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应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 2013，19 ( 3 ) : 528-531
2013-06-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2013.00528
19 9 2年，K l o e p p e r首次提出了“植物内生细菌”
（Endophytic bacteria）的概念，即指能够定殖在健康植物细
胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类细
菌 [1]. 根据内生细菌与植物的关系可以将其分为兼性内生细
菌和专性内生细菌. 根据宿主专一性的不同，又可以将内生
细菌分为专一宿主内生细菌和多宿主内生细菌 [2]. 内生菌具
有固氮、促生长、抗胁迫、抗摄食、抗病原真菌和细菌危害以
及他感等作用[2-3]. 植物内生菌已成为国内外竞相研究的热点.
我国植物种质资源丰富，按照每种植物至少有1种特有
的内生菌估算，我国的内生菌资源是极其丰富多样的. 我国
植物内生菌研究主要集中在一些药用植物、农作物和蔬菜
上，对珍稀濒危植物 的内生菌目前报道的有红豆杉、珙桐、
银杏和香樟等 [4-7]. 桫椤（Alsophila spinulosa）又名树蕨、刺桫
椤，属真蕨纲桫椤科桫椤属桫椤亚属，是一种高大的树形蕨
类植物[8]. 两亿年前，在地球中生代侏罗纪、白垩纪时期曾盛
极一时，与大型爬行动物恐龙同生共荣 . 第四纪冰川期后，
桫椤濒临灭绝，仅少数在适宜环境中生息繁衍，成为当今一
种十分珍贵的冰川前期古生孓遗植物，被誉为“蕨类植物之
王”、“古生物活化石”. 我国曾将其列为Ⅰ级保护植物，现为
Ⅱ级保护植物. 桫椤作为地球历史的见证，对研究古生物、古
植物、古地质、古气候、古环境的演变，对探索生物进化的奥
秘，都具有重要的研究价值. 目前对桫椤的研究报道主要集
中在桫椤种群分布、生理生态、组织化学以及引种栽培等方
面[9-11]，但有关桫椤内生菌的研究尚未见公开报道. 对桫椤内
生菌进行了分离鉴定，研究其生物多样性、生物学特征，阐
明其与宿主植物的相互关系以及探索其实际应用的可能性
等，可以为更好地保护和利用好桫椤这一珍稀野生植物资源
提供科学依据.
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 分离材料 实验所用桫椤叶和叶柄，于2010年9月11日
从贵州省赤水桫椤国家级自然保护区采集，带回实验室后，
立即进行表面冲洗、消毒等处理及内生菌分离.
1.1.2 主要试剂和仪器 Tr i s、EDTA、Tr i s平衡酚（北
京索莱宝科技有限公司）；S D S（S i g m a）；琼脂糖 [基
因科技（上海）有限公司分装 ]；P C R扩增试剂盒（北
4株桫椤内生细菌的分离鉴定及系统发育分析*
宋培勇** 李 林 肖仲久 李小霞
（遵义师范学院生命科学学院 遵义 563002）
摘 要 为了探索植物桫椤内生细菌及其进化关系，对用植物内生菌一般分离培养方法获得的4 株内生细菌，从形态
学、生理生化特征以及16S rDNA PCR扩增、测序和BLAST比对等进行了综合鉴定和系统发育分析. 根据形态学和生理
生化特征以及16S rDNA相似性比对，将内生细菌ASP17和ASL21初步鉴定为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）；
将ASL24初步鉴定为Lysinibacillus属，而ASL23可能为与Lysinibacillus相近但不同的属. 系统发育分析表明：4株内生细
菌中ASP17和ASL21聚为一支，亲缘关系较近；ASL23和ASL24聚为一支，亲缘关系较近. 图2 表2 参21
关键词 桫椤；内生细菌；16S rDNA；分离鉴定；系统发育分析
CLC Q939.103 : Q948.12+2.3
Identifi cation and Phylogenetic Analysis of Four Endophytic Bacteria
Isolated from Alsophila spinulosa*
SONG Peiyong**, LI Lin, XIAO Zhongjiu & LI Xiaoxia
(School of Life Sciences, Zunyi Normal College, Zunyi 563002, China)
Abstract To determine the endophytic bacteria inhabiting Alsophila spinulosa and their phylogenetic relationship, integrative
identifi cation and phylogenetic analysis was made on 4 strains of isolates with traditional microbiological methods. Based on
morphological and biochemical properties and sequencing and comparison results with BLAT, the isolates ASP17 and ASL21
were identifi ed as species Bacillus thuringiensis, ASL24 was identifi ed as genus Lysinibacillus, while ASL23 possibly belonged
to another genus close to Lysinibacillus. Among the 4 endophytic bacteria, ASP17 and ASL21 clustered in one branch, while
ASP23 and ASP24 clustered in another branch in cladogram. The results revealed that the genetic relationship between ASP17
and ASL21 is closer than between ASP23 and ASP24. Fig 2, Tab 2, Ref 21
Keywords Alsophila spinulosa; bacterial endophytes; 16S rDNA; isolation and identifi cation; phylogenetic analysis
CLC Q939.103 : Q948.12+2.3
收稿日期 Received: 2012-05-05 接受日期 Accepted: 2012-06-15
*贵州省科学技术基金项目（20 082103）资助 Supported by the
Science and Technology Foundation of Guizhou (No. 20082103)
**通讯作者 Corresponding author (E-mail: py66song@126.com)
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19卷 宋培勇等
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京全市金生物技术有限公司）；16 S r D N A P C R扩增
引物为 27f: 5 ′- GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′，1525r :
5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′（由上海捷瑞生物工程
有限公司合成）. PCR扩增仪为S1000TM Thermal Cycler（Bio-
Rad）；WD-9413A 凝胶成像分析仪、DYY-10C型电泳仪（北京
市六一仪器厂）.
