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(收稿日期:2015-12-06)
基金项目:天津市高等学校科技发展基金计划项目(20110223)。
糙叶败酱碱对肺癌 SPC-A1 细胞增殖的
影响及机制
孙志欣，张莹
(天津中医药大学第一附属医院，天津 300381)
摘要:目的 观察糙叶败酱碱对肺癌 SPC-A1 细胞增殖的影响，探讨其作用机制。方法 取对数生长期的人肺
腺癌 SPC-A1 细胞，分别加入适量糙叶败酱碱，使其终浓度为 0、5、10、15、20、30、40 μmol /L，继续培养 24、48 h，检测
细胞增殖情况，结果显示糙叶败酱碱呈剂量和时间依赖性抑制细胞增殖，最终选用高于及低于半数抑制浓度的 10、
20 μmol /L糙叶败酱碱处理 48 h进行后续研究。取对数生长期的 SPC-A1 细胞，分别加入 0、10、20 μmol /L 糙叶败
酱碱处理 48 h，通过流式细胞仪检测 G0 /G1、S、G2 /M期细胞百分比及细胞凋亡率，采用荧光实时定量 PCＲ 法检测
p21、p53、Bax、细胞周期蛋白依赖性激酶 1(CDK1)、血管内皮生长因子(VEGF)、Bcl-2 mＲNA 相对表达量，采用
Caspase-3、Caspase-8 活性检测试剂盒检测二者活性(以 OD值表示活性)。结果 与未加糙叶败酱碱(0 μmol /L)细
胞比较，10、20 μmol /L糙叶败酱碱处理的细胞 G0 /G1 期细胞百分比增加，凋亡率增加，p21、p53、Bax mＲNA表达升
高，VEGF、CDK1、Bcl-2 mＲNA表达降低，Caspase-3 和 Caspase-8 活性增加，P 均 ＜ 0． 05。结论 糙叶败酱碱可抑制
肺癌 SPC-A1 细胞增殖，激活 CDK1、p51、p53 等介导的凋亡途径促进细胞凋亡、阻滞细胞周期，可能是其作用机制。
关键词:肺癌;糙叶败酱碱;细胞增殖;细胞凋亡
doi:10． 3969 / j． issn． 1002-266X． 2016． 44． 011
中图分类号:Ｒ734． 2 文献标志码:A 文章编号:1002-266X(2016)44-0035-03
肺癌是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤
之一［1］。手术联合放化疗是肺癌的主要治疗方法，
但化疗药物毒副作用大，许多患者无法耐受而放弃
治疗［2，3］。糙叶败酱属于败酱科败酱属植物，具有
镇静、抗菌、提高免疫力等生物学活性;其化学成分
主要有三萜类及其皂苷类化合物、黄酮类化合物、环
稀醚萜类化合物及生物碱等。糙叶败酱碱是从糙叶
败酱中提取的活性成分，属于 N苯甲酰基苯丙氨酸-
2-乙酰胺基苯丙醇酯［4，5］。近年研究发现，糙叶败酱
碱具有抗肿瘤作用，是一种极有应用价值的抗癌新
药［6，7］。2015 年 11 月 ～ 2016 年 1 月，本研究观察了
糙叶败酱碱对肺癌 SPC-A1 细胞增殖的影响，现分
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山东医药 2016 年第 56 卷第 44 期
析结果，并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1． 1 材料 糙叶败酱碱(纯度 95%)为本室提取，
用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配成浓度为 50 mmol /L
的储存液，－ 20 ℃保存，使用前用 ＲPMI 1640 完全
培养基稀释至所需浓度。人肺腺癌细胞 SPC-A1 购
自上海生命科学研究院细胞生物学研究所。CCK-8
试剂盒、Caspase-3 及 Caspase-8 活性检测试剂盒购
自碧云天生物技术研究所;细胞周期和凋亡检测试
剂盒购于美国 BD Bioscience 公司;实时荧光定量
PCＲ试剂盒和 PrimeScript ＲT-PCＲ反转录试剂盒购
自 Takara 公司;p21、细胞周期蛋白依赖性激酶 1
(CDK1)、血管内皮生长因子(VEGF)、Bcl-2、Bax、
p53 抗体和相应二抗均购于 Santa Cruz公司。
1． 2 糙叶败酱碱实验浓度、作用时间确定 人肺腺
癌细胞 SPC-A1 培养于含 10% 胎牛血青的 ＲPMI
1640 培养基，于 37 ℃、5% CO2 条件下孵育，取对数
生长期细胞接种于 96 孔板，随机分为七组，分别加
入适量糙叶败酱碱，使其终浓度为 0、5、10、15、20、
