全 文 ：华西药学杂志
W C J·P S 2016，31(3)∶245 ～ 247
基金项目:国家自然科学基金资助项目(批准号:81072636)
作者简介:桑纳(1989—)，女，四川成都，正攻读药理学专业的硕士学位。Email:sana212@ 163． com
* 通信作者(Correspondent author)，Email:dujr_1@ 163． com
藁本内酯对小鼠海马区损伤的保护作用及其作用机制
桑 纳，王平汉，杜俊蓉*
(四川大学华西药学院，四川 成都 610041)
摘要:目的 研究藁本内酯(Lig)对小鼠海马区损伤的保护作用及其作用机制。方法 将 24 只小鼠随机均分为假手术组、模
型组和 Lig组，采用双侧颈总动脉结扎法(2VO)建立全脑缺血再灌注模型;Nissl 染色观察小鼠海马 CA1、CA2 区的神经元计
数;免疫组化检测海马区胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、肿瘤坏死因子(TNFα)的表达。结果 与模型组比较，Lig能减轻缺血再
灌带来的损伤，减少海马 CA1、CA2 区神经元的丢失，降低 GFAP、TNFα 的表达。结论 Lig 能明显减轻全脑缺血再灌注所致
的小鼠海马区损伤，其机制与抑制星形胶质细胞激活、减轻炎症反应有关。
关键词:藁本内酯;全脑缺血再灌注;海马损伤;炎症反应;GFAP;TNFα;Nissl染色;免疫组化
中图分类号:Ｒ96 文献标志码:A 文章编号:1006 － 0103(2016)03 － 0245 － 03
DOI:10． 13375 / j． cnki． wcjps． 2016． 03． 009
Protective effects of Z － ligustilide on global brain ischemia reperfusion hippocampus injury
in mice and its mechanism
SANG Na，WANG Pinghan，DU Junrong*
(West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu，Sichuan，610041 P． Ｒ． China)
Abstract:OBJECTIVE To investigate the neuroprotective effects of Z － ligustilide (Lig) on hippocampus in mice and its
mechanism．METHODS 24 mice were randomly divided into sham group，model group and Lig group． The global brain ischemia
reperfusion model were induced by the bilateral common carotid occlusion(2VO)． The number of neuron in CA1，CA2 regions of hippo-
campus was measured by Nissl stain and the expressions of GFAP and TNFα were detected by immunohistochemistry． ＲESULTS
Compared with the model group，Lig could alleviate the injury induced by cerebral ischemia － reperfusion，avoid the decreasing number
of neuron in CA1，CA2 regions of hippocampus，and suppresse the expression of GFAP and TNFα． CONCLUSION Lig alleviates the
hippocampus injury induced by global brain ischemia reperfusion，and the mechanism is related to suppressing the activity of astrocytes
and reducing the inflammation response．
Key words:Z － ligustilide;Global brain ischemia reperfusion;Hippocampus injury;Inflammation response;GFAP;TNFα;Nissl stain;
Neuroinflammation
CLC number:Ｒ96 Document code:A Article ID:1006 － 0103(2016)03 － 0245 － 03
脑卒中死亡率全球排第 3，仅次于心血管疾病
与癌症［1］。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑
卒中，近 85%的脑卒中源于血栓或栓塞导致的缺
血［2］。目前，临床上缺乏有效的不良反应少的药物
来对抗缺血性脑卒中［3］。大脑缺血后，脑内胶质细
胞被激活、血液中外周细胞浸润，各种细胞因子与化
学因子介导了神经炎症反应［4］，因此，现研究了藁
本内酯对小鼠全脑缺血再灌注引起的海马区损伤的
保护作用及其机制，旨在为对抗脑缺血药物的开发
提供基础。
1 实验部分
1． 1 仪器、试药与动物
体温维持仪(淮北正华科技有限公司);正置荧
光显微镜(日本尼康)。藁本内酯(Lig，香港理工大
学，纯度 98． 5%)用 0． 2%二甲基亚砜溶解、3%吐温
80 助溶，灭菌生理盐水稀释后使用;焦油紫(德国
Chroma － gesellschaft);SABC 试剂盒、DAB 试剂盒、
