全 文 ：3　讨论
　　已有文献报道灯盏细辛具有视神经保护作用 , 但其对大脑
皮层神经元的保护作用尚未明确 。本次实验研究发现 , 灯盏细
辛注射液多个浓度均具有促进大脑皮层神经细胞存活的作用 ,
其具体作用机制有待进一步探讨。
参考文献
1　 DildyJE, LeslieSW.EthanolinhibitsMDA-inducedincreasesinfree
intracellularCa2 +indissociatedbraincels.BrainRes, 1989;499(4)∶
383～ 387
2　 WuJunfang, ZhangJuntian.Antagonisticefectofnervegrowthfactor
onneuronalinjuryinducedbyhypoxiainculturedcerebralcerticalneuronsof
rats.ActaPhamacologiaSinica, 1999;20(2)∶47～ 51
田基黄对人肝癌细胞 HepG2增殖的影响＊
林久茂 1, 2 ,王瑞国3 ,陈旭征 1, 2 ,赵锦燕 1, 2
(1福建中医学院中西医结合研究院 ,福州　 350108;2福建中西医结合研究院 ,福州 　350108;3福建中医学院药
学系 ,福州　 350108)
　　摘　要　目的:探讨田基黄对人肝癌细胞增殖的影响。方法:体外培养人肝癌细胞株 HepG2,用 MTT法和流式细胞术(FCM)
检测田基黄提取物及其含药血清作用于 HepG2 24h后的细胞增殖情况。结果:MTT法结果表明 , 田基黄对 HepG2增殖有抑制作用;
FCM检测表明 ,田基黄阻止增殖中的 HepG2进入 S期。结论:田基黄能有效地抑制 HepG2细胞增殖 , 提示阻滞细胞周期 、抑制细胞
增殖可能是田基黄治疗肝癌的一个机制。
　　关键词　田基黄;肝癌;HepG2;细胞增殖;细胞周期
　　田基黄具有清热利湿 ,散瘀止痛 , 消肿解毒的功效。现代临
床用于治疗原发性肝癌 ,其作用机理不详。本文研究了田基黄
对人肝癌细胞株 HepG2增殖的影响 ,现将结果报道如下。
1 　材料与方法
1.1　试验药物　田基黄购自福建中医学院国医堂医院 , 批号:
060410,经福建中医学院中药鉴定教研室鉴定为藤黄科金丝桃
属植物地耳草 HypericumjaponicumThumb的干燥全草。田基
黄制成含生药 2g/ml的提取物 , 提取物经微孔滤膜过滤除菌 ,
于 4℃保存待试;含药血清的制备:SD大鼠 12只 , 体重 140 ～
180g, 雌雄各半 , 随机分为 2组(即含药血清组 、空白血清组),
按 1ml/100g体重灌胃给药 ,连续 7d, 第 7d给药后 1h采用安定
∶氯胺酮(1∶1)按 0.1ml/100g体重腹腔注射麻醉 ,腹主动脉采
血 , 于 4℃ 3000rpm离心 10min, 分离血清。合并同组血清 , 56℃
灭活 30min,于-20℃保存待用。
1.2　动物与细胞株　清洁级 SD大鼠 ,上海斯莱克实验动物有
限责任公司 , 许可证号:SCK(沪)2003-0003。 肝癌细胞株
(HepG2),购自南京凯基生物科技发展有限公司。
1.3　 试剂与仪器　RPMI1640培养基干粉 , GIBCO公司;胰蛋
白酶 (trypsin), Hyclone公司;胎牛血清 (fetalbovineserum,
FBS), 杭州四季青生物工程材料有限公司;四甲基偶氮唑蓝
(methylthiazolyltetrazolium。 MTT)干粉 , Sigma公司;细胞周期
(DNA)检测试剂盒 , BD公司。 ELX800酶标仪:BioTek公司;流
式细胞仪:BectonDickison公司;二氧化碳培养箱:德国Heraeus;
IX70荧光倒置相差显微镜:日本 OLYMPUS。
1.4　方法
1.4.1　细胞培养 　将人肝癌细胞 HepG2置于含 10%热灭活
胎牛血清(FBS)的 RPMI-1640培养液中 , 于 37℃ 5% CO2饱和
湿度的细胞培养箱中培养。
