全 文 ：中国生物制品学杂志 2012年 1月第 25卷第 1期 Chin J Biologicals January 2012，Vol. 25 No. 1
肺癌已成为我国乃至世界发病率最高的恶性肿
瘤，临床上肺癌可分为小细胞肺癌（Small cell lung
cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（Non-small cell lung
cancer，NSCLC），NSCLC 占所有肺癌病例的 80％ ～
85％，也是肺癌死亡病例的主要组成部分，严重危害
人类健康［1］。目前，临床上治疗 NSCLC的药物多为
人工合成药，无论单独还是联合使用，对晚期
NSCLC的疗效均不佳，毒副反应大且会产生严重耐
药性［2-3］。由于天然药物在治疗肿瘤中具有高效、副
作用低等优点，因此开发治疗 NSCLC的新型天然药
物对于提高 NSCLC的治疗效果及逆转其耐药性具
有重要意义。
雪胆甲素（CucurbitacinⅡa）是雪胆属植物的主
要活性成分，具有清热解毒、抗菌消炎及健胃止疼等
功效［4-5］。雪胆甲素对包括人白血病细胞在内的多
种肿瘤细胞具有抑制作用［6-7］，但对 NSCLC是否具
有抑制作用尚未见报道。本实验探讨了雪胆甲素对
人 NSCLC A549细胞增殖活性的影响，为其开发为
高效低毒的 NSCLC治疗药物提高参考。
1. 材料与方法
1. 1 细胞
人 NSCLC细胞系 A549细胞（贴壁生长）由吉林
大学第二医院中心实验室提供。
1. 2 实验动物
SPF级 CD1小鼠，雌性，4周龄，体重约 20 g，由
吉林大学第二医院中心实验室提供。
1. 3 主要试剂及仪器
雪胆甲素购自中国食品药品检定研究院；碘化
丙啶（PI）、细胞培养基 RPMI1640、DMEM及 RNaseA
均购自 Sigma 公司；MTT 试剂盒购自 Roche 公司；
Annexin V-PE细胞凋亡试剂盒购自上海碧云天生物
技术研究所；其他试剂均为国产分析纯；流式细胞仪
作者单位：1吉林大学中日联谊医院检验科（长春 130033）；2长春农
产品质量安全检测中心（长春 130000）．
通讯作者：刘百歌，E-mail：liubaige105＠163．com
·治疗性制剂·
雪胆甲素对人非小细胞肺癌 A549细胞增殖的抑制作用
高申 1，于孟可 2，魏佳慧 1，刘百歌 1
【摘要】 目的 探讨雪胆甲素（CucurbitacinⅡa）对人非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）A549细胞增殖的
影响。方法 以不同浓度的雪胆甲素作用于 A549细胞和小鼠原代培养的脾细胞，采用 MTT法检测雪胆甲素对两种细胞增殖的
影响；流式细胞术及 Annexin V-PE细胞凋亡试剂盒检测雪胆甲素对 A549细胞细胞周期及凋亡的影响。结果 雪胆甲素对
A549细胞和小鼠原代脾细胞的增殖均有抑制作用，且呈浓度依赖性，25 ～ 100 μmol ／ L的雪胆甲素对 A549细胞的增殖抑制
率明显高于脾细胞；雪胆甲素可将大部分 A549细胞阻滞于 G0 ／ G1和 S期，少部分细胞阻于 G2和 M期，并可促进细胞凋亡。结
论 雪胆甲素可明显抑制 A549细胞增殖，在 NSCLC高效低毒的治疗药物的开发中具有重要价值。
【关键词】 雪胆甲素；癌，非小细胞肺；细胞增殖；细胞凋亡
【中国图书分类号】 R93 R734． 2【文献标识码】 A 【文章编号】 1004-5503（2012）01-0069-03
Inhibitory effect of cucurbitacinⅡa on proliferation of human non-small cell lung cancer
A549 cells
GAO Shen*，YU Meng-ke，WEI Jia-hui，LIU Bai-ge （*Clinical Laboratory of China-Japan Union Hospital
Affiliated to Jilin University，Changchun 130033，China）
【Abstract】 Object ive To investigate the effect of cucurbitacinⅡ a on proliferation of human non-small cell lung cancer
（NSCLC） A549 cells． Methods A549 cells and primary murine splenocytes were treated with cucurbitacin Ⅱ a at various
concentrations respectively． The effect of cucurbitacinⅡa on proliferation of the two kinds of cells was analyzed by MTT method，
while that on cell cycle and apoptosis of A549 cells by flow cytometry and Annexin Ⅴ-PE cell apoptosis kit． Results Cucurbitacin
Ⅱ a showed dose-dependent inhibitory effect on both the proliferations of A549 and primary murine splenocytes． However，the