30、40 μmol /L，分别于培养 24、48 h 时采用 CCK-8
试剂盒检测各组细胞增殖情况(具体步骤参照试剂
盒说明书)，计录各组 450 nm处吸光度(A)值，计算
细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1 －实
验组 A值 /对照组 A 值)× 100%。结果显示，糙叶
败酱碱可抑制 SPC-A1 细胞增殖，并且其抑制作用
呈浓度和时间依赖性。糙叶败酱碱处理 24、48 h 时
对 SPC-A1 细胞生长抑制的半数抑制浓度(IC50)分
别为(27 ± 0． 016)、(16 ± 0． 023)μmol /L。后续实验
选用高于及低于 IC50的 10、20 μmol /L 糙叶败酱碱
处理 48 h。
1． 3 糙叶败酱碱干预及相关指标观察 ①细胞周
期:取对数生长期 SPC-A1 细胞，调整细胞密度为 2
× 105 个 /mL 接种于 6 cm 培养皿，分别加入 0、10、
20 μmol /L糙叶败酱碱处理 48 h，流式细胞仪分析
细胞周期，计算 G0 /G1、S、G2 /M 期细胞百分比。②
细胞凋亡情况:取对数生长期 SPC-A1 细胞，调整细
胞密度为 5 × 104 个 /孔接种于 6 孔板，分别加入 0、
10、20 μmol /L 糙叶败酱碱处理 48 h，收集各组细
胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。③细胞 p21、
p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mＲNA 表达:将对数生
长期 SPC-A1 细胞以 5 × 104 个 /孔接种于 6 孔板，分
别加入 0、10、20 μmol /L糙叶败酱碱处理 48 h，收集
细胞，采用荧光实时定量 ＲT-PCＲ 法检测 p21、p53、
Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mＲNA 的相对表达量。④
细胞 Caspase-3 和 Caspase-8 活性:取步骤③收集的
各组细胞，采用 Caspase-3、Caspase-8 活性检测试剂
盒检测二者活性，步骤均参照试剂盒说明书，采用酶
标仪测定 450 nm波长处各组吸光度(OD)值，以此
表示 Caspase-3、Caspase-8 的相对活性。
1． 4 统计学方法 采用 SPSS18． 0 统计软件。计量
资料采用 珋x ± s表示，组间比较采用单因素方差分析
(One-way ANO-VA);计数资料比较采用 χ2 检验。P
＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 细胞周期及细胞凋亡率 10、20 μmol /L 糙叶
败酱碱干预后细胞 G0 /G1 期细胞百分比及细胞凋
亡率均高于未加糙叶败酱碱(0 μmol /L)细胞(P 均
＜ 0． 05)。见表 1。
表 1 不同浓度糙叶败酱碱处理 48 h时 SPC-A1
细胞周期分布和凋亡率比较(%，珔x ± s)
糙叶败酱
碱浓度
细胞周期
G0 /G1 期 S期 G2 /M期
凋亡率
0 μmol /L 30．16 ±2．01 57．33 ±3．51 12．51 ±1．09 5．12 ±0．38
10 μmol /L 65．16 ±3．03* 26．70 ±2．12* 7．14 ±1．56* 45．85 ±3．24*
20 μmol /L 79．27 ±5．10＊△ 14．06 ±0．85＊△ 6．67 ±0．31＊△ 69．52 ±4．65＊△
注:与 0 μmol /L比较，* P ＜0． 05;与 10 μmol /L比较，△P ＜0． 05。
2． 2 p21、p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mＲNA 表达
10、20 μmol /L 糙叶败酱碱处理 48 h 细胞 p21、
p53、Bax mＲNA 表达高于未加糙叶败酱碱细胞，
VEGF、CDK1、Bcl-2 mＲNA 表达低于未加糙叶败酱
碱细胞，P均 ＜ 0． 05。见表 2。
表 2 不同浓度糙叶败酱碱处理 48 h时 SPC-A1 细胞 p21、p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mＲNA相对表达量比较(珔x ± s)
糙叶败酱碱浓度 p21 CDK1 VEGF Bax p53 Bcl-2