1.2 方 法
1.2.1 内生细菌分离 （1）表面消毒：参考文献[5]和[12]介
绍的方法并作必要改动：将采集的新鲜桫椤的叶和柄分别用
流水冲洗，风干表面水分，剪成小块或小段，用无菌水漂洗2
次，75%酒精浸泡1 min，再用2% NaClO溶液浸泡3 min，转入
75%酒精中浸泡30 s，接着用无菌水漂洗3次，将剪成的叶块
和柄段平放于NA平板上，28 ℃培养2-3 d. 取最后一次漂洗液
涂布于NA平板作为对照. （2）内生细菌的分离和纯化：将NA
平板上组织块下和周缘长出的菌落或菌苔用平板划线稀释
分离法转接于NA空平板，待长出单菌落后，再划线稀释分离
1-2次，最终获得纯培养物，转NA斜面保存.
1.2.2 形态特征观察 参考文献[13]和[14]介绍的方法对35
株纯培养物进行菌落形态、细胞形态（革兰氏染色和芽孢染
色）观察，并根据其形态学特征对分离菌株进行初步分类.
1.2.3 生化特征观察 参考文献[13]、[14]和[15]介绍的方法
进行以下生化反应：糖发酵实验、甲基红试验、V-P试验、硝
酸盐还原、柠檬酸盐利用、大分子物质水解、接触酶试验、
尿素酶试验.
1.2.4 内生细菌基因组DNA提取 基因组DNA的提取参照
文献 [16]介绍的方法并根据实际情况适当调整：（1）取1.5
mL菌悬液放入2 mL的无菌EP管中，12 000 r/min离心1 min，
弃上清液 . （2）沉淀加530 μL TE缓冲液，反复吹打使之重
悬，再加40 μL 20% SDS，混匀，65 ℃水浴1 h. （3）加入100
μL 5 mol/L NaCl混匀，再加80 μL CTAB/NaCl混匀，65 ℃水
浴10 min. （4）加入750 μL氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心4-5
min，取上清液. （5）加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混
匀，离心5 min，取上清液. （6）加入0.6倍体积的异丙醇沉淀
DNA，离心，弃上清液. （7）50 μL 70%乙醇洗涤DNA，弃上清
液，干燥. 加50 μL TE缓冲液，保存.
1.2.5 16S rRNA基因的PCR扩增 PCR反应体系（50 μL）：
引物27f 1 μL，引物1525r 2 μL，PCR Mix 9.5 μL，模板1 μL，dd
H2O 37.5 μL. 反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，59 ℃ 2 min，
72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃，10 min.
1.2.6 测 序 选取4株内生细菌的16S rDNA PCR扩增产物
交由上海生工生物工程有限公司测序.
1.2.7 同源性比对及系统发育分析 登陆NCBI（http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/）利用BLAST将测序结果与GenBank中的已
知序列进行比对，查找相似性最高的菌株，并根据16S rDNA
序列相似性进行分子鉴定. 以4株内生细菌、2株同源性菌株
和3株不同属的参比菌株的16S rDNA序列为基础，用MEG 5.1
软件构建出系统发育树.
