全 文 ：0 引言
众所周知，化学农药易造成残留污染、诱发病原
菌抗药性和伤害非靶标生物等不利影响，因此植物病
害的生物防治研究越来越受到重视。利用植物外部
环境中的拮抗细菌防治植物病害已有许多研究报道，
但由于这些生防菌易受外界环境条件的影响，防病效
果并不理想[1]。近年来，研究发现植物体内存在大量
内生菌，它们可以为植物提供营养物质、参与防卫功
能、促进生长，增强抗逆性等，具有研究开发利用价
值[2]。目前已从水稻、棉花、辣椒等植物体内筛选出多
基金项目：河北省自然科学基金资助项目“保护地番茄灰霉病比较流行学研究”（302296）。
第一作者简介：窦瑞木，男，1963年出生，河南中牟人，副教授，硕士，河南省植物病理学会常务理事，主要研究方向：植物病害综合防治，植物内生菌
抗病作用。通信地址：451450河南省郑州市中牟县青年西路38号，Tel：0371-68520392，E-mail：drm0392@yahoo.com..cn。
通讯作者：曹克强，男，1963年出生，河北容城人，教授，博导，博士。研究方向：植物病害流行、预警与综合防治、天然产物农药。通信地址：071001河
北省保定市河北农业大学西校区植物保护学院，Tel：0312-7528145，E-mail：ckq@hebau.edu.cn。
收稿日期：2010-03-19，修回日期：2010-03-26。
中药白鲜皮内生细菌TS-5生化特性及
对番茄灰霉病菌的抑制作用
窦瑞木 1，雷清泉 1，曹克强 2
（1河南农业职业学院，河南中牟 451450；2河北农业大学植物保护学院，河北保定 071001）
摘 要：为了探求中草药植物内生菌对植物病原菌的抑制作用，采用对峙试验、活体防效测定、革兰氏染
色、芽孢染色以及生理生化特性、生长条件测定等方法，研究了从中药白鲜皮中获得的一株内生细菌
TS-5对灰霉菌的抑制作用。试验结果表明，此内生细菌对灰霉菌有较强且稳定的抑制作用，在培养皿
对峙试验中，抑菌带达10 mm，在活体上对病害的抑制率为33.72%；经形态学观察和生理生化反应，确
定此菌株属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；其最适生长温度为30℃，最适pH 7，最佳培养时间为48 h，
通气量越大菌株的生长情况越好。
关键词：白鲜皮；内生细菌；生理生化特性；抑菌作用；番茄灰霉病菌
中图分类号：S436.412.1 文献标志码：A 论文编号：2010-0817
Study on Physiological and Biochemical Characters of Endophytic Bacterial Strain TS-5 from
Densefruit Pittany Root-bark and Its Antibacterial Activity to Botrytis cinerea
Dou Ruimu1, Lei Qingquan1,Cao Keqiang2
(1He’nan Vocational College of Agriculture, Zhongmou He’nan 451450；
2College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei, Baoding Hebei 071001)
Abstract: The endophytic bacterial strain TS-5 from medicinal plants of Densefruit pittany, root-bark was
tested for its inhibiting effect against Botrytis cinerea. The physiological and biochemical characters,
antagonistic activity, classification and growth condition of TS-5 in vitro were measured. The results showed
that the strain had antagonistic activity against the gray mold disease, the inhibition zone was 10mm ,
antagonistic rate on leaves was 33.72% . According to the morphology observation and physiological and
bio-chemical reactions, the strain was identified as Bacillus subtilis. Tests showed that the optimum growth
condition is 30℃ at pH 7 for 48 hour. The bacterial strain is aerobic.
Key words: densefruit pittany root-bark; endophytic bacterial; physiological and biochemical characters;
antibacterial activity；Botrytis cinerea Pers.