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)一抗、肿瘤坏死因子
(TNFα)一抗(武汉博士德公司);其余试剂为分析
纯。SPF级♂C57BL /6J小鼠(成都达硕生物科技有
限公司，合格证号:SCXK 川 2013 － 24)22 ～ 26 g，
9 ～ 11 周龄，于 25 ± 1 ℃、12 /12 h 昼夜交替条件下
饲养，自由摄食、饮水。
1． 2 方法与结果
1． 2． 1 小鼠的分组、造模与给药 将 24 只小鼠随
机均分为假手术组、模型组和 Lig 组。按文献的方
法［5］，采用双侧颈总动脉结扎法造模。ip 10 mL·
kg －1 3． 5%水合氯醛麻醉小鼠，将其仰卧固定在手
术台上，以体温维持仪使小鼠肛温维持在 37 ±
0． 5 ℃。暴露双侧颈总动脉鞘，剥离迷走神经，用动
脉夹夹闭 20 min 后松开动脉夹，并确保再灌成功，
60 s 内 ip 注射溶剂或 Lig，假手术组仅暴露双侧颈
总动脉不夹闭。分别于再灌后 0、24、48 h时 ip给予
Lig组小鼠 30 mg·kg －1 Lig，给药容积为 0． 02 mL·
g －1，ip给予假手术组和模型组小鼠等体积的溶剂。
1． 2． 2 藁本内酯对小鼠海马 CA1、CA2 区的神经元
计数的影响 再灌 72 h 后，ip 10 mL·kg －14%水合
氯醛麻醉小鼠，开胸暴露心脏，将灌注针头插入左心
室，剪开右心耳，每只小鼠依次灌注预冷生理盐水
30 mL和 4%多聚甲醛 20 mL，断头取脑，将其固定
于 4%多聚甲醛溶液中，行梯度乙醇脱水，常规石蜡
包埋，根据大脑定位图谱［6］，切片定位于大脑前囟
门 1． 94 ± 0． 2 mm处，厚度为 5 μm。将制好的大脑
切片常规脱水后，行焦油紫染色。由图 1 可见:假手
术组小鼠的海马 CA1 区锥形细胞形态正常、排列整
齐，而模型组的在此区域内神经元丢失，核深染、固
缩。通过计数法对海马 CA1 区神经元计数。与假
手术组相比，模型组小鼠的海马 CA1、CA2 区神经元
丢失严重(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01);与模型组相比，Lig
能显著减少 CA1、CA2 区神经元的丢失(P ＜ 0． 05)。
CA1
CA2
Sham Model Lig
CA2
CA1
Ce
ll
co
un
t
1.5
1.0
0.5
0
Sham Model Lig
A B
图 1 小鼠全脑缺血再灌 72 h后海马 CA1 和 CA2 区神经元的组织病理学改变(A，×400)及计数(B)
Figure 1 Histopathological changes(A，×400)and cell counts(B)of neuron in the hippocampus CA1 region and CA2 region at 72 hours after
global cerebral ischemia
1． 2． 3 藁本内酯对小鼠海马区 GFAP 与 TNFα 蛋
白的影响 将大脑石蜡切片常规脱水后，用 3%
H2O2 避光封闭 20 min 以去除内源性过氧化氢酶，
用蒸馏水漂洗 3 次、柠檬酸盐缓冲液(pH6)高温修
复抗原、PBS(pH7． 4 ～ 7． 6)漂洗 3 次、5% BSA 封闭
1 h、37 ℃孵育一抗 3． 5 h 后于 4 ℃过夜，用 PBS 漂
洗 4 次，于 37 ℃孵育二抗 1 h，用 PBS 漂洗 3 次，于
37 ℃孵育 SABC 1 h，用 PBS漂洗 3 次后，用 DAB显
色。用二甲苯透明、中性树胶封片后，保证光源一致
的前提下，在每组的每个样本的海马区随机选取 3
个区域，用Image － Pro Plus 6． 0 图像分析软件计算
其 IOD值。由图 2可见:GFAP是星形胶质细胞的标
志蛋白，免疫组化染色呈棕色星形发射状，激活的星
形胶质细胞分枝变粗。模型组的海马区较假手术组
的星形胶质细胞明显激活，TNFα 的数量明显增加
(P ＜0． 01);与模型组相比，Lig 能抑制星形胶质细胞
的激活而对抗缺血导致的神经炎性损伤(P ＜ 0. 01)。
同时，Lig还能抑制 TNFα的产生(P ＜0. 01)。
Sham Model Lig
GFAP
TNF琢
×103
IO
D
8
6
4
2
0
Sham Model Lig
GFAP
TNF琢
A
B
图 2 GFAP与 TNFα在海马区蛋白表达的免疫组化染色图(A，×400)及平均 OD值(B)
Figure 2 Immunohistochemical staining(A，400)and IOD(B)of the expression of GFAP and TNFα in hippocampus(×400)
1． 2． 4 统计学处理 采用 SPSS 21 软件进行分析。
数据以 珋x ± s 表示，统计分析用单因素方差分析
(one － way Anova)，以 P ＜ 0． 05 为差异具统计学
意义。
2 讨论
小鼠全脑缺血再灌注造模后，海马 CA1、CA2 区
的神经元丢失现象随时间的增加而更严重，72 h 时
642 华 西 药 学 杂 志 第 31 卷
华西药学杂志
W C J·P S 2016，31(3)∶247 ～ 250
达峰值，随后神经元数量开始恢复，故在再灌后 72 h
时处死小鼠取样。神经炎症因子的激活是导致神经
元损伤及丢失的重要因素，干预引起神经细胞死亡
的炎性相关蛋白是治疗脑缺血的方向之一［2］。脑
缺血后，作为大脑免疫细胞的星形胶质细胞数增多，
体积增大，分枝变粗。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)
是反应星形胶质细胞激活状态的标志物，文中藁本
内酯(Lig)组的 GFAP表达量较模型组的显著减少，
表明 Lig通过抑制星形胶质细胞活化来干预缺血导
致的神经炎症，减轻了大脑梗死。肿瘤坏死因子
