坐标 ,吸光度
(A)为纵坐标 ,进行线性回归 。
稳定性:精密移取稀释至一定浓度的刺山柑粗
多糖溶液 ,分别于 0 、2 、4 、6 、8 、10 h ,测定其吸光度 。
重复性:精密移取稀释至一定浓度的刺山柑粗
多糖溶液 ,按照含量测定项下的方法测定多糖含量 ,
连续测定 6份。
加样回收率:向 9只试管中分别加入 1 .0mL 的
样品液(含多糖 20.24 μg),再依次加入高 、中 、低剂
量的葡萄糖对照品溶液 1.0 mL ,各剂量平行做 3
份 。按照含量测定项下的方法测定含量。
样品的测定:精密移取稀释后的粗多糖溶液及
206 石河子大学学报(自然科学版) 第 29 卷
透析后的多糖溶液各 2.0 mL ,按照含量测定的方法
重复测定 3次 ,求粗多糖及精制多糖中多糖含量。
1.2.4 刺山柑多糖对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
选取(20±2)g 小鼠 60只 ,随机分为 5组 ,雌雄
各半 ,每组 12 只。第一组:0.5% CMC-Na 为阴性
对照组;第二组:双氯芬酸二乙胺乳胶剂(扶他林)为
阳性对照组;第三组:多糖液组(1 mL 相当于 0.8 g
生药);第四组:水提液组(1 mL 相当于 0.8 g 生
药);第五组:醇沉液组(1 mL 相当于 0.8 g 生药)。
各组小鼠右耳两面涂抹药液(0.1 mL/耳), 1 h后用
蒸馏水洗去药液用干棉球擦净 ,再将每组动物右耳
两面涂 0.02 mL 二甲苯致炎 。致炎 1 h后 ,将动物
颈椎脱臼致死 ,沿耳廓基线剪下两耳 ,用直径 6 mm
打孔器分别在两耳同一部位打下圆耳片 ,用分析天
平称重。右耳片减去左耳片的重量即为肿胀度[ 10] 。
计算各组小鼠耳肿胀度 ,肿胀抑制率(%)经方差分
析做 q检验 ,比较给药组和对照组的差异情况 。
抑制率=
对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度对照组平均肿胀度 ×100 %。
1.2.5 刺山柑多糖对热刺激小鼠痛阈值的影响
动物实验前筛选:将小鼠 , ♀,放在预热至 50℃
的金属板上 ,恒温 ,以小鼠舔后足反应为痛阈指标 ,将
反应潜伏期小于 5 s或者大于 30 s的小鼠剔除[ 11] 。
将筛选合格的小鼠 , ♀,随机分为 5组 ,每组 12
只。第一组:0.5% CMC-N a ,为阴性对照组;第二
组:双氯芬酸二乙胺乳胶剂(扶他林)为阳性对照组;
第三组:多糖液组(1 mL 相当于 0 .8 g 生药);第四
组:水提液组(1 mL 相当于 0.8 g 生药);第五组:醇
沉液组(1 mL 相当于 0 .8 g 生药)。逐只置于热板
仪上测试给药前的痛阈值 2次 ,取其平均值作为基
础痛阈值 。将小鼠四足涂抹药液(0.05 mL/足),分
别于给药 1 、2 、3 h后测定痛阈值 ,超出 60 s按 60 s
计 。计算镇痛百分率(%)经方差分析做 q检验 ,比
较给药组与对照组的差异情况。
镇痛百分率=
用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值
用药前平均痛阈值 ×100%。
1.2.6 刺山柑多糖对醋酸诱发小鼠扭体反应的影响
选取(20±2)g 的小鼠 60只 ,雌雄各半 ,随机分
为 5 组 ,每组 12只 。第一组:0.5%CMC-Na 为阴
性对照组;第二组:双氯芬酸二乙胺乳胶剂(扶他林)
为阳性对照组;第三组:多糖液组(1 mL 相当于
0.8 g 生药);第四组:水提液组(1 mL 相当于
0.8 g生药);第五组:醇沉液组(1 mL相当于0.8 g生
药)。实验前 12小时 ,用脱毛膏将小鼠腹毛脱掉 ,露
出光滑的皮肤。各组外敷给药 0.25 mL/只 ,2次。1
h后 ,每组按 0.1 mL/10 g 腹腔注射新配制的 0.6%