中国农学通报 2010,26(13):324-327
Chinese Agricultural Science Bulletin
种对病害有较好防效的内生细菌[3-6]，但对中草药植物
内生细菌的研究相对较少。为此，此研究利用从中药
白鲜皮中已分离并经初筛的内生细菌TS-5，进一步探
讨其对灰霉病菌的抑制作用，并进行形态观察、生理生
化特性测定和生长条件研究，旨在为新型植物源农药
的研发提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
此试验于2007年4月至2008年4月在河北农业大
学植病流行与综防实验室进行。
1.2 供试材料
菌种与培养基：番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）菌
株，白鲜皮内生菌株（TS-5），由河北农大植病流行与综
防实验室提供；PDA、PD、NA、NB等培养基（液）按常
规比例制作好后备用。
仪器与试剂：细菌过滤器、离心机、气浴恒温振荡
器、SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵。碘液、95%酒精、
番红、结晶紫孔雀石绿、甲基红、溴百里酚蓝等。
1.3 内生菌株的抑菌作用
1.3.1 平板对峙试验 将培养 4 天左右的 Botrytis
cinerea从菌落边缘打取直径为0.4 mm的菌饼，将其移
接到直径为 9.0 cm的PDA平板中央，然后，在距菌饼
2.5 cm处三点对称接种培养 48 h的供试内生菌株
（TS-5）培养液 5 μL，24℃黑暗对峙培养，重复 3次，
72 h后观测抑菌带。拮抗能力强弱与抑菌带宽度标准
如下表1。
1.3.2 活体防效测定 参考郭彦彬[7]等的方法，将叶龄
叶位一致的番茄叶片剪下，无菌水冲洗3次，晾干后叶
面朝上放于厚度约为2 mm的0.5%水琼脂平板中。内
生细菌（TS-5）接种于 PD培养液，在转速为 120 r/min
的恒温（30℃）摇床上培养48 h，离心收集菌体，用生理
盐水将浓度调至 1×108 cfu/mL，将稀释好的菌液均匀
喷于番茄叶片上，30 min 后，将直径为 4 mm 的
Botrytis cinerea菌饼菌面朝下接种于番茄叶片中心部
位。以喷无菌水为对照。24℃光照培养，48 h后用十
字交叉法测量病斑直径，计算抑菌率。
S =
R1 - R2
R1
× 100%
S：抑制率；R1：对照斑直径；R2：处理斑直径
1.4 菌株鉴定
将内生细菌（TS-5）接种于PDA培养基上，30℃培
养 18~24 h，观察其菌落形态和革兰氏染色、芽孢染色
情况，结合生理生化指标测定结果对菌株进行鉴定[8]。
1.5 内生菌株生理生化指标的测定
通过接触酶反应、甲基红试验、糖类发酵试验、明
胶液化、产硫化氢试验、水解纤维素试验、运动性观察、
好氧性和厌氧性测定、耐盐生长试验、柠檬酸盐的利用
试验、丙二酸盐的利用试验、生长温度、硝酸盐还原反
应等，测定内生菌株TS-5的各项生理生化指标。
1.6 内生细菌TS-5生长条件的研究
1.6.1 培养基 pH对菌株生长的影响 将内生菌株培养
液用逐步稀释法稀释 105~107倍，取 0.05 mL在NA培
养基上涂平板，28℃恒温培养 24~36 h后计算平板上
含有的活菌落数。每毫升中含有的细菌数=平板上的
菌落数×稀释倍数/平板上的加菌液的量。
用1 mol/L NaOH将培养基pH调节为6、7、8、9和
10，测定其含菌量。
1.6.2 培养温度、时间、通气量对菌株生长的影响 将接
种有内生细菌的NB培养液在 23、27、30、34℃和 37℃
的温度下培养 24~36 h，测定其含菌量；将接种有内生
细菌的NB培养液在 30℃恒温条件下培养 24、48、72、
96和 120 h，测定其含菌量；将接种有内生细菌的NB
培养液的装液量调节为 25、50、75、100和 150 mL/250
mL的三角瓶，并置于 30℃恒温条件下培养 24~36 h，
测定其含菌量。具体方法同1.6.1。
2 结果与分析
2.1 内生菌株的抑菌作用
对峙试验结果表明，培养72 h后内生菌株TS-5对
番茄灰霉病菌的抑菌带宽度达到10 mm。离体叶片试
拮抗能力
拮抗能力强
拮抗能力中等
拮抗能力弱
抑菌带宽度
抑菌带宽度≥8.0 mm
4.0 mm≤抑菌带宽度＜8.0 mm
抑菌带宽度＜4.0 mm