2 结果与分析
2.1 桫椤内生细菌的分离及初步鉴定
通过植物内生菌一般分离培养方法和平板划线稀释纯
化方法从桫椤叶和柄中共分得内生细菌35株，其中20株来
自柄，15株来自叶. 革兰氏染色和芽孢染色显微镜观察发现
35株内生细菌革兰氏染色阳性，多数杆状，少数呈球状；均
产芽孢，芽孢多为近端生、卵圆形，极少数为端生、圆形. 从
中挑选出4株进行了生化反应（表1）. 从表1可以看出：桫椤
内生细菌ASP17和ASL21除在半乳糖发酵、甲基红试验、硝
酸盐还原和脂肪水解上存在差异外，其余各项表现均一致；
而ASL23和ASL24除在半乳糖和木糖发酵上存在差异外，在
V-P试验、甲基红试验、硝酸盐还原和脂肪水解上亦存在差
异. 这说明ASP17和ASL21 之间在形态学和生理生化特征上
更为接近，而ASL23和ASL24之间相距较远.
2.2 部分菌株16S rDNA的PCR扩增
根据菌株间形态学上的差异，挑选20株内生细菌，以
其基因组DNA为模板，用16S rDNA PCR扩增通用引物27f和
1525r，进行PCR扩增，通过1.6%琼脂糖凝胶电泳检测发现，
除19（ASL11菌株）和20（ASL35菌株）扩增失败外，其余18株
桫椤内生细菌16S rDNA扩增全部获得成功，扩增出约1 400
bp大小的DNA条带（图1）. 19（ASL11菌株）和20（ASL35菌
株）扩增失败是由于PCR扩增前加样失误造成的，后来重新
表1 桫椤内生细菌的形态学鉴定和生理生化反应
Table 1 Morphological and biochemical characteristics of endophytic bacteria from Alsophila spinulosa
菌株
Strain
革兰氏反应
Gram stain
形状
Shape
内生孢子
Endospore
发酵试验 Fermentation test
葡萄糖
Glucose
半乳糖
Galactose
木糖
Xylose
蔗糖
Sucrose
麦芽糖
Maltose
山梨醇
Sorbitol
甘露醇
Mannitol
甘油
Glycerol
ASP17 + 杆状 Rod-shaped + + - + + - - + - + - - - - - - -
ASL21 + 杆状 Rod-shaped + + - + - - - + - + - - - - - - -
ASL23 + 杆状 Rod-shaped + + - - - - - - - - - - - - - - -
ASL24 + 杆状 Rod-shaped + + - + - - - - - + - - - - - - -
菌株
Strain
V-P 试验
V-P test
甲基红试验
Methyl red
test
盐试验
Citrate
test
过氧化氢
酶试验
Catalase test
硝酸盐还原试验
Nitrate reduction
test
尿素酶分解
试验
Urase test
脂肪分解
试验
Lipolysis test
明胶液化试验
Gelatin
liquefaction test
淀粉水解
Amylohydrolysis
test
ASP17 + + - + - + + + +
ASL21 + - - + + + - + +
ASL23 + - - + - + - - -
ASL24 - + - + + + + - -
“+”：阳性或能利用；“-”：阴性或不能利用. 糖发酵中“++”表示产酸产气，“+-”表示产酸不产气，“--”表示不产酸不产气
“+” = positive or utilizable; “-” = negative or not utilizable; “++” = producing both acid and gas;“+-” = producing acid but no gas; “--” = producing no acid and
gas in saccharides fermentation test
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4株桫椤内生细菌的分离鉴定及系统发育分析 3期
对这两个菌株进行了16S rDNA PCR扩增，获得了满意的结果.
这再次说明通用引物27f和1525r以及所采用的PCR反应体系
和扩增程序比较适合用于细菌16S rDNA PCR扩增.
2.3 16S rDNA PCR扩增产物测序
选取ASP17、ASL21、ASL23、ASL24将其PCR扩增产物
送上海生工生物工程有限公司测序，4株细菌测序均得到测
序结果.
2.4 同源性比对与分类鉴定
利用4株细菌的测序结果，登陆NCBI，利用BLAST软件
进行同源性比对，比对结果见表2. 根据相似性≥98%作为同种
的划分标准，相似性≥95%作为同属的划分标准，并结合形态
学和生化反应特征，根据文献[17]，可将ASP17和ASL21初步鉴
定为Bacillus thuringiensis，ASL24可初步鉴定为Lysinibacillus
属，而ASL23可能为与Lysinibacillus相近但不同的属.
2.5 系统发育分析
对4株内生细菌和 2 株同源性菌株，另选取 3株参比
菌株 [Planococcus rif ietoensis strain M8（NR_025553），
Planomicrobium okeanokoites strain IFO 12536（NR_025864），
Marinibacillus campisalis strain SF-57（NR_025716）]，利用
MEGA 5.1建系统发育树（图2）：ASL23和ASL24及其同源
菌株Lysinibacillus fusiformis strain DSM 2898聚为一支，而
ASP17、ASL21及其同源菌株Bacillus thuringiensis strain IAM
12077和3株参比细菌聚为另一支. 但ASL21比ASP17与Bacillus
thuringiensis strain IAM 12077亲缘关系更近，ASL24比ASL23
与Lysinibacillus fusiformis strain DSM 2898亲缘关系更近；另
一方面桫椤内生细菌ASP17和ASL21之间比ASL23和ASL24之
间亲缘关系更近. 这与综合鉴定的结果一致.