1.4.2　MTT法测定细胞增殖　取对数生长期的人肝癌细胞
HepG2, 用 0.25%胰酶消化并收集细胞。以 RPMI1640培养液
(含 10%FBS)制成细胞悬液 ,进行细胞计数 , 调整细胞密度为 1
×105个 /ml,接种于 96孔培养板中 , 每孔 100μl,常规培养 24h,
使细胞同步化。设田基黄提取物组(终浓度分别 80、40、20、10、
5、2.5mg/ml),田基黄含药血清组(终浓度分别为:20、 15、10、 5、
1%), 空白血清对照组(终浓度分别为:20、 15、10、 5、 1%)和对
照组(直接加等体积的培养液)并加药。以上各组均设 8个复
孔。继续培养 24h, 吸弃各孔中的液体 , 每孔加入 0.5mg/ml的
MTT溶液 100μl, 37℃孵育 4h, 然后吸弃各孔中的液体 , 加入
DMSO100μl/孔 ,振荡混匀 , 室温放置 10min,使结晶充分溶解并
混匀 ,于全自动酶标仪 570nm测定各组吸光度值(即 OD值),
并按下列公式计算增殖抑制率:抑制率(%)=(对照组平均吸
光度值一实验组吸光度值)/对照组平均吸光度值 ×100%。
1.4.3　流式细胞仪进行细胞周期(DNA)分析 　 将 1 ×105
个 /ml的人肝癌细胞 HepG2接种于 25ml的培养瓶中常规培养
24h。设田基黄提取物组(终浓度分别 80、40、 20、10mg/ml), 田
基黄含药血清组(终浓度为 10%), 空白血清对照组(终浓度为
10%)和对照组(直接加等体积的培养液)并加药。 以上各组
136 中药药理与临床 2007;23(5)
＊ 基金项目:福建中医学院科研基金(X20040019)
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2007.05.077
(含各剂量组)均设 6个复孔。继续培养 24h后用流式细胞仪
检测 HepG2的细胞周期(DNA), 并进行分析。
1.4.4　细胞形态学观察　 HepG2细胞培养 24小时后.用倒置
显微镜下观察细胞的形态变化。
2　结果
2.1　 田基黄提取物对 HepG2增殖的影响　表 1表明 , 田基黄
提取物浓度 5mg/ml及以上 , 均对肝癌细胞 HepG2增殖有明显
的抑制作用 , 随着药物浓度的升高对 HepG2的抑制率也升高。
表 2表明 , 田基黄提取物可明显升高 G1期的 DNA含量 ,降低 S
期的 DNA含量 ,表明可阻止 HepG2细胞由 G1期进入 S期。
　　表 1　田基黄提取物对 HepG2增殖的影响( x±s, n=8)
组别 浓度(mg/ml) OD值
抑制率
(%)
对照组 0 0.299±0.020
田基黄 80 0.062±0.007＊＊ 79.26
40 0.061±0.005＊＊ 79.60
20 0.137±0.007＊＊ 54.18
10 0.214±0.032＊＊ 28.43
5 0.241±0.037＊＊ 19.40
2.5 0.317±0.055 0.00
　　与对照组比较 ＊ P<0.05, ＊＊ P<0.01(下同)
　表 2　田基黄提取物对 HepG2细胞周期(DNA)的影响( x±s, n=6)
组别 浓度(mg/ml)
G0/G1
(%)
S
(%)
G2/M
(%)
对照组 0 39.31±3.01 48.15±5.25 12.54±1.13
田基黄 80 80.26±10.17＊＊ 11.54±1.93＊＊ 11.54±1.53
40 84.00±9.43＊＊ 9.89±2.12＊＊ 6.11±0.89＊＊
20 74.10±12.10＊＊ 15.17±3.20＊＊ 11.23±2.02
10 47.70±8.32＊＊ 40.03±4.78＊＊ 12.27±1.34
5 42.25±6.56 44.51±8.02 13.24±1.71
2.2　 田基黄含药血清对 HepG2增殖的影响　表 3结果显示 ,
空白血清对肝癌细胞 HepG2的增殖没有明显的抑制作用;田基
黄含药血清对肝癌细胞 HepG2的增殖有明显的抑制作用 ,并随