inhibiting rate of cucurbitacinⅡa at concentrations of 25 ～ 100 μmol ／ L to A549 cells was significantly higher than that of murine
splenocytes． CucurbitacinⅡa arrested a large portion of cells at G0 ／ G1 and S phases，while a small protein at G2 and M phases，and
promoted the cell apoptosis． Conclusion CucurbitacinⅡa inhibited the proliferation of A549 cells significantly，which played an
important role in development of high effective and low toxic drugs for NSCLC．
【Key words】 CucurbitacinⅡa；Cancer，non-small cell lung；Cell proliferation；Cell apoptosis
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DOI：10.13200/j.cjb.2012.01.74.gaosh.012
中国生物制品学杂志 2012年 1月第 25卷第 1期 Chin J Biologicals January 2012，Vol. 25 No. 1
为美国 Beckman 公司产品。
1. 4 小鼠脾细胞的分离培养
取 2只 CD1小鼠，脱臼处死并浸于 75％乙醇中
消毒 3 ～ 5 min，取脾，用 PBS清洗后剪成碎块，用两
个无菌载玻片磨砂面轻碾脾碎块，将所得细胞转入
RPMI1640培养液中，200目筛网过滤除去组织块，
300 × g 离心 5 min；弃上清，加入 500 μl低渗液重
悬细胞沉淀，并低渗 30 s，300 × g 离心 5 min；弃上
清，加入 RPMI1640完全培养液重悬细胞并转移至
100 mm培养皿中，置于 37℃，5％ CO2饱和湿度孵箱
内培养备用。
1. 5 雪胆甲素对 A549细胞及小鼠脾细胞增殖影响
的检测
采用 MTT法。分别取对数生长期的 A549细胞
及原代小鼠脾细胞，按 4 × 104个 ／ 孔接种于 96孔板
中，每孔 100 μl，置 37℃，5％ CO2孵箱内培养 24 h；
分别向两种细胞中加入终浓度分别为 100、50、25、
12. 5、6. 25和 3. 13 μmol ／ L的雪胆甲素，并设不加
药只加培养基的阴性对照组，每组均设 6个复孔，继
续培养 24 h；每孔加入 10 μl 5 mg ／ ml 的 MTT 溶
解液，继续培养 4 h；每孔加入 100 μl MTT溶解液，
培养过夜；酶标仪下读取 A570 值，并按下式计算细胞
增殖抑制率（RI）。
RI（％）＝（阴性对照组 A570值 － 用药组 A570值） ／ 阴性
对照组 A570值 × 100 ％
1. 6 雪胆甲素对 A549细胞细胞周期影响的检测
取对数生长期的 A549细胞，以 1 × 105个 ／ 孔
接种于 6孔板中，1. 5 ml ／ 孔，置细胞培养箱中培养
24 h；加入浓度分别为 25、12. 5和 6. 25 μmol ／ L的
雪胆甲素，并设含 20 μmol ／ L紫杉醇的阳性对照组
及不加药只加培养基的阴性对照组，培养 48 h；收集
细胞，PBS洗涤 2次，75％预冷乙醇固定 30 min；PBS
洗涤 2次，加入 RNaseA除去 RNA并用 PI染色，上
流式细胞仪检测细胞周期的变化。
1. 7 雪胆甲素对 A549细胞凋亡影响的检测
取对数生长期的 A549细胞，以 1 × 105个 ／ 孔
接种于 6 孔板中，1. 5 ml ／ 孔，置细胞培养箱中培
养 24 h；加入终浓度为 12 . 5 μmol ／ L 的雪胆甲
素，分别作用 24和 48 h，并设阴性对照组（不加药
只加培养基），每组设 6个复孔；采用 PE标记的重
组人 Annexin V检测细胞凋亡，在流式细胞仪上用
545 nm 激发光激发，575 nm 波长处检测细胞凋亡
情况。
1. 8 统计学分析
应用 SPSS 13. 0软件进行统计学分析，数据以
x ± s表示，组间比较采用 τ检验，以 P ＜ 0. 05为差
异有统计学意义。
2. 结果
2. 1 雪胆甲素对 A549细胞和小鼠脾细胞增殖的影
响
经 3. 13、6. 25、12. 5、25、50、100 μmol ／ L雪胆甲
素作用 24 h后，A549细胞和小鼠原代脾细胞的增殖
均受到抑制，且呈浓度依赖性；但随着剂量的增大，雪
胆甲素对 A549 细胞增殖的抑制活性显著高于对
小鼠原代脾细胞增殖的抑制活性（P值分别为 0. 052、
0. 009、1. 0E-04、9. 54E-05、5. 79E-05和 0. 001）。见
表 1。表明雪胆甲素对 A549细胞的毒性具有较高的
选择性。
表 1 不同浓度的雪胆甲素作用 24 h A549细胞及小鼠原代
脾细胞的增殖抑制率（％，x ± s，n ＝ 6）