的冰醋酸。注射后即开始计时 ,前 3 min为反应潜伏
期扭体次数不计 ,3 min后开始计算扭体次数 ,持续记
录 15 min ,得出 15 min内的扭体次数[ 12] 。计算抑制
率(%)经方差分析做 q检验 ,比较各组和对照组的差
异情况 。
抑制率=
生理盐水组扭体均数-试药组扭体均数
生理盐水组扭体均数 ×100%。
2 结果与分析
2.1 方法学考察结果
标准曲线的回归方程为:A=0.0175C-0.0231 , r
=0.9994。葡萄糖浓度在 9.99 μg/mL ~ 49.97 μg/
mL 范围内时 ,浓度与吸光度呈良好的线性关系。
稳定性:RSD 为 0.61%(n =6),且吸光度在 10
h内稳定 。
重复性:RSD 为 1 .7%(n =6),证明本法具有
良好的重复性。加样回收率实验结果见表 1 。
表 1 回收率实验结果 n=9
Tab.1 Consequence of coefficient of recovery n=9
试管号 加入葡萄糖的量/μg 样品中葡萄糖含量/μg 实验测得多糖量/μg 回收率/ % 平均回收率/ % RSD/ %
1 16.00 20.24 35.49 95.29
2 16.00 20.24 35.58 95.86
3 16.00 20.24 35.47 95.21
4 20.00 20.24 39.94 98.51
5 20.00 20.24 39.62 96.91 97.21 1.70
6 20.00 20.24 39.60 96.80
7 24.00 20.24 44.37 100.52
8 24.00 20.24 43.79 98.14
9 24.00 20.24 43.69 97.71
207 第 2 期 张瑜 ,等:刺山柑多糖提取及其抗炎镇痛作用研究
样品含量测定:粗多糖及精制多糖中多糖的含
量分别为 14 .38%、36 .86%。
2.2 刺山柑多糖对二甲苯致小鼠耳肿胀实
验结果
由表 2可知 ,致炎后 ,各组小鼠右耳均可见高度
红肿 。刺山柑多糖对二甲苯致小鼠耳肿胀有明显的
抑制作用 ,抑制率可达到 71.6%。水提液及醇沉液
的结果说明将水提液醇沉后去除了杂质 ,药效大大
提高 ,可见多糖有可能为抗炎的活性部位 。
通过重复试验表明 ,阳性药扶他林外敷给药时
抗炎效果很差。研究表明扶他林腹腔注射给药具有
一定的抗炎作用[ 9] 。本实验给药方式为外敷 ,可能
对其药效发挥有影响 ,但其根本原因有待进一步研
究 。建议以后抗炎实验采用外敷给药时 ,可不选取
扶他林做阳性药。
表 2 刺山柑多糖对二甲苯致小鼠耳肿胀实验结果 X±S , n=12
Tab.2 Inhibitory effects of polysaccharides from Capparis spinosa L.on xylene-induced auris swellings in mice X±S , n=12
组别 动物只数 右耳重/ mg 左耳重/mg 肿胀度/ mg 抑制率/ %
阴性对照 12 9.5±1.19 6.9±0.49 2.6±1.34
扶他林 12 9.0±1.14 6.9±0.47 2.1±1.12 16.0
水提液 12 8.9±1.02 7.1±0.51 1.8±1.12 * 30.4
多糖液 12 9.0±1.06 7.2±1.08 0.7±0.34 * 71.6
醇沉液 12 9.0±2.18 7.2±0.66 1.8±0.86 * 30.4
注:*与阴性对照组比较 P<0.05。
2.3 刺山柑多糖对热刺激小鼠痛阈值实验
结果
由表 3 可知 ,表面结果表明 ,刺山柑水提液 、多
糖液和醇沉液均能提高小鼠热刺激体表的痛阈 ,水
提液的镇痛效果最明显与阳性药扶他林相当。多糖
液及醇沉液也具有一定的镇痛作用 ,但都不及水提
液 ,说明水提液为镇痛活性部位 ,多糖并非镇痛活性
最有效的部位。