(TNFα)为促炎因子，缺血再灌注几小时后，海马区
TNFα的表达量明显增加，进而上调细胞黏附分子，
破环血脑屏障，加重脑梗死［7］，说明 Lig 还通过抑制
TNFα的表达来保护神经。
参考文献:
［1］ Go AS，Mozaffarian D，Ｒoger VL，et al． Executive summary:Heart
disease and stroke statistics － 2013 update:A report from the
American heart association ［J］． Circulation，2013，127:143 －
152．
［2］ MD Ginsberg． Neuroprotection for ischemic stroke:Past，present
and future［J］． Neuropharmacology，2008，55:363 － 389．
［3］ Moskowitz MA，Lo EH，Iadecola C，et al． The science of stroke:
Mechanisms in search of treatments ［J］． Neuron，2010，67:
181 － 198．
［4］ Amantea D，Nappi G，Bernardi G． Post － ischemic brain damage:
Pathophysiology and role of inflammatory mediators［J］． FEBS J，
2009，276:13 － 26．
［5］ Kuang X，Du JＲ． Neuroproteetive role of Z － ligustilide against
forebrain ischemic injury in ICＲ mice［J］． Brain Ｒes，2006，1:
135 － 137．
［6］ Paxinos G，Franklin KBJ． The Mouse Brain in Stereotaxic Coordi-
nates［M］． Academic Press:San Diego，2001:96 － 98．
［7］ Huang J，Upadhyay UM，Tamargo ＲJ． Inflammation in stroke and
focal cerebral ischemia［J］． Surg Neurol，2006，66:232 － 245．
收稿日期:2015 － 02 － 28
作者简介:梁敏(1990—)，女，正攻读药物分析专业的硕士学位。Email:1169695887@ qq． com
* 通信作者(Correspondent author)，Email:dyelimin@ 126． com
LC － MS /MS 同时测定大鼠血浆中的托莫西汀与牛磺酸及其
药动学研究
梁 敏1，岳山岚1，薛金涛2，熊冬梅1，陈 聪1，刘 振1，叶利明1*
(1．四川大学华西药学院，四川 成都 610041;2．新乡医学院，河南 新乡 453003)
摘要:目的 采用 LC － MS /MS法同时测定大鼠血浆中的托莫西汀与牛磺酸，比较托莫西汀单独给药与托莫西汀联合牛磺酸
给药两种方式下托莫西汀的药动学参数。方法 色谱柱为 Inertsil ODS － 3(100 mm × 2． 1 mm，5 μm)，流动相为含 0． 2%甲酸
的甲醇 － 20 mmol·L －1乙酸铵的水溶液(80∶20)，流速 0． 3 mL·min －1;质谱采用电喷雾接口，正离子模式，多反应监测。结果
托莫西汀和牛磺酸的线性范围分别为 0. 935 ～ 935 ng·mL －1和 0． 564 ～ 112． 8 μg·mL －1(r2 ＞ 0． 99)，最低定量限分别为 0． 935
ng·mL －1、0． 564 μg·mL －1;方法的日内和日间精密度均 ＜ 5． 25%;稳定性试验证明牛磺酸和托莫西汀比较稳定。结论 所用
方法灵敏度高，选择性好，分析速度快，可用于同时测定血浆中托莫西汀与牛磺酸的含量;在牛磺酸辅助托莫西汀用于治疗注
意力缺陷障碍时，托莫西汀的药动学参数与单用托莫西汀时的相比无显著性差异。
关键词:托莫西汀;牛磺酸;HPLC － MS /MS;测定;药动学;血药浓度;注意力缺陷障碍
中图分类号:Ｒ917 文献标志码:A 文章编号:1006 － 0103(2016)03 － 0247 － 04
DOI:10． 13375 / j． cnki． wcjps． 2016． 03． 010
Simultaneous determination of Atomoxetine and Taurine in the rat plasma by LC －MS/MS
and its pharmacokinetics study
LIANG Min1，YUE Shanlan1，XUE Jintao2，XIONG Dongmei1，CHEN Cong1，LIU Zhen1，YE Liming1*
(1． West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu，Sichuan，610041 P． Ｒ． China;2． School of Pharmacy，Xinxiang
Medical University，Xinxiang，Henan，453003 P． Ｒ． China)
Abstract:OBJECTIVE To establish an LC － MS /MS method for simultaneous determination of Atomoxetine(Ato)and Taurine
(Tau)in the rat plasma，and to compare the pharmacokinetic differences between single dosed Ato and simultaneously dosed Ato and