着药物浓度的升高对 HepG2的抑制率也升高。表 4的细胞周
期检测结果显示 , 10%的含药血清对细胞的增殖周期(S期百分
比)有显著的降低作用。
　　表 3　田基黄含药血清对 HepG2增殖的影响( x±s, n=8)
组别 浓度(%) OD值
抑制率
(%)
对照　　 0 0.299±0.020
空白血清 20 0.274±0.093 8.36
15 0.280±0.055 6.36
10 0.284±0.019 5.02
5 0.313±0.089 0.00
1 0.293±0.069 2.01
含药血清 20 0.108±0.010＊＊■■ 63.88
15 0.138±0.025＊＊■■ 53.85
10 0.182±0.085＊＊■■ 39.13
5 0.246±0.035＊＊■■ 17.73
1 0.294±0.033 1.67
　　与相应浓度空白血清组比较 ■ P<0.05, ■■ P<0.01(下同)
　　表 4　田基黄含药血清对 HepG2细胞周期(DNA)的影响( x±s, n
=6)
组别 浓度(mg/ml)
G0/G1
(%)
S
(%)
G2/M
(%)
对照　　 0 35.79±3.17 47.25±7.14 16.96±3.67
空白血清 10 36.43±2.03 45.27±8.06 18.30±4.90
含药血清 10 56.12±6.76＊＊■■18.56±4.41＊＊■■25.33±2.93＊＊■■
2.3　田基黄提取物及其含药血清对HepG2细胞形态的影响　
倒置显微镜下观察 , 对照组与空白血清组 HepG2细胞胞质均
匀.核仁清楚 , 伸展性好 ,生长良好 , 形成贴壁的梭形细胞。实验
组(提取物组及其含药血清组)当浓度分别≥10mg/ml和 10%
时 , HepG2细胞胞质混浊 , 细胞多呈圆形 , 体积缩小 ,折光性差 ,
细胞悬浮 、脱落而死亡;当浓度提取物为 5mg/ml和含药血清为
5%时 ,细胞形态无明显改变 , 但细胞生长慢 、数量明显较少;当
浓度提取物为 2.5mg/ml和含药血清为 1%时 , 细胞形态 、数量
等与对空白照组和空白血清组无明显差异。上述结果显示田基
黄提取物及其含药血清对 HepG2细胞增殖的有明显的抑制作
用 ,并随浓度的增加而增强 , 呈一定的量效趋势。
3　讨论
　　恶性肿瘤的典型特征是肿瘤细胞逃避正常的细胞增殖调
控体系而自主地无限生长。正常的细胞周期内发生一系列的系
统生化事件 ,从而实现生长 、分裂和增殖的过程。 在细胞周期
中 ,由 G1期进入 S期的过程被认为是最重要的 , 这一过程受到
G1期检查点(checkpoint)的调控。 后者推动 G1期进入 S期。
肿瘤的发生与 G1期检查点的异常关系密切 , 负向调控 G1期检
查点可阻止过度的细胞由 G1期进入 S期而抑制肿瘤的形成。
本实验研究发现 , 田基黄可以阻止 HepG2细胞由 G1期进入 S
期从而抑制其增殖 ,初步阐明田基黄对肝癌的作用机制。 G1期
检查点受到两条途径的调控 ,正向调控途径由 mdm- 2和 Cdk4、
cyclinD、cyclinE等组成;负向调控途径由野生型 P53基因及
其下游靶基因 WAF1/ CIP1及 GADD45等肿瘤抑制基因组
成 [ 1] 。因此 , 田基黄对肝癌的作用机制还需对此进行深入研
究。
　　本实验研究采用了血清药理实验法 ,设置多种比较 ,发现空
白血清对 HepG2细胞增殖没有明显影响 , 而田基黄提取物的含
药血清则明显抑制 HepG2细胞增殖 , 且与田基黄提取物的作用
基本平行。说明田基黄提取物及其代谢产物都具有抑制 HepG2
细胞增殖的作用。本研究结果还发现 , 当药物及其含药血清浓
度很低时 , 对 HepG2细胞增殖仍保持抑制作用 , 提示田基黄可
能含有抑制 HepG2细胞增殖的特异性成分 ,后者可能有对应的
靶标 ,这有待进一步的研究。
参考文献
1　贾旭东 ,韩驰 ,陈君石.茶多酚和茶色素对肝癌细胞株 HepG2细胞
周期的影响.卫生研究 , 2002;31(5)∶358～ 360
137中药药理与临床 2007;23(5)