0 μmol /L 1． 00 ± 0． 13 1． 00 ± 0． 09 1． 00 ± 0． 16 1． 00 ± 0． 21 1． 00 ± 0． 31 1． 00 ± 0． 24
10 μmol /L 1． 61 ± 0． 31* 0． 50 ± 0． 21* 0． 62 ± 0． 12* 1． 58 ± 0． 22* 1． 46 ± 0． 20* 0． 57 ± 0． 33*
20 μmol /L 1． 97 ± 0． 15* 0． 32 ± 0． 17* 0． 42 ± 0． 31* 2． 22 ± 0． 20＊△ 1． 91 ± 0． 24＊△ 0． 36 ± 0． 26*
注:与 0 μmol /L比较，* P ＜ 0． 05;与 10 μmol /L比较，△P ＜ 0． 05。
2． 3 Caspase-3、Caspase-8 活性 10、20 μmol /L 糙叶
败酱碱处理 48 h细胞 Caspase-3和 Caspase-8相对活性
均高于未加糙叶败酱碱细胞(P均 ＜0． 05)。见表 3。
3 讨论
糙叶败酱作为药用植物具有丰富的生物学活
性，其中糙叶败酱总木脂素、总皂苷对体外培养的肺
癌SPC-A1细胞、肝癌HepG2细胞和白血病K562细
胞的生长均具有抑制作用，且抑制作用与药物浓度
及作用时间相关［8，9］，但其具体作用机制尚未明确。
本研究发现，糙叶败酱碱可将肺癌 SPC-A1细胞
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山东医药 2016 年第 56 卷第 44 期
表 3 不同浓度糙叶败酱碱处理 48 h时 SPC-A1 细胞
Caspase-3、Caspase-8 相对活性比较(OD，珔x ± s)
糙叶败酱碱浓度 Caspase-3 Caspase-8
0 μmol /L 1． 00 ± 0． 04 1． 00 ± 0． 02
10 μmol /L 2． 85 ± 0． 07* 2． 15 ± 0． 12*
20 μmol /L 3． 72 ± 0． 11* 3． 46 ± 0． 08*
注:与 0 μmol /L比较，* P ＜ 0． 05。
阻滞于 G0 /G1 期，并抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，
且上述作用呈现浓度依赖性增加的趋势。VEGF 在
新生血管生成中发挥重要作用，是介导肿瘤细胞新
生血管生长的关键因素［15］。本研究结果显示，糙叶
败酱碱可下调 VEGF 表达，提示糙叶败酱碱对肺癌
细胞的抑制作用可能与阻断新生血管生长有关。
CDK1 通过与 cyclin形成复合物使目标底物磷酸化，
调节细胞周期［10］;p21 通过与细胞周期蛋白、CDK
结合为周期素依赖激酶(CDKs)复合物，导致细胞周
期阻滞，阻断细胞增殖过程［11］;p53 蛋白可激活
p21，使其发挥细胞周期抑制作用，并修复受损的
DNA，还可促进 DNA修复不成功的细胞进入凋亡程
序［12］。本研究发现，糙叶败酱碱可抑制 CDK1 表
达，促进 p53 和 p21 表达，提示调控 CDK1、p21、p53
表达，介导 DNA 损伤修复，可能亦是糙叶败酱碱抑
制肺癌细胞增殖的作用机制。Bcl-2 基因是凋亡基
因 Bcl-2 家族的重要成员，对细胞凋亡有明显的抑
制作用［13］;Bax基因也是 Bcl-2 家族的重要成员，主
要发挥促凋亡作用，亦可与 Bcl-2 等抗凋亡因子协
同作用调控细胞的凋亡过程［14］。凋亡发生机制中
最关键的环节之一是 Caspase-3 激活并引发级联反
应。Caspase-8 通常以酶原的形式存在，被 Caspase-3
激活后可进一步激活下游凋亡基因，发生促凋亡功
能。Bcl-2 是 Caspase-3 的上游基因，通过抑制
Caspase-3 激活而发挥作用［15］。Bcl-2 还是 Caspase-
3 的直接底物，Caspase-3 激活后可特异性酶解 Bcl-2
片段，使 Bcl-2 从抑制凋亡变为触发凋亡［16 ～ 18］。本
研究 10、20 μmol /L糙叶败酱碱处理 48 h SPC-A1 细
胞 Bax表达明显高于、Bcl-2 表达明显低于未加糙叶
败酱碱细胞，进一步活化 Caspase-3 和 Caspase-8，促
进凋亡的发生。
综上所述，糙叶败酱碱可抑制肺癌 SPC-A1 细
胞增殖、促进细胞凋亡，激活 CDK1、p51、p53 介导的
凋亡途径，调节 Bax、Bcl-2 等基因表达，活化
Caspase-3、Caspase-8 可能是其作用机制。
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