Tab 1. Inhibition rate of prolifercation of A549 and spleen cells
24 h after treatment with cucurbitacin Ⅱa（％，x ± s，n ＝ 6）
雪胆甲素终浓度（μmol ／ L） A549细胞 小鼠原代脾细胞
3. 13 5. 80 ± 0. 56 5. 03 ± 0. 72
6. 25 9. 04 ± 1. 15 7. 77 ± 0. 55
12. 5 12. 53 ± 1. 01 10. 97 ± 1. 19
25 21. 66 ± 1. 44 14. 93 ± 1. 72
50 39. 61 ± 2. 87 20. 79 ± 3. 34
100 46. 12 ± 3. 87 23. 93 ± 3. 76
2. 2 雪胆甲素对 A549细胞细胞周期的影响
流式细胞仪检测结果表明，与阴性对照组相比，
经 6. 25、12. 5和 25 μmol ／ L的雪胆甲素作用 48 h
的 A549细胞 97％以上阻滞于 G1 ／ G0和 S期；6. 25
和 12. 5 μmol ／ L雪胆甲素组各有约 2. 70％和 2. 07％
的 A549细胞阻滞于 G2和 M期；见表 2。表明雪胆
甲素可能通过影响细胞周期，从而抑制 A549细胞增
殖。
表 2 各组 A549细胞的细胞周期分布（％，x ± s，n ＝ 6）
Tab 2. Distribution of cell cycles of A549 cells in various
groups（％，x ± s，n ＝ 6）
组别 G0 ／ G1 S G2 ／ M
雪胆甲素组（μmol ／ L）
6. 25 57. 84 ± 3. 21 39. 46 ± 2. 67 2. 70 ± 0. 35
12. 5 42. 56 ± 2. 09 55. 37 ± 3. 35 2. 07 ± 0. 35
25. 0 46. 48 ± 2. 17 53. 52 ± 19. 86 0
阴性对照组 41. 32 ± 2. 41 40. 41 ± 5. 04 18. 27 ± 2. 05
阳性对照组 3. 00 ± 0. 35 41. 68 ± 1. 78 55. 32 ± 2. 10
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2. 3 雪胆甲素对 A549细胞凋亡的影响
流式细胞术分析结果显示，与阴性对照组相比，
A549 细胞经 12. 5 μmol ／ L 的雪胆甲素作用 24 h
后，形态出现明显的凋亡性改变，细胞核固缩，并出
现 Hoechst 33258高染的凋亡小体，细胞凋亡比例约
为 7. 5％，对照组为 3. 8％；48 h后，雪胆甲素组早期
凋亡细胞数量明显增加，约为 13. 5％；见图 1 和图
2。表明雪胆甲素引起细胞凋亡可能是其抑制 A549
细胞增殖的机制。
A：雪胆甲素组（24 h）；B：阴性对照组。
注：图中箭头所示为凋亡细胞核。
图 1 A549细胞凋亡的形态观察
Fig 1. Morphology of apoptotic A549 cells
A：阴性对照组 24 h；B：雪胆甲素组 24 h；C：雪胆甲素组 48 h。
图 2 流式细胞术检测各组 A549 细胞的凋亡情况
Fig 2. Flow cytometry of apoptosis of A549 cells in various groups
3. 讨论
NSCLC是威胁人类健康的严重疾病，现已成为
人类死亡率最高的恶性肿瘤之一，临床上主要采取
手术切除和药物治疗，而目前的治疗药物多为人工
合成药物，疗效均不佳且毒副反应大，因此，寻找高
效低毒的天然治疗药物已成为包括 NSCLC在内的
肿瘤治疗中迫切需要解决的热点问题。
本文结果初步表明，雪胆甲素具有抑制人 NSCLC
A549细胞增殖的活性，其活性随着作用时间的延长
而增强，且该天然活性化合物对正常小鼠原代分离
脾细胞的抑制作用明显低于 A549 细胞，说明雪胆
甲素抑制细胞增殖的活性更倾向于肿瘤细胞。另外，
本文对雪胆甲素抑制 A549细胞增殖活性的机理进
行初步研究，发现该天然活性化合物可明显阻滞A549
细胞的细胞周期，将大部分细胞阻滞于 G0 ／ G1及 S
期，同时发现部分细胞形态呈现凋亡性变化，且随着
雪胆甲素作用时间的延长，凋亡细胞的数量显著增
多。因此，阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡可能是该化
合物抑制 A549细胞增殖的机理之一。对其机理还
需做更深入的研究。作为雪胆属植物主要活性化合
物之一的雪胆甲素除了在清热抗炎等方面具有良好
的应用前景外，还可能在高效低毒的 NSCLC及其他
肿瘤治疗药物的开发方面具有重要价值。
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（收稿日期：2011-06-22）
PI
荧
光
相
对
值
103102101100
FITC相对荧光强度
103102101100 103102101100
103
102
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A B C
A B20 μm 20 μm
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