表 3 刺山柑多糖对热刺激小鼠痛阈值实验结果 X±S , n=12
Tab.3 Analgesic effects of polysaccharides fromCapparis spinosa L.on the pain threshold of mice in the hot-plate test X±S , n=12
组别 动物只数 基础痛阈值 给药后不同时间(h)的痛阈值/ s
1 2 3
阴性对照 12 20.6±6.9 21.9±10.3 22.6±12.2 20.3±10.7
扶他林 12 20.0±5.2 24.0±5.9 29.0±8.8 * 36.4±14.6 *
(19.9%) (45.2%) (82.1%)
水提液 12 23.3±4.5 28.7±12.2 34.6±14.5* 42.7±17.5 *
(23.1%) (48.4%) (82.9%)
多糖液 12 23.8±5.86 28.1±14.26 33.6±15.64* 35.8±14.26*
(17.9%) (40.9%) (50.1%)
醇沉液 12 23.6±5.5 33.7±15.2 35.6±14.9* 36.5±15.4 *
(42.6%) (50.7%) (54.6%)
注:括号内的值为给药后镇痛百分率 , *与阴性对照组比较 P<0.05。
2.4 刺山柑多糖对醋酸诱发小鼠扭体反应
实验结果
由表 4可知 ,腹腔注射醋酸溶液后 ,各组小鼠均
出现腹部收缩 、躯体扭曲 、后肢伸展及蠕行等扭体反
应 ,水提液对醋酸诱发小鼠扭体反应有明显的抑制
作用 ,刺山柑多糖及醇沉液的效果不及水提液的明
显 ,说明将水提液醇沉后 ,镇痛活性成分有所损失 ,
建议从水提物中继续寻找镇痛的活性成分。
表 4 刺山柑多糖对醋酸诱发小鼠扭体反应实验结果
X±S , n=12
Tab.4 Analgesic effects of polysaccharides fromCapparis spinosa L.
on the acetic-induced writhing inmice X±S , n=12
组别 动物只数 15 min 内扭体数 抑制率/ %
阴性对照 12 40±14
扶他林 12 6±3* 86.3
水提液 12 12±6 * 69.4
多糖液 12 22±9 * 44.4
醇沉液 12 28±14 * 29.2
注:*与阴性对照组比较 P<0.05。
208 石河子大学学报(自然科学版) 第 29 卷
3 讨论
本研究在刺山柑多糖提取过程中 ,除蛋白时多
糖提取液浓度过高会造成多糖的损失 ,因此操作过
程中应注意控制多糖提取液的浓度;双氧水脱色时
室温或更高温度会使双氧水分解 ,导致脱色不彻底 ,
控制温度在 4℃时效果最佳;醇沉时应慢加快搅使
其充分沉淀 ,避免多糖损失。
本文采用苯酚-硫酸显色法测定多糖的含量 ,
此方法简便 、准确 、重复性好 ,是测定刺山柑多糖的
理想方法 。本方法中苯酚必须采用新蒸馏的(180 ±
2)℃的馏分 ,浓硫酸要快速垂直悬空加入 ,显色才够
稳定 ,测得的多糖含量才最高 。
高莹莹等[ 8] 报道的刺山柑醇提液对二甲苯致小
鼠耳肿胀的抑制率为 55.46%;本实验中多糖的抑
制率达到 71 .6%,表明刺山柑多糖具有显著的抗炎
作用 ,可能为刺山柑抗炎的活性部位。对于醋酸诱
发小鼠扭体反应和热板法 ,刺山柑多糖均有一定的
抑制作用 ,但都不及刺山柑水提液的抑制效果明显 ,
说明水提液对物理和化学刺激引起的疼痛均有较好
的抑制作用 。而对于热板法高莹莹等[ 8]研究的醇提
物的抑制率达到 90.7 %,表明醇提液对于物理刺激
引起的疼痛有较好的抑制作用 。本结果初步明确了
刺山柑中抗炎镇痛的活性部位 ,为继续确定活性成
分以及将刺山柑开发成为抗炎镇痛的外用制剂奠定
了基础。
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