3 结论与讨论
通过植物内生菌一般分离培养方法，从贵州赤水桫椤
国家级自然保护区桫椤的叶和柄中共分离到内生细菌35株 .
革兰氏染色和芽孢染色镜检观察发现：革兰氏染色阳性，均
产芽孢 . 根据形态学和生化反应特征以及16S rDNA测序和
BLAST比对，ASP17和ASL21可初步鉴定为苏云金芽孢杆菌
（Bacillus thuringiensis），ASL24可初步鉴定为Lysinibacillus，
而ASL23可能为与Lysinibacillus相近但不同的属，其内生细菌
表现出一定的多样性. 系统发育分析发现：4株内生细菌中，
ASP17和ASL21关系较近，与Bacillus thuringiensis strain IAM
12077聚为一支，而ASL23和ASL24关系较近，与Lysinibacillus
fusiformis strain DSM 2898聚为一支，但ASP17和ASL21之间比
ASL23和ASL24之间具有亲缘关系更近.
植物内生菌是一种潜在的重要的微生物资源，能促进
宿主植物生长、增强植物抗逆性以及增强其抗病虫害能力
等，有望开发成植物生长促进剂和生物农药. 如苏云金芽孢
杆菌由于能产生δ内毒素对昆虫幼虫起毒杀作用而成为当今
应用最广泛的细菌杀虫剂. 卢兰兰等从滇池蓝藻水华集聚区
分离到的一株溶藻细菌DC-L14，经16S rDNA序列分析鉴定
为Lysinibacillus fusiformis，能分泌非蛋白类溶藻物质 [18]. 何
敏艳从电镀废水中分离到一株高效铬还原菌Lysinibacillus
fusiformis ZC1 [19]，据称L. fusiformis ZC1是至今为止已经报道
的铬（Ⅵ）还原效率最高的细菌，并且其还有多种重（类）金
属抗性. 桫椤生长环境海拔低、温度较高、湿度较大，适合藻
类生长，从桫椤叶中分离到的内生细菌ASL24是否也有溶藻
作用，以及其是否具有增加宿主植物桫椤抗重金属胁迫的功
能等值得深入研究.
据报道，内生菌在宿主植物科、种以及组织水平上都存
在着一定的专一性，但由于试验所采用内生菌分离培养技
术是沿袭了传统的微生物学分离培养方法，能够分离到的
微生物是极其有限的. 这次从桫椤分离到的内生细菌总数较
少，加之送去测序的仅有4株，所以是否存在其特有的内生菌
图1 20株内生细菌16S rDNA的PCR扩增结果
Fig. 1 Results of 16S rDNA amplifi ed by PCR
M为200 bp DNA Ladder；图顶端数字1、4、8、17分别代表菌株ASL23、ASP17、ASL23、ASL24
M indicates 200 bp DNA Ladder. Numbers 1, 4, 8, 17 above the fi gure represent strains ASL23, ASP17, ASL23, ASL24, respectively
表2 16S rDNA扩增产物序列相似性比对
Table 2 Comparison of 16S rDNA of the four strains
菌株
Strain
来源
Origin
注册号
Accession No.
同源菌株
The nearest type strain
相似性
Identity
ASP17 Petiole NR043403 Bacillus thuringiensis strain IAM 12077 99%
ASL21 Leaf NR043403 Bacillus thuringiensis strain IAM 12077 99%
ASL23 Leaf NR042072 Lysinibacillus fusiformis strain DSM 2898 93%
ASL24 Leaf NR042072 Lysinibacillus fusiformis strain DSM 2898 97%
531
19卷 宋培勇等
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群，还有待进一步研究. 2006年，中国科学院昆明植物研究
所曾英研究组构建了世界首例植物内（共）生菌宏基因组文
库 [20]，开创了植物内（共）生菌宏基因组研究的先河. 由于内
生菌可产生与宿主植物相同的活性物质或其前体 [20-21]，利用
能产活性物质或其前体的内生菌，通过微生物发酵生产新型
活性物质，创制高效、绿色环保的新药，或利用现代生物工
程技术，直接克隆有关基因或基因簇，构建基因工程菌，实
现活性物质的工业化生产，必将成为未来内生菌研究新的热
点和重点.
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图2 基于16S rRNA序列的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences
标尺，1%的序列分歧 Bar, 1% sequence divergence