表1 拮抗能力强弱与抑菌带宽度标准
鉴别特征
运动性
接触酶
甲基红试验
产硫化氢
水解纤维素
明胶液化
糖类发酵
硝酸盐还原
利用：柠檬酸盐
丙二酸盐
结果
运动
+
+
+
-
+
+
+
+
+
鉴别特征
生长温度：5℃
10℃
30℃
40℃
55℃
生长NaCl：2%
5%
7%
10%
好养性和厌氧性
结果
-
d
+
+
-
d
-
-
-
好氧或兼性厌氧
表2 内生细菌TS-5的主要生理生化反应
注：“+”为阳性反应或者可以生长、利用，“-”为阴性反应或者不可
以生长、利用；“d”表示反应不明显。
窦瑞木等：中药白鲜皮内生细菌TS-5生化特性及对番茄灰霉病菌的抑制作用·· 325
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
验结果表明，内生菌株TS-5对番茄灰霉病菌的抑制率
为33.72%，见图1。
2.2 内生菌株的鉴定及生理生化指标测定结果
内生菌株TS-5的菌体大小为(0.7~1.1) μm×(2.0~
3.8) μm。革兰氏染色阳性(蓝色)，杆状，产芽孢。菌落
在PDA平板培养性状为：单菌落乳白色，圆形，边缘不
规则，中间褶皱突起，不产生色素。菌体形态见图2，生
理生化特性见表 2。参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]
和《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）检索表进行鉴定，确
定内生细菌TS-5为枯草芽胞杆菌（B. subtilis）。
2.3 内生细菌生长条件测定结果
表 3表明：以培养基灭菌后初始 pH为 7时，菌株
生长量最大，为菌株培养的最佳 pH；不同培养温度对
菌株生长的影响不同，以 30℃为最佳生长温度条件；
不同培养时间对菌株生长的影响不同，以48 h为最佳
培养时间；培养时通气条件对菌株生长有较大的影
响，在一定范围内，通气条件越好，对菌株生长越有
利。
处理 对照
图1 内生菌株TS-5对番茄灰霉病菌的抑制效果 图2 菌体形态观察结果
pH
6
7
8
9
10
含菌量（×109 cfu/mL）
1.63
1.76
1.6
1.13
1.04
温度/℃
23
27
30
34
37
含菌量（×109 cfu/mL）
0.34
0.48
0.55
0.43
0.3
培养时间/h
24
48
72
96
120
含菌量（×109 cfu/mL）
2.03
3.16
2.43
1.8
1.61
通气量/mL
25
50
75
100
150
含菌量（×109 cfu/mL）
3.3
5.2
2.3
0.53
0.2
表3 不同pH、温度、培养时间、通气量对菌株生长的影响
3 结论与讨论
此研究通过对白鲜皮内生细菌TS-5对灰霉菌抑
制作用的测定，表明该菌株在室内培养皿上对番茄
灰霉病菌有较强且稳定的抑制作用，在活体测试中
抑菌率为 33.72%，这个数值看起来偏低，但是它是
在用菌饼接种这种强大侵染压力下所测得的结果，
这种侵染压力远比自然条件下分生孢子的侵染压力
要大，因此，这个数值也足以反映其较强的抑菌作
用。根据 TS-5菌株的形态特征和生理生化反应，将
其确定为枯草芽胞杆菌（B. subtilis）。研究还进一步
探索了内生细菌 TS-5的基本生长条件，结果表明其
最适生长温度为 30℃，最适 pH为 7，最佳培养时间
为 48 h，通气量越大菌株的生长情况越好。此研究
为内生拮抗细菌 TS-5的发酵培养和生防利用奠定
了基础。
芽孢杆菌属细菌是广泛存在于自然界的一类好
氧和兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。近
年来研究发现芽孢杆菌属中的许多种具有潜在的生
防价值，能有效抑制植物病原真菌并促进植物生长发
育。其防病促生机理主要是诱导植物产生系统抗性
(ISR)、分泌抗生素或植物激素、产生抗菌蛋白等 [9-11]。
关于内生细菌在植物体内的种群数量，目前研究报道
不多，而且植物内生细菌的分离因取样、消毒方法及
培养基选择不同，其数量存在较大差异，尚无统一的
定量分析方法。下一步将对内生菌TS-5的抗菌成分
进行分离纯化和结构鉴定，进而明确其抑菌机理。关
于此芽胞杆菌能否产生诱导抗病性也有待于进一步